高效液相色谱法测定人体血浆中吡喹酮及相对生物利用度

高效液相色谱法测定人体血浆中吡喹酮及相对生物利用度

王大果1,阳宇1,陈日来2,周彦彬3,田娟3,冉黎灵3,左英3,丁劲松3*

(1.暨南大学第二临床医学院深

圳市人民医院,广东,深圳518020;2.深圳市福田区梅林医院,广东深圳󰀁518020;3.中南大学药学院,长沙󰀁410013)

摘要:目的󰀁建立高效液相色谱法测定血浆中吡喹酮浓度。方法󰀁血浆样品沉淀后经NUCLEODUR100-5C18柱

分离,流动相为乙腈󰀁水󰀁四氢呋喃=51󰀁47󰀁2(v/v/v)。24名健康志愿者采用自身对照随机交叉试验设计,分别单剂量口服吡喹酮片参比制剂(R)或受试制剂(T)1󰀁2g后测定两者相对生物利用度。结果󰀁血浆中吡喹酮在25~3200󰀁g󰀁L-1线性良好,最低定量浓度为25󰀁g󰀁L-1;方法学回收率为104󰀁3%~119󰀁9%(n=15);精密度(RSD)实验结果表明日内、日间变异均<6󰀁9%(n=15)。与R相比,T的相对生物利用度为104󰀁0%󰀁24󰀁8%。结论󰀁该法简单,准确度高,灵敏度好;方差分析结果表明T与R的主要药动学参数之间无显著差异,2制剂生物等效。

关键词:高效液相色谱法;吡喹酮;相对生物利用度

中图分类号:R969󰀁1󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁󰀁文章编号:1672󰀁2981(2009)00󰀁0413󰀁03

DeterminationofpraziquantelinhumanplasmabyHPLCand

bioequivalenceofpraziquanteltablets

WANGDa󰀁guo1,YANGYu1,CHENRi󰀁lai2,ZHOUYan󰀁bin3,TIANJuan3,RANLi󰀁ling3,ZUOYing3,DINGJin󰀁song3(1.TheSecondMedicalCollegeofJinanUniversity,People󰀁sHospitalofShenzhen,ShenzhenGuangdong518020;2.MeilinHospitalofFutian,ShenzhenGuangdong518020;3.SchoolofPharmaceuticalSciences,Cen󰀁tralSouthUniversity,Changsha410013)Abstract:Objective󰀁

ToestablishanHPLCmethodforthedeterminationofpraziquantelinthetheplasmaandevaluate

thebioequivalenceofthe2praziquanteltablets.Methods󰀁PraziquantelwasseparatedonaNUCLEODUR100-5C18columnwithamixtureofacetonitrile󰀁H2O󰀁tetrahydrofuran(51󰀁47󰀁2,v/v/v)asthemobilephase,andtheinternalstandardwasdiazepam.Asingleoraldoseof1󰀁2gpraziquantelwasadministeredto24healthyvolunteersinarandom󰀁izedcrossoverstudy,andthepharmacokineticsandbioavailabilitywerestudied.Results󰀁Thecalibrationcurvewaslinearat25~3200󰀁g󰀁L-1,withr2=0󰀁9994,theabsoluterecoverywas99󰀁4%~115󰀁0%(n=20),andthemethodrecoverywas104󰀁3%~119󰀁9%(n=15).Inter󰀁dayRSDwas<2󰀁3%(n=15)andintra󰀁dayRSD<6󰀁9%(n=15).TherelativebioavailabilityoftabletTwas104󰀁0%󰀁24󰀁8%.Conclusion󰀁Theestablishedmethodisaccu󰀁rateandsensibleforthedeterminationofpraziquantelinhumanplasma.Thetwotabletsarebioequivalence.Keywords:highperformanceliquidchromatography;praziquantel;relativebioavailability󰀁󰀁吡喹酮(praziquantel)为吡嗪异喹啉衍生物,为广谱抗吸虫药和驱绦虫药[1],尤以对血吸虫有杀灭作用而受重视。吡喹酮具有疗效高、毒性低、副作用轻、疗程短、给药方便、适应症范围广等特点[2,3],是目前理想的治疗各种人体血吸虫病的有效药物[4,5],为抗吸虫病的首选药[6]。吡喹酮口服后经肝脏代谢,首过效应强,血浆浓度低,故需建立1种灵敏的血药浓度测定方法。目前已有文献报导

[7,8]

试验建立了以硫酸锌为沉淀剂,结合HPLC󰀁UV检测的方法,样品处理简单快速、灵敏度高,能满足临床药动学和生物利用度研究的需要。并用该方法研究2种吡喹酮片在人体内的相对生物利用度。1󰀁仪器与试药

󰀁󰀁岛津LC-2010AHPLC系统,配备SPA-10AVPUV/VIS检测器;LC-Solution工作站(日本岛津);TGL16M台式高速冷冻离心机(长沙英泰仪器有限公司);WH-2微量旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);赛多利斯BT224S

测定多

个生物样品中吡喹酮的HPLC󰀁UV法,但需要进行液液萃取的生物样品前处理[9,10],不利于批量样品的快速测定。本

󰀁󰀁作者简介:王大果,男,副主任药师,主要从事临床药学工作,Tel:(0755)25533018󰀁2963,E󰀁mail:wangdaguo168@163󰀁com󰀁󰀁

*通讯作者:丁劲松,男,副教授,主要从事药物新制剂及生物有效性评价工作,Tel:(0731)2650367,E󰀁mail:Dingjs0221@163󰀁com

413CentralSouthPharmacy.June2009,Vol󰀁7No󰀁6󰀁中南药学2009年6月第7卷第6期

万分之一天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

󰀁󰀁吡喹酮片参比制剂(R)(规格0󰀁2g󰀁片-1,南京制药厂有限公司,批号:20040508);吡喹酮片受试制剂(T)(规格:0󰀁2g󰀁片-1,四川珍珠制药有限公司,批号:030901);吡喹酮对照品(纯度:99󰀁7%,四川珍珠制药有限公司);地西泮原料(纯度:98󰀁2%,中南大学湘雅二医院制剂室);乙腈、四氢呋喃(色谱纯,美国Merckcompa󰀁ny);硫酸锌分析纯;水为超纯水;其他试剂均为国产分析纯。2󰀁方法2󰀁1󰀁色谱条件

色谱柱:NUCLEODUR100-5C18柱(250mm󰀁4󰀁6mm,5󰀁m);柱温:40󰀁;流动相:乙腈󰀁水󰀁四氢呋喃=51󰀁47󰀁2(v/v/v);流速:1󰀁0mL󰀁min-1;波长:220nm,进样量:50󰀁L。2󰀁2󰀁储备液的配制

吡喹酮:精密称取吡喹酮对照品适量,用甲醇制成浓度为1󰀁0mg󰀁L-1的储备液,置4󰀁冰箱中保存备用,使用时用水稀释至所需浓度。内标:精密称取地西泮原料适量,用甲醇溶解为100ng󰀁mL-1的溶液,置于4󰀁冰箱中保存。2󰀁3󰀁血浆样品的预处理

精密吸取血浆250󰀁L,置1󰀁5mL具塞尖底离心管中,加入0󰀁2moL󰀁L-1氢氧化钠溶液和100󰀁g󰀁L-1内标溶液各50󰀁L,混匀,加入0󰀁5mol󰀁L上清液50󰀁L进样。2󰀁4󰀁给药与血样采集

试验经中南大学药学院伦理委员会批准,24名男性健康志愿者,年龄(22󰀁6󰀁0󰀁8)岁,体重(󰀁5󰀁5󰀁5)kg,在签署知情同意书和体检合格后纳入试验,志愿者随机等分为2组,禁食过夜(至少12h),第2d清晨空腹口服参比制剂或受试制剂1󰀁2g,以200mL温开水送服,于服药前和服药后0󰀁25、0󰀁5、0󰀁75、1󰀁0、1󰀁5、2󰀁0、3󰀁0、4󰀁0、6󰀁0、8󰀁0、12󰀁0h抽取静脉血各5mL。1周后交叉服药,同时间点采血,血样经离心分离血浆于-20󰀁保存至测定。2󰀁5󰀁参数的求算与统计学处理

受试者的Cmax、tmax由血药数据直接读取。AUC0~t以梯形面积法计算,消除速率常数K以血药浓度󰀁时间曲线尾部数据回归计算。药物动力学参数AUC0~t和Cmax,经对数转换后进行药物间、周期间、个体间的3个因素方差分析,再以双单侧t检验进行生物等效性判断,tmax采用原值进行非参数检验。3󰀁结果3󰀁1󰀁色谱图

在本研究色谱条件下,内源性杂质不干扰吡喹酮与内标的测定,吡喹酮保留时间为6󰀁1min,内标保留时间为8󰀁3min(见图1)。3󰀁2󰀁线性范围和定量限

精密吸取空白血浆900󰀁L,置1󰀁5mL具塞尖底塑料离心管中,加入吡喹酮储备液100󰀁L,漩涡振荡混匀,稀释

-1

硫酸锌溶液100󰀁L,涡

-1

图1󰀁吡喹酮对照品及内标(A,200󰀁g󰀁L-1)、空白血浆(B)、志愿者空白血浆中加入吡喹酮及内标(C,400󰀁g󰀁L-1)、志愿者服药1h后血浆中吡喹酮(D,536󰀁g󰀁L-1)色谱图

Fig1󰀁Chromatogramofstandardpraziquantelandinternalstandard(A,200󰀁g󰀁L-1),blankplasma(B),spikedwithstandardpraz󰀁iquantelandinternalstandardinhumanplasma(C,400󰀁g󰀁L-1),andvolunteerplasmaafterasingledoseof1󰀁2gpraziquantel(D,536󰀁g󰀁L-1)

1.吡喹酮(praziquantel);2.内标(internalstandard)

旋1min,静置15min后,10000r󰀁min离心10min,取

成25、50、100、200、400、800、1600、3200󰀁g󰀁L-1的系列血浆样品,按󰀁2󰀁3󰀁项下操作并测定。记录色谱图,以吡喹酮与内标的峰面积比(Y)与血药浓度(X)进行线性回归。得回归方程为:Y=1037X+15󰀁59(r2=0󰀁9994),血浆中吡喹酮在25~3200󰀁g󰀁L-1与峰面积线性良好,最低定量浓度为25󰀁g󰀁L-1。3󰀁3󰀁绝对回收率

用空白血浆配制含吡喹酮为1600、400、100、25󰀁g󰀁L-1的血浆各5份,另用甲醇配制含吡喹酮为1600、400、100、25󰀁g󰀁L-1的溶液各5份,按󰀁2󰀁3󰀁项下平行操作,进样50󰀁L;记录吡喹酮与内标的色谱峰面积。以血浆样品的峰面积除以同浓度甲醇溶液的峰面积计算吡喹酮与内标绝对回收率。结果内标的绝对回收率99󰀁6%~101󰀁8%(n=20),吡喹酮的绝对回收率99󰀁7%~105󰀁4%(n=20)。3󰀁4󰀁精密度与方法回收率

配制浓度为1600、400、100、25󰀁g󰀁L-1的吡喹酮人血浆样品各5份,按󰀁2󰀁3󰀁项下平行操作,得日内相对标准偏差、方法回收率;连续测定3d,得日间相对标准偏差。结果高、中、低浓度的日内RSD为1󰀁7~2󰀁3%(n=20);

414中南药学2009年6月第7卷第6期󰀁CentralSouthPharmacy.June2009,Vol󰀁7No󰀁6

日间RSD为3󰀁7~6󰀁9%(n=20);方法回收率在104󰀁3%~119󰀁9%(n=20)。

3󰀁5󰀁稳定性实验

配制浓度为1600、400、100󰀁g󰀁L-1的吡喹酮人血浆样品。在室温下放置12h,冻存30d,或2次冻融后再分别测定其浓度,考察其稳定性。结果表明,吡喹酮在上述条件下均较稳定(浓度变化的RSD在2󰀁3%~9󰀁5%)(n=5)。3󰀁6󰀁相对生物利用度

志愿者单次口服1󰀁2g吡喹酮片后血浆中吡喹酮的平均浓度󰀁时间曲线见图2,T与R的药动学参数见表1。

方差分析表明,T与R经对数转换后的Cmax、AUC0~12、AUC0~󰀁之间无显著性差异,非参数检验未发现2制剂的tmax之间有显著性差异,双单侧t检验结果表明2制剂为生物等效性制剂。90%置信区间统计分析表明:T制剂AUC0~12的90%置信区间在R的93󰀁7%~109󰀁9%,Cmax在R的87󰀁8%~112󰀁2%。

表1󰀁24例男性志愿者口服吡喹酮片R或T1󰀁2g后的平均主要药动学参数(x󰀁s,n=24)

Tab1󰀁Meanpharmacokineticparametersofpraziquantelafterasingleoraldoseof1󰀁2TorR(x󰀁s,n=24)

参数(parameter)AUC0~12/󰀁g󰀁h󰀁L-1AUC0~

󰀁

受试制剂(test)3192󰀁7󰀁1787󰀁43463󰀁6󰀁1803󰀁2967󰀁8󰀁493󰀁01󰀁6󰀁0󰀁33󰀁8󰀁1󰀁6

104󰀁0󰀁24󰀁8

-1

参比制剂(reference)2931󰀁3󰀁1678󰀁63256󰀁5󰀁17󰀁7942󰀁6󰀁476󰀁61󰀁7󰀁0󰀁33󰀁5󰀁2󰀁0

/󰀁g󰀁h󰀁Ltmax/ht1/2/hF/%

Cmax/󰀁g󰀁L-1

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[4][5][6]

图2󰀁24例男性健康志愿者单剂量口服吡喹酮片R或T1󰀁2g后平均血药浓度󰀁时间曲线

Fig2󰀁Meanconcentration󰀁timecurveofpraziquantelin24malevol󰀁unteersafterasingleoraldoseof1󰀁2gTorR

T󰀁受试制剂(testformulation)R󰀁参比制剂(referenceformulation)

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(收稿日期:2009󰀁02󰀁18;修回日期:2009󰀁05󰀁08)

4󰀁讨论

本方法以硫酸锌为沉淀剂,与碱化后的血浆蛋白质分子中带负电荷的羧基形成不溶性盐而去除蛋白质,使内源性杂质不干扰药物与内标的分离测定,且处理过程较文献[2,3]所采用方法简单,适合批量样品的快速处理测定。本文研究的2种吡喹酮片在人体内具有生物等效性。

2种丙戊酸钠片剂在人体内的相对生物利用度研究

孙志宏1,阳国平2,裴奇2,黄志军2,刘畅2,阳丽2,金承怀2,谭鸿毅2*

神经脑外科,湖南株洲󰀁412200;2.中南大学湘雅三医院临床药理中心,长沙󰀁410013)

(1.湖南师范大学附属湘东医院

摘要:目的󰀁研究丙戊酸钠片的相对生物利用度。方法󰀁采用随机、开放、双周期交叉试验设计。20名健康志愿者分别单剂量口服0󰀁4g丙戊酸钠片(参比制剂)或丙戊酸钠片(受试制剂)。采用HPLC法测定给药后不同时间󰀁󰀁作者简介:孙志宏,男,主要从事颅脑损伤临床外科工作,E󰀁mail:Szh_lyn@yahoo󰀁com󰀁cn。󰀁󰀁*通讯作者:谭鸿毅,男,主要从

事药物分析工作,Tel:(0731)8618327,E󰀁mail:thy19810718@yahoo󰀁com󰀁cn。

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