黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠足细胞的影响及其机制研究

罗蕴龄;陈宜方;何东元;陈建国

【摘 要】Objective To investigate the protect effects of astragaloside IV(AS- IV) on diabetic nephropathy rat podocytes and explore its mechanism. Methods Healthy male Sprague- Dawley (SD) rats of

180~200g were randomly divided into normal control group(NC), diabetic nephropathy group(DN) and diabetic nephropathy with AS- IV treatment group(DN+AS- IV). DN was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin. AS- IV treatment was started 2 weeks before STZ injection and lasted 14 weeks. 24 hour urine were col ected and 24 hour urinary protein were measured at the end of the 6th,12th week after STZ injec-tion. At the end of 6th and 12th week after STZ injection, rats were sacrificed and the blood samples were col ected for measuring biochemical parameters. The kidneys were harvested for histopathology, immunohistochemistry, electron microscopy and West-ern blot examinations, and the renal pathology, morphological changes of podocytes, podocyte density changes and expression ofα3β1 integrin protein were analyzed. Results In STZ- induced DN rats severe

hyperglycemia and proteinuria were devel-oped. Mesangial expansion, increased podocyte loss and decreased integrin α3 and β1 expression were detected in DN rats. Treatment with AS- IV10mg/ (kg·d) for 14 weeks ameliorated proteinuria and podocyte foot process effacement, attenuated the loss of podocytes in glomerules and up- regulated the expression of

integrinα3 andβ1 in podocytes. Conclusion AS- IV may protect podocyte and ameliorate diabetic nephropathy by restoring the expression ofα3β1 integrin in diabetic rats.%目的：探讨黄芪甲苷（AS- IV）对糖尿病肾病（DN）大鼠足细胞的保护作用及其机制，为DN早期防治开辟一条新途径。方法体重180~200g健康雄性SD大鼠45只按配伍法分为正常对照组（NC组）、DN组和AS- IV治疗组（DN+AS- IV组），链脲佐菌素腹腔注射建立大鼠早期DN模型。DN+AS- IV组大鼠在造模前2周予AS- IV 10mg/（kg·d）灌胃预处理至实验结束，共14周。造模后第6、12周末收集并测定24h尿量及尿蛋白；同时各组按抽签法选取5只大鼠测体重，处死大鼠后测血生化指标，取肾组织，光镜观察肾脏病理病理变化，电镜观察足细胞形态变化，肾母细胞瘤抑制基因1（WT1）免疫组织化学染色观察肾小球足细胞密度变化，Western blot法测定大鼠肾皮质α3β1整合素蛋白水平的变化。结果与NC组相比，DN组大鼠血糖和24h尿蛋白增高，肾脏肾小球系膜区增生，足细胞足突融合，肾小球足细胞数量减少，α3β1整合素蛋白水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。AS- IV可显著改善DN大鼠蛋白尿，抑制肾小球系膜区增生，抑制足细胞足突融合和数目减少，上调α3β1整合素表达。结论 AS- IV对早期DN大鼠足细胞具有保护作用，可能与其上调足细胞α3β1整合素表达相关。 【期刊名称】《浙江医学》 【年(卷),期】2014(000)007 【总页数】5页(P545-549)

【关键词】黄芪甲苷;糖尿病肾病;足细胞;α3β1整合素 【作 者】罗蕴龄;陈宜方;何东元;陈建国

【作者单位】325000 温州医科大学附属第一医院肾内科;浙江医院肾内科;浙江医院肾内科;温州医科大学 【正文语种】中 文

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是全球范围内危害人类健康的重要疾病之一，其流行趋势日益严峻。在欧美等发达国家，糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是导致CKD的首位疾病。我国成年人CKD患病率为10.8%[1]，随着社会老龄化程度的加重、生活水平的改善，在北京、上海等大城市及经济水平较发达的农村地区，DN已逐步超越慢性肾小球肾炎成为导致CKD的首要病因[1]。有研究显示，足细胞损伤在DN的发生、发展中起重要作用[2]。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成成分，通过α3β1整合素与基底膜连接[3]。足细胞损伤后可出现足细胞足突融合，足细胞从基底膜脱落、凋亡甚至死亡。足细胞功能障碍或数量减少可直接导致蛋白尿的发生。但目前尚无针对足细胞脱落的特异性药物，主要为对症治疗。黄芪益气健脾，利水消肿，是临床治疗DN的常用中药之一，但其治疗机制不明。黄芪甲苷（AS-IV）为黄芪主要活性成分之一，前期研究显示：AS-IV可改善高糖刺激下足细胞黏附功能紊乱，其改善作用部分归因于α3β1整合素的上调[4]。但上述研究对象为体外培养足细胞，现进一步探讨AS-IV对活体DN早期大鼠足细胞是否同样具有上述保护作用，为其应用于临床早期防治DN提供可能。

1.1 材料 体重180~200g健康雄性SD大鼠45只（购自上海复旦大学动物实验中心），均饲养于SPF级动物实验室，标准饲料，自由饮水。按配伍分组法分为正常对照组（NC组）、糖尿病肾病组（DN组）和AS-IV治疗组（DN+AS-IV组），各15只。

1.2 方法 按65mg/kg体重一次性腹腔注射溶于pH 4.2、0.1mol/L柠檬酸冲液中

的链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司）建立糖尿病模型。STZ注射72h后空腹血糖＞16.67mmol/L且于2周后尿白蛋白/肌酐比值＞30μg/mg者认为DN造模成功。AS-IV用1%羧甲基纤维素（CMC）配置。DN+AS-IV组在造模前2周予ASIV 10mg/（kg·d）灌胃预处理直至实验结束，共14周。NC组及DN组给予等量1%CMC混悬液。

1.3 一般生化项目检查 在DN造模成功后6、12周末代谢笼中收集各组大鼠的24h尿标本，计算尿量，检测尿蛋白。分别于第6、12周末采用抽签法选取5只大鼠测量体重，水合氯醛麻醉后心脏取血，血糖仪（罗氏公司）检测血糖，自动生化分析仪（美国Technicon公司）检测血肌酐、血尿素氮、血谷丙转氨酶/谷草转氨酶。

1.4 光镜及电镜病理检查 摘除双侧肾脏，多余组织液氮速冻后置于-80℃保存。 1.4.1 光镜检查 肾组织中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，分别行HE、PAS、PASM及Masson染色，光镜下观察肾组织形态学变化。

1.4.2 电镜检查 肾皮质组织切成1mm×1mm×1mm，用2%戊二醛固定，常规透射电镜制样，超薄切片。观察足细胞形态结构的改变。

1.5 大鼠肾小球肾母细胞瘤抑制基因1（WT1）表达 采用免疫组化检测。WT1小鼠抗大鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，GTVision III抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒购自丹麦Dako公司。按试剂盒说明书操作。每个样本随机选取3个不同区域进行拍照，Image pro plus 6.0专业图像分析软件计算测量图片中肾小球总面积及其内WT1阳性细胞所占面积，计算各肾小球WT1阳性细胞所占面积比，计算足细胞密度，取其平均值记录。

1.6 肾脏α3β1整合素的表达 采用Western blot法检测。细胞及组织总蛋白抽提试剂盒（KangChen KC-415）提取肾脏组织蛋白。BCA蛋白质定量试剂盒（KangChen KC-430）检测组织蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离，100V电

转移至纤维素膜。5%脱脂牛奶室温内封闭60min，加一抗（购自美国Santa Gruz，稀释比例1∶1 000）于4℃过夜，加辣根过氧化物酶标记的二抗（上海康成生物工程公司，稀释比例1∶5 000）室温孵育60min，KCTM化学发光试剂盒（KangChenKC-420）显影，在X线片上曝光显影、定影、冲洗凉干，Bio-Rad2000凝胶成像系统扫描蛋白条带的光密度，Image J软件进行吸光度分析，每个实验组重复3次，计算统计量。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析。

2.1 3组大鼠一般生化指标结果的比较 STZ注射后第12周末，DN组、DN+AS-IV组大鼠体重较NC组明显减轻，血糖、尿量及尿素氮均明显升高（均P＜0.05）。DN组体重、血糖、尿素氮、肌酐及谷丙/谷草转氨酶与DN+AS-IV组的差异均无统计学意义（均P＞0.05），表明AS-IV对大鼠肝肾功能无不良反应，详见表1。

2.2 3组大鼠24h尿蛋白水平的比较 STZ注射后第6周末DN组大鼠24h尿蛋白水平[（1 630±325）mg/24h]较NC组大鼠[（320±41）mg/24h]显著升高，STZ注射后第12周末24h尿蛋白水平进一步上升为（2 455±794）mg/ 24h。STZ注射后第6周末DN+AS-IV组大鼠24h蛋白尿水平为（1 053±257）mg/24h，明显低于DN组，第12周末为（1 104±498）mg/24h，下降趋势更为明显，详见图1。

2.3 肾组织光镜及电镜检查结果 DN肾组织的光镜下病理改变主要为肾小球系膜增生，系膜区宽度超过毛细血管直径，系膜区内系膜细胞超过2个。STZ注射后第6周末（图2，见插页）及第12周末（图3，见插页），光镜可见DN大鼠肾小球轻度系膜细胞增生，部分毛细血管管腔压迫，肾小管水肿；DN+AS-IV组该病理改变得到显著改善，系膜区系膜细胞不超过3个，毛细血管腔开放良好。第12周

末电镜可见DN组大鼠肾小球足细胞足突广泛融合消失，DN+AS-IV组抑制足细胞足突融合改善（图4）。

2.4 大鼠肾小球WT1表达 STZ注射后第12周末，DN组足细胞密度较NC组明显下降，DN+AS-IV组较DN组升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见图5、6。

2.5 肾脏α3β1整合素的表达 与NC组比较，STZ注射第6周和第12周DN组α3β1整合素表达水平显著下降，AS-IV治疗可抑制α3β1整合素表达水平的降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见图7、8。

DN是糖尿病常见的微血管并发症之一，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一[5]。在美国及其他许多发达国家，DN是导致终末期肾脏病的首要病因[6-7]。DN早期表现为微量蛋白尿（＞300mg/24h），晚期有肾小球滤过率的下降、动脉血压的升高以及相关的心血管并发症[8]。其肾脏的病理改变主要表现为：肾小球基底膜增厚，系膜基质增多，系膜区扩张以及肾间质增生。本研究中成功造模DN大鼠模型，发现造模后第6周末DN组大鼠24h尿蛋白较NC组大鼠显著升高，造模后第12周末24h尿蛋白量进一步上升。DN+AS-IV组大鼠24h蛋白尿水平在STZ注射后第6周末即较DN组下降,第12周末该下降趋势更为明显。光镜病理显示，STZ注射后第6周末及第12周末，DN大鼠肾小球轻度系膜细胞增生，部分毛细血管管腔压迫，肾小管水肿。而DN+ASIV组该病理改变得到显著改善，系膜区系膜细胞不超过3个，毛细血管腔开放良好，说明AS-IV可部分改善DN的肾脏病理改变。

在大部分蛋白尿的疾病中，足细胞损伤和（或）足细胞数量的减少在蛋白尿的发生、发展中扮演重要角色[9]。足细胞损伤表现为足突融合、消失。随着疾病的进展，足细胞损伤进一步加重，导致足细胞数目较少[10]。足细胞为终末分化细胞，几乎没有增殖能力，足细胞脱落将导致不可逆的足细胞丢失。研究显示，糖尿病患者血

糖升高1个月后即有足细胞从肾小球基底膜脱落[11]，并可见足细胞数目和（或）密度的减少[12]。WT1为一种与泌尿生殖系统发育密切相关的基因，在肾脏发育的各个阶段均有表达，出生后仅在足细胞核内表达，对足细胞功能的维持起重要作用，是成熟足细胞的特异性标志之一。本实验中，应用免疫组化技术检测WT1在足细胞中表达情况，反映足细胞数目的改变，以便于观测足细胞数目变化，并提高检测足细胞数目的准确性。本实验中，造模后第12周末电镜下可观测到DN大鼠足细胞足突融合、消失，WT1染色提示足细胞密度较正常组明显减少，经AS-IV治疗，足细胞足突融合现象改善，丢失显著减少，差异均有统计学意义。 多项研究显示，黏附分子α3β1整合素水平的改变导致的足细胞与GBM之间黏附功能的改变是足细胞脱落的重要原因[13-15]，α3β1整合素是足细胞上唯一的β类整合素，参与维持足细胞的正常形态及GBM的通透性，对足细胞与GBM的结合起着关键性作用。α整合素基因敲除小鼠出生时即出现GBM发育不成熟、足突消失及大量蛋白尿[16]。β整合素特异性抗体或β整合素阻断剂均可诱导足突融合、足突与GBM分离及蛋白尿的发生[17]。DN早期患者及STZ诱导的糖尿病大鼠足细胞α3β1整合素的表达明显降低[18]。本实验中，STZ诱导的DN大鼠α3β1整合素表达明显降低，而DN+AS-IV组α3β1整合素表达和足细胞密度较DN组显著升高。结合24h尿蛋白及病理结果，提示AS-IV可能通过上调α3β1整合素表达，减少足细胞从GBM脱落，从而延缓蛋白尿的发生、发展。同时，血生化检测显示AS-IV对大鼠的血糖、血尿素氮、血肌酐及谷丙转氨酶、谷草转氨酶无明显影响，提示AS-IV在保护足细胞的同时对大鼠肝肾功能无明显不良反应，为安全、有效的药物，且其保护作用与血糖水平无相关。

综上所述，AS-IV可以增强足细胞与GBM黏附的能力，改善足细胞足突融合及蛋白尿，机制可能与其上调α3β1整合素表达水平有关，为应用于DN早期防治提

供可能。

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