微生物法检测乳中抗生素残留及假阳性产生的原因_李延华

微生物法检测乳中抗生素残留及假阳性产生的原因

李延华󰀁张兰威󰀁王伟君

(东北农业大学食品学院,哈尔滨,150030)

摘󰀁要󰀁介绍了乳中抗生素残留检测的常用微生物法:氯化三苯四氮唑法、纸片法、活性试验法、试剂盒方法,并从乳本身因素、外来因素2个角度分析实际检测过程中引起假阳性结果的原因,为乳中抗生素检测提供理论参考。关键词󰀁

抗生素,微生物检测,假阳性

󰀁󰀁原料乳中残留抗生素影响乳制品加工,降低食品安全,危害人体健康[1~3],同时也影响乳制品的进出口贸易。我国原料乳及乳制品中抗生素残留严重,对乳中抗生素的检测是我国乳品加工中至为关注的问题。

目前,乳中抗生素残留的检测方法大致分三类:生物测定法(微生物测定法、放射受体测定法)、免疫法(放射免疫法、荧光免疫法、酶联免疫法)、理化分析法(波谱法、色谱及联用技术)[4~6]。不同方法各有优缺点,而对于原料乳供销者来说,知道是否有抗生素残留即可做出是否出售或收购及如何处理的判断,所以传统上微生物受阻法(MIT)一直应用于大批乳样检测。

但由于乳组分的多样性、抗生素在动物体内代谢的复杂性,以及检测方法的特异性等原因,微生物检测法经常出现假阳性和假阴性结果,尤其是假阳性结果[1]。本文叙述了当前常用的几种微生物检测法,对实际检测过程中常出现的假阳性现象进行分析,为乳中抗生素的检测提供理论参考。

是有一定特异性,如:Bacilluscereus对四环素类敏感,Basillussubtilis对氨基糖苷类敏感,Kocuriavar󰀁ians对大环内酯类,Bacillusstearothermophilus对磺胺类和󰀁󰀁内酰胺类敏感的方法。

[7]

,是目前抗生素检测最常用

2󰀁乳中抗生素常用微生物检测法介绍

国内外当前检测乳中抗生素最常使用微生物方法,不同微生物检测法所用的微生物种类不同,反应的灵敏度、特异性、检测限也不同。自1950年代,微生物方法广泛使用并不断优化,还开发出方便简单的试剂盒。

2󰀁1󰀁氯化三苯四氮唑法

1955年提出氯化三苯四氮唑法,是日本1950年代检测牛乳中青霉素残留的法定方法,我国1955年4月1日生效为法定标准,目前我国的食品标准GB/T47󰀁27󰀁2003中还规定采用该法。

原理:当乳中加入嗜热链球菌以后,如果乳中无抗生素,嗜热链球菌就生长繁殖,在新陈代谢中进行生物氧化,其脱出的氢可以和加在乳中的氧化型TTC结合成为还原型TTC,氧化型TTC是无色的,还原型TTC是红色,所以可使乳变红色。相反,如果乳中存在抗生素,嗜热链球菌就不能生长繁殖,没有氢释放,TTC不被还原,仍为无色,乳汁也无色,检测时间3󰀁5~4h。

特点:设备简单、费用低,但灵敏度低、易假阳性,在检测青霉素和氯霉素上敏感度与枯草杆菌纸片法大致相等,但对链霉素不太敏感,对新霉素根本不敏感,消毒剂可干扰试验。我国目前广泛使用此方法。2󰀁2󰀁管碟法

1944年由Foster和Woodruff创建,用含有敏感菌的琼脂做成平皿,上放小管(现在常用牛津杯),管中放已知抗生素标准液和未知试样液,经培养后,抗

2005年第31卷第8期(总第212期)[8]

1󰀁微生物检测法原理及应用特点

微生物检测法(MIT)根据抗生素对微生物的生理机能及代谢的抑制作用来定性或定量确定样品中的抗微生物药物残留。通常在被检测乳样中培养对抗生素敏感的微生物,如果样品中没有抗生素存在,由于微生物的生长可以观察到培养基变混浊、不透明或由于微生物产酸导致指示剂颜色变化;如果有抗生素或其他抑菌物质存在则会观察到培养基上有抑菌圈形成或培养基仍旧透明,或没有颜色变化。

这类检测方法可靠性高、操作简单、费用低,经过若干小时的培养过程方能观察到结果,另一显著特点

第一作者:硕士研究生。

收稿日期:2005-04-27,改回日期:2005-07-08

󰀁93食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES

生素标准液周围琼脂不长细菌,即为抑菌圈,如试样液周围也出现抑菌圈表示含有抗生素,当时所用菌种为枯草杆菌。同年由Schmich和Moyer用金黄色葡萄球菌代替,并发现抑菌圈大小与琼脂厚度成反比。1954年,MeeWes和Mlosevic又发现,青霉素产生的抑菌圈随着培养时间的延长而增大,随着琼脂的增厚而减小,不含有青霉素的原料乳有时也能抑制金黄色葡萄球菌,故改进为采用藤黄八迭球菌(Sarcinalntea)来检测青霉素。1958年,美国FDA将藤黄八迭球菌管碟法作为法定方法,检测青霉素的敏感度0󰀁01U/mL[9],由于该法的检测时间长达10余小时,目前只有藤黄八迭球菌略有应用。2󰀁3发酵剂活性试验

取10mL乳样放入烧杯中进行巴氏杀菌,再冷却至42󰀁5󰀁,加入酸乳发酵剂,经搅拌后,立即测定其酸度和pH值,此时开始记录,于42󰀁5󰀁培养,每0󰀁5h测pH值,共测定3h,同时需做对照,根据对照和样品中发酵剂的活性来确定,低活性表明发酵剂活性弱或乳中含有抑菌物。2󰀁4󰀁纸片法

纸片法常用枯草杆菌和嗜热脂肪杆菌为指示菌,这2种菌主要检测乳中󰀁󰀁内酰胺类抗生素,操作过程大体相同,只是选用菌种不同。

检测步骤:1948年提出枯草芽孢杆菌纸片法,采用3mL定量枯草芽孢杆菌接种琼脂,滤纸片直径为7mm,把接种琼脂量为10mL,每mL含芽孢2󰀁5󰀁106个,能检出牛乳中青霉素量5U/mL;1953年Gogas和Bichenl利用美国Difco青霉素试验琼脂,并把滤纸片直径增加到13mm;1956年Johns和Berizins发现新鲜配制平皿只需2h就能检出抑菌圈,而冷藏平皿需要5h才能检出抑菌圈;19年Palmer证明消毒剂对此法无干扰。

1960年Lgarashi提出酪蛋白󰀁酵母浸膏󰀁葡萄糖琼脂、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearother󰀁mophilus),13mm直径滤纸片和65󰀁培养2󰀁5h,检出牛乳中青霉素量0󰀁005U/mL。1970年,国际乳品联合会制定嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法:利用Difco抗生素4号培养基接种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢,把接种培养基6mL倒入(15󰀁150)mL的培养皿中(平皿需于7d内使用,纸片直径12󰀁7mm浸渍乳样,放于琼脂上,把平皿于󰀁培养2󰀁5h或者55󰀁4h,培养结束,用毫米游标卡尺测量抑菌圈直径,阳性结果以>14mm为准,能检出牛乳中青霉素含量󰀁94

2005Vol󰀁31No󰀁8(Total212)[10,11]

0󰀁005U/mL,本法可根据抑菌圈直径定量测定。

特点:枯草杆菌纸片法检测的结果易出现假阳性,为了确定阳性物质是否为青霉素(或󰀁󰀁内酰胺类)引起的,对加热后的乳样用青霉素酶处理,以灭活乳样中的青霉素,然后再行检测,检测限可达0󰀁01IU/mL;嗜热脂肪杆菌脂肪纸片法不仅用于检测乳中󰀁󰀁内酰胺类抗生素,并能暗示是否存在其他抑菌物质,如磺胺类、四环素类等,检测限可达0󰀁008U/mL以下[11],根据抑菌圈直径可以定量检测,一般在4h内即可获得结果。1981年由FDA认可,1982年1月1日生效为法定方法,AOAC纸片法也属于此类[11,12]。目前嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法普遍应用。2󰀁5󰀁试剂盒法

Delvotest󰀁P,Delvotest󰀁SP,DelvotestCowTest,Delvotest󰀁MCS检测系列由荷兰Gist󰀁brocadesBV公司开发,通过AOAC认证,目前已经在全世界通用。以嗜热脂肪芽孢杆菌为指示菌,该菌对多种抗生素敏感,对青霉素类和头孢菌类尤为敏感。美国的CharmScience股份有限公司也推出类似的系列检测方法,charmAIM󰀁96检测试剂盒是一种与Delvotest󰀁sP微孔板格式相似的检测技术,一次可同时检测96乳样,能检测󰀁󰀁内酰胺类、磺胺类、四环素类、大环内脂类、氨基糖苷类等抗生素,培养时间一般为3~4h。原理[13]:培养基和被检乳样中可能存在的抗生素小分子物质同时向基质扩散,而乳中干扰指示菌芽孢繁殖的大分子物质被阻挡在琼脂基的表层。若有检出线以上浓度的抗生素存在,指示菌芽孢的生长繁殖就会被抑制,基质保持原有色泽(紫色),阳性;若无抗生素或抗生素含量极低,则芽孢复苏繁殖时分解培养基中的碳水化合物产酸,使指示剂变色(黄色),抗生素阴性。

当前,试剂盒法是最为理想的微生物检测方法,但产品的价格对中等发达国家来讲相对较高,TTC法及纸片法在我国应用较多,活性试验在小规模工厂经常使用。这些微生物检测法方便、经济,不同程度的应用于原料乳及乳制品中抗生素检测,但由于乳本身因素和外部因素,常出现假阳性检测结果,降低了检测的准确性。

3󰀁引起检测结果假阳性的原因分析

国内对乳中抗生素假阳性结果分析较少,而国外对检测结果假阴性和假阳性非常重视。

乳中体细胞、乳过氧化氢酶、乳铁蛋白、溶菌酶、

分析与检测

内毒素、游离脂肪酸、防腐剂等乳本身因素和检测前是否热处理、泌乳期、大肠杆菌量、消毒剂以及检测者的经验都不同程度的使检测结果呈假阳性。3󰀁1󰀁乳本身因素3󰀁1󰀁1󰀁体细胞含量

研究表明:体细胞最易引起乳中抗生素检测呈假阳性。1993年VanEenennaam曾采用CITE

RR

probe(󰀁󰀁lactam)、Delvotest󰀁P󰀁、CharmFarm󰀁、LacTek(󰀁󰀁lactam)及Bacillusstearothermophilus纸片法测定乳中的󰀁󰀁内酰胺类抗生素,结果表明:假阳性的比例分别是43󰀁6%、37󰀁7%、81󰀁7%、2󰀁6%和18󰀁8%,主要原因是检测的乳中含有高浓度的体细胞。Angelidis研究表明:当SCC>10个/mL时,SCC含量与假阳性呈线形关系(r=0󰀁61,P<0󰀁01)。Okada研究表明:SCC浓度低的情况下,有10󰀁2%的假阳性率;而当SCC浓度>3󰀁106个/mL时,假阳性率增加到19󰀁7%。3󰀁1󰀁2󰀁乳中的󰀁天然抗生素󰀁

乳样本身含有的抑菌物质乳过氧化氢酶、

[12,18,19][18]

乳铁蛋白、溶菌酶都会导致检测结果假阳性。

研究表明,不同泌乳期分泌的乳检测假阳性率不同,这主要与不同泌乳期乳中乳过氧化氢酶含量有关[20],尤其在羊乳的泌乳后期最易产生假阳性检测[18]。

Carlsson通过实验证明[21],Delvotest󰀁P的假阳性率上升同动物体内的自然抗生素的浓度呈线形关系,这些自然抗生素主要是乳铁蛋白和溶菌酶。Aposto󰀁los[22]在研究Delvo󰀁X󰀁Press对󰀁󰀁内酰胺的测定时发现,当乳样中的乳铁蛋白>1mg/mL时可导致假阳性。

可见,在乳中抗生素检测时,乳中存在的生理性活性物质发挥抑菌作用,抑制指示菌的生长繁殖,是造成乳中抗生素检测假阳性的又一因素。3󰀁1󰀁3󰀁游离脂肪酸

乳中存有部分游离脂肪酸,不同浓度的自由脂肪酸对指示菌有一定的抑制作用。Carlsson经气相色谱证实Arlamicrotest、ValioT101、DelvotestSP和CharmII4种检测方法,当自由脂肪酸浓度达到4~5mmol/L时,Arlamicrotest和ValioT101对四环素和大环内酯抗生素的测定可能出现假阳性,而DelvotestSP和CharmII则不会。3󰀁1󰀁4󰀁乳中含有杂菌作用

[19]

[16~18]

[15]

6

R󰀁[14]

R󰀁

R

1997年,Andrew应用Delvotest󰀁P󰀁,CharmRR

Cowside,CharmFarm󰀁,Penzyme󰀁,ValioT101,

R󰀁

R󰀁

LacTek,CITE及Bacillusstearothermophilus纸片法测定8种󰀁󰀁内酰胺类抗生素残留,在指出体细胞含量对检测结果假阳性影响较大的同时,指出乳中的大肠杆菌杆菌对引起假阳性有部分作用,实验中大肠杆菌数范围在0~205CFU/mL之间[14]。3󰀁2󰀁外来因素

3󰀁2󰀁1󰀁检测者的经验程度

尽管不同微生物检测法有各自特点,但这些方法主要是通过鉴定检测乳样的颜色变化或用微量检测尺测定抑菌圈直径的方法来定性或定量抗生素,这些方法都存在一定的人为感官因素,尤其是传统肉眼辨别的TTC方法,阴性(红色)、可疑(微红)和阳性(白色),人为感官因素影响较大,易出现假阳性或假阴性判断[23]。

3󰀁2󰀁2󰀁微生物活性及生长环境

各种微生物法都没有对微生物的活性做具体的规定,而菌的活性强弱严重影响该菌对抗生素的抵抗性,较弱活性的微生物容易被抑制,造成假阳性。另外,Suzann[23]在检测过程中采用嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法,指出检测平皿的琼脂层厚度、菌株菌龄、加样技术都可能影响测定结果,如果琼脂板过薄(营养物质少或水分蒸干),芽孢生长不够旺盛,也会导致结果呈假阳性。

3󰀁2󰀁3󰀁加样前乳样是否预热处理

检测前热处理对乳样中干扰检测物质的变性有轻微作用,减少假阳性产生的几率,如果检测前没有预热,乳中原有的抑菌物质会抑制所用指示菌或芽孢生长,促使检测结果假阳性,在TTC实验中通常将乳样在80󰀁加热5min,在其他的实验中通常不预热

R

乳样,例如:Delvotest󰀁P󰀁,所以Molina等人建议在测

[18]

定乳样时提前加热乳样可减少假阳性检测结果发生。3󰀁2󰀁4󰀁消毒剂与杀菌剂

清洗盛乳器时,容易造成消毒剂和杀菌剂残留,足够浓度的洗涤剂残留会影响细菌生长而产生假阳性,反复使用的牛乳容器可能出现这一情况。有人做过试验[18],乳样中含有重铬酸钾可显著抑制嗜热脂肪芽孢杆菌生长,应用传统嗜热脂肪芽孢杆菌纸片扩散法(BRT)检测,假阳性比例87󰀁3%;应用Delvotest试剂盒检测,假阳性比例为92󰀁5%,一般不造成假阴性。19年,Tramer报道嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的萌发会被乳酸链球菌素(nisin)抑制,当乳样中添加微

2005年第31卷第8期(总第212期)󰀁95食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES

生物防腐剂(如nisin)可影响嗜热芽胞杆菌生长而使实验结果为假阳性。

11󰀁

4󰀁结󰀁论

微生物检测法是检测乳中抗生素的传统方法,这种方法方便、经济、容易操作,是当前乳中抗生素的最常用检测手段,但是由于乳本身因素及外来因素对指示菌的作用,往往造成󰀁假性󰀁判断,尤其易导致假阳性结果,建议采用至少2种方法确证检测,第1种为经济的高敏感性方法;第2种为高特异性(>99%)方法以确证结果,在实际检测过程中尽量排出󰀁假阳性󰀁影响因素,进而对乳中抗生素残留进行安全、准确的检测及分析。

参

考

文

献

12󰀁

13󰀁14󰀁

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MethodsofMicrobialDetectionAntibioticResidueinMilkand

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(TheDepartmentofFoodScienceandFoodTechnologyofNorth-eastAgricultureUniversity,Haerbin,150030,China)

ABSTRACT󰀁Thecurrentmethodsofdetectionantibioticresidueinmilk,suchasTTC,paperdiskmethod,fer󰀁mentableabilitytestandreagentcaseswereintroduced.Thereasonsfordetectionfalse󰀁positiveoutcomeswereana󰀁lyzedfromtwopoints:intrinsicandextrinsicfactors,thereferenceofantibioticdetectioninmilkwasprovidedaswell.Keywords󰀁antibiotic,microbialdetection,false󰀁positive󰀁96

2005Vol󰀁31No󰀁8(Total212)