上海农业学报２０１０，２６（３）：８０—８２ Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｓｈａｎｇｈａｉ 文章编号：１０００—３９２４（２Ｏ１０）０３Ｉ８Ｏ．Ｏ３ 放线茵Ｓｎｅａ２５３代谢产物杀线虫谱研究 陈井生 ，陈立杰 ，段玉玺 ，朱晓峰 ，王媛媛 （’沈阳农业大学植物保护学院北方线虫研究所，沈阳１１０１６１； 黑龙江省农业科学院大庆分院，大庆１６３３１６） 摘要：采用稀释分离法室内测定了放线菌Ｓｎｅａ２５３的发酵代谢产物对北方根结线虫、南方根结线虫、水稻 干尖线虫和小杆线虫的毒力作用。结果表明：菌株Ｓｎｅａ２５３的代谢物对北方根结线虫和南方根结线虫表现出较 高的生物活性，对水稻干尖线虫毒力较弱，对小杆线虫毒力最弱，即对不同种类线虫存在选择性毒力差异，而且 随稀释倍数增加毒力减弱。 关键词：放线菌；代谢产物；线虫；毒力 中图分类号：￥４３２．４；Ｑ９３９．１３．０５ 文献标识码：Ａ Ｔｈｅ ｎｅｍａｔｉｃｉｄａｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ Ｓｎｅａ２５３ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ ＣＨＥＮ Ｊｉｎｇ－ｓｈｅｎｇ ’ ，ＣＨＥＮ Ｌｉ－ｊｉｅ ，ＤＵＡＮ Ｙｕ—ｘｉ ，ＺＨＵ Ｘｉａｏ—ｆｅｎｇ ，ＷＡＮＧ Ｙｕａｎ・ｙｕａｎ （ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １ １０１６１，Ｃｈｉｎａ；。Ｄａｑｉｎｇ Ｂｒａｎｃｈ，ＨｅｉｌｏｎｇＪｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｄａｑｉｎｇ １６３３１６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｃｔｌｎｏｍｙｃｅｔｅｓ Ｓｎｅａ２５３ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ ｔｏ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ，Ｍ． ｍｃｏｇｎｉｔａ，Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｂｅｓｓｅｙｉ ａｎｄ ＣａｅｎａｒｈａＭｉｔｉｓ ｓｐ．ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ａ ｐｌａｎｔ ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ Ｓｎｅａ２５３ ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ Ｍ．ｈａｐｌａ ａｎｄ Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ，ｌｏｗｅｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｏ Ａ．ｂｅｓｓｅｙｉ，ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｗ— ｅｓｔ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｏ Ｃａｅｎａｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｓｐ．Ｉｔｓ ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ ｔｏ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｃｌｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ；Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ；Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ；Ｔｏｘｉｃｉｔｙ 植物寄生线虫，简称植物线虫，对农业生产危害严重。２０００年，全世界因线虫危害给粮食和纤维作物 造成的损失约为１２．７％，对蔬菜、花生、烟草和果树造成的损失超过２０％，直接经济损失达７８０亿美元ｌ１ 。 其中大豆胞囊线虫、根结线虫和水稻干尖线虫是农业生产中危害十分严重的植物病原线虫，目前已发展 成为农林生产上的重要病害¨２ｊ。近年来，利用生物防治技术控制线虫病害成为国际研究的热点。生防微 生物的应用是防治大豆胞囊线虫病的重要手段，是保护生态环境，实现农业可持续发展的有力保证 ：。 在线虫的生物防治中，抗生素的应用是较为有效的防治途径之一。放线菌是抗生素的重要来源之 一，其在自然界中广泛分布于各种不同的自然生态环境里，种类繁多、代谢功能各异，是一类有着广泛实 际用途的生物资源。放线菌产生的各种次生代谢产物以链霉菌属产生的生物活性物质最多，利用放线菌 的代谢产物控制线虫病害成为防治植物线虫病的重要发展方向＿４］。 放线菌菌株Ｓｎｅａ２５３是以大豆胞囊线虫２龄幼虫为靶标，从大豆根际土壤分离筛选获得的具有开发 潜力的生防菌株，经鉴定为委内瑞拉链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ），以往的研究表明菌株Ｓｎｅａ２５３代 谢物对大豆胞囊线虫胞囊孵化和２龄幼虫具有较强的毒力ｌ６—９Ｓ。本研究着重报道其代谢物对北方根结线 虫、南方根结线虫、水稻干尖线虫和小杆线虫的室内毒力测定结果。 收稿日期：２０１０—０１ １３初稿；２０１（）一０６ １１二改稿 基金项目：教育部新世纪优秀人才支持计划项目（ＮＣＥＴ一（）８一（）８６６）；辽宁省优秀人才支持计划项目（ＲＣ－０５—１８）资助 作者简介：陈井生（１９８２一），男，硕士，研究实习员，从事大豆胞囊线虫抗性育种和生物防治研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｓｈｅｎｇ６６７３１８２＠１６３．ｃｏｍ ＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｌｉｊｉｅ０２１（）＠１６３．ｃｏｍ ３期 上 海 农 业 学 报 ８１ １材料和方法 １．１靶标线虫培养体系的构建 １．１．１ 根结线虫２龄幼虫（Ｊ２）的获得 南方根结线虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）：采自沈阳浑南地区受南 方根结线虫侵染的番茄。将番茄根系取出，用水轻轻冲洗，小心取下卵囊，放在１％的次氯酸钠中消毒 ３ ｍｉｎ，再用无菌水冲洗３次，放在有少量无菌水的培养皿里，２５℃恒温箱中培养，每隔２４ ｈ收集１次新 孵化的南方根结线虫Ｊ２，置于灭菌的三角瓶中，４℃冰箱中备用。 北方根结线虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ）：在温室中盆栽番茄繁殖。将番茄种子播种在育苗床中，待番茄 苗长到２０ ｃｍ左右，稍显粗壮时移为盆栽。接种北方根结线虫，１个月后，根部会产生大量卵囊。将根取 出并洗去泥土，用镊子挑取卯囊置于培养皿中，用１％的次氯酸钠处理３ ｍｉｎ，再用无菌水冲洗３次，置于 ２５℃培养箱中孵化。３ ｄ左右孵化出大量Ｊ２，４℃保存备用。 １．１．２ 水稻千尖线虫的获得 水稻干尖线虫（ ｐ ｅ ｎｃ ＤｆｄＰ ｂｅｓｓｅｙｉ）：采用贝曼漏斗法分离水稻干尖线 虫。将水稻干尖线虫发病严重的水稻稻粒放在培养皿中，水稻组织样品切碎后，用纱布包好放人漏斗并 全部浸在蒸馏水中，在２５℃下浸泡２４ ｈ后收集线虫。 １．１．３ 小杆线虫的获得 小杆线虫（Ｃａｅｎａｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｓｐ．）：利用ＮＡ培养基上的大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）培养小杆线虫，贝曼漏斗法分离后置于４℃冰箱中保存备用。 １．２放线菌菌株的获得与发酵液的制备 将平板上生长良好的菌落加入０．Ｉ ｍＬ ０．０５％的Ｔｗｅｅｎ．８０于２ ｍＬ离心管内，用血球计数板配制成 １０。ｃｆｕ／ｍＬ的菌悬液。取制备好的菌悬液２ ｍＬ接种于５０ ｍＬ马铃薯培养液于１Ｏ０ ｍＬ三角瓶中 １ ５０ ｒ／ｒａｉｎ、２８℃条件下振荡培养７ ｄ，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，上清液用高压灭菌的细菌过滤器过滤，用 无菌水将发酵液依次稀释１、５、１ ０、１５、２０倍等５个浓度梯度，放人４℃冰箱中备用。 １．３ 代谢物对不同种类线虫活力的影响 在经灭菌的贝氏小皿中加入菌株发酵液２００ Ｌ，以无菌水为对照，然后分别向处理和对照中各加入 新孵化的北方根结线虫和南方根结线虫的二龄幼虫，以及水稻干尖线虫和小杆线虫。３次重复。放入 ２５℃培养箱中，２４ ｈ后记录线虫死亡率，计算校正死亡率，线虫死活判断采用ＮａＯＨ刺激法。 线虫死亡率（％）： × 。 校正死亡率ｃ％，： 翼型 × ００ ２结果与分析 ２．１ 菌株Ｓｎｅａ２５３发酵液对根结线虫Ｊ２活性的影响 菌株Ｓｎｅａ２５３的代谢物对南方根结线虫和北方根结线虫均有一定的抑制作用。１倍液对南方根结线 虫的毒力达到８６．５０％，稀释５倍后，活性降低，为５９．８５％；菌株发酵液对北方根结线虫抑制效果优于南 方根结线虫，１倍液的致死率高达９０．４８％，稀释１０倍后毒力仍接近５０％，但对南方根结线虫的致死率却 下降至２８．５３％（表１）。 表１ 不同浓度发酵液处理２４ ｈ对根结线虫的毒力作用 Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ２４ ｈ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ—ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｆｉＩｔｒａｔｅｓ ｏｎ Ｍ．ｈａｐｌａ ａｎｄ Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ ％ 发酵液稀释倍数 南方根结线虫Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ 北方根结线虫Ｍ．ｈａｐｌａ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ 平均死亡率 校正死亡率 平均死亡率 校正死亡率 Ｍｏｒｔａｌｉｔｖ ｒａｔｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｒａｔｅ Ｍｏｒｔａｌｉｔｖ ｒａｔｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｒａｔｅ １ ８６．５０ ａ ８６．５０ ａ ９（）．６７ ａ ９（）．４８ ａ ５ ５９．８５ ｂ ５９．８５ ｂ ７４．４１ ｂ ７３．８９ ｂ １（） ２８．５３ Ｃ ２８．５３ Ｃ ５Ｏ．（）（）ｃ ４８．９８ ｃ １ ５ １１．９７ ｄ １１．９７ ｄ ３９．３３ ｄ ３８．０９ ｄ ２（Ｊ １（）．７５ ｄ １（）．７５ ｄ １８．００ ｅ １６．３３ ｅ 无菌水Ｓｔｅｒｉｌｅ ｗａｔｅｒ ０．ＯＯ ２．Ｏ０ 注：表中数据为３次重复结果；数字后字母表示邓肯新复极差测验差异显著（Ｐ＜０．０５）；下同。 Ｎｏｔｅｓ：Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｖａｌｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ （Ｐ＜０．（１５）ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔＯ Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｎｅｗ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ；Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ． ８２ 陈井生，等：放线菌Ｓｎｅａ２５３代谢产物杀线虫谱研究 ２６卷 ２．２ 菌株Ｓｎｅａ２５３发酵液对水稻干尖线虫和小杆线虫活性的影响 发酵液稀释１倍液对水稻干尖线虫的校正死亡率达到６６．５９％，稀释５倍和１０倍的毒力下降，分别 为５０．９３％和５０．６３％，两者之间差异不显著（表２）。 发酵液稀释５倍浓度对小杆线虫的毒力为４６．８７％，稀释２０倍浓度的抑制作用有很大程度的下降 （表２）。 表２ 不同浓度发酵液处理２４ ｈ对水稻千尖和小杆线虫的毒力作用 Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ２４ ｈ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ－ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ￣ｒｍｅｎｔｅｄ ｆｉｌｔｒａｔｅｓ ｏｎ Ａ．ｂｅｓｓｅｙｉ ａｎｄ Ｃａｅｎａｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｓｐ． ％ ３ 结论与讨论 菌株Ｓｎｅａ２５３是利用大豆胞囊线虫为靶标筛选出来的高效生防菌株，对大豆胞囊线虫Ｊ２致死率达到 ９６％以上，对其卵囊孵化抑制率也达到８８％＿＿８ ］，目前已获得国家发明专利授权。本研究表明，该发酵液 对北方根结线虫和南方根结线虫也具有很强的活性，对水稻干尖线虫的毒力较弱，对土壤自由生活线虫 小杆线虫也存在一定的活性，但活性最弱。 Ｓｎｅａ２５３放线菌发酵液对不同种类线虫的生物活性存在较大的差异，其对胞囊线虫和根结线虫具有 强毒力使其成为具有较高研究价值的生防菌株之一。鉴于胞囊线虫和根结线虫是目前国际上危害最严 重的两种植物病原线虫，寻找控制线虫病害的新药剂是当务之急，而应用多种靶标线虫进行综合筛选生 防菌株已成为发现高效优良菌株的有效手段之一＿３ 。 。 由于生防菌株发酵液活性成分复杂，而且不同的物质成分对不同种类线虫的活性位点作用也不尽相 同，所以同一菌株的发酵液对不同种类线虫的生物活性存在很大差异。由于毒力差异的存在，使其菌株 代谢物中的杀线虫活性物质的分离纯化成为必然。本课题组针对Ｓｎｅａ２５３菌株发酵液中的杀线虫活性 成分进行了进一步分析，初步确定该物质属于碱性水溶性物质［１ 。对该菌代谢产物中活性物质的分离纯 化、结构解析以及安全性评价正在系统深入研究中。 参 考 文 献 ［１］刘维志主编．植物病原线虫学［Ｍ］ 北京：中国农业出版社，２０００． ［２］段玉玺主编．大豆胞囊线虫病及其防治ＥＭ］．北京：金盾出版社，２００６． ［３］Ｄｉｃｋｌｏｗ Ｍ Ｂ，Ａｃｏｓｔａ Ｎ，Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ Ｂ Ｍ Ａ ｎｏｖｅｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｐｌａｎｔ－ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＣｈｅｍｉｃａｌＥｃｏｌｏｇｙ，１９９３，１９（２），１５９—１７３． ［４］Ｃｈｕｂａｃｈｉ Ｋ，Ｆｕｒｕｋａｗａ Ｍ，Ｆｕｋｕｄａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｐｐｒｅｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｎｅｍａｔｏｄａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．ｏｎ ｒｏｏｔ－ｋｎｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｏｆ ｃｕｃｕｍ－ ｂｅｒｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，７（１）：２５—２９． ［５］Ｌｉｕ Ｔ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｄｕａｎ Ｙ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｎｅｍａｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｏｆ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ ａｇａｉｎｓｔ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉ０ｔｅｃｈｎＯｌ０ｇｙ，２００８，２４：１１３—１１８． ［６］陈立杰，陈井生，段玉玺，等．放线菌及其代谢物对植物线虫的生物防治研究进展［ｃ］∥中国线虫学研究（第二卷）．北京：中国农业科学 技术出版社，２００８． ［７］陈立杰，陈井生，段玉玺，等．防治大豆胞囊线虫生防放线菌的初步筛选研究［Ｊ］．植物保护，２００８，３４（３）：１１６—１１９． ［８］陈立杰，陈井生，董健，等．放线菌次生代谢产物对不同来源大豆胞囊线虫Ｊ２毒性的研究ＬＪ］．大豆科学，２００８，２７（４）：６３７—６４０． ［９］陈立杰，陈井生，郑雅楠，等．放线菌Ｓｎｅａ２５３的鉴定及对胞囊线虫的抑制作用［Ｊ］．中国生物防治，２００９，２５（１）：６６—６９． ［１Ｏ］陈立杰，刘彬，段玉玺，等．白僵菌代谢物对不同种类线虫生物活性的初步研究［Ｊ］．沈阳农业大学学报，２００８，３９（３）：３０５—３０８． ［１１］王媛媛，段玉玺，王旭，等．生防细菌Ｊ３５２对不同种类线虫的毒力差异研究［Ｊ］．农药，２００７，４６（３）：２０２～２０３． ［１２］段玉玺，靳莹莹，王胜君，等．生防菌株Ｓｎｅｆ８５的鉴定及其发酵液对不同种类线虫的毒力［盯．植物保护学报，２００８，３５（２）：１３２—１３６． ［１３１陈立杰，董健，朱晓峰，等．生防放线菌Ｓｎｅａ２５３代谢产物的理化性质［Ｊ］．农药，２０１０，４９（１）：２６—２８．
