抗植物病原线虫的多粘类芽胞杆菌KM2501-1发酵培养基和发酵条件优化

发酵条件优化

杨景艳;程万里;曾立;黄典;蔡珉敏;郑龙玉;喻子牛;张吉斌

【摘 要】多粘类芽孢杆菌KM2501-1 可以有效抑制南方根结线虫对植物的危害,促进植物生长,具有良好的应用前景.采用正交实验对多粘类芽孢杆菌 KM2501-1 的发酵培养基和发酵条件进行了优化.结果表明,多粘类芽孢杆菌KM2501-1 发酵培养基的最优配方为:豆粕 3%、可溶性淀粉3%、氯化钙0.05%、氯化钠0.25%;最适发酵pH 值为8.5,最适发酵温度为28 ℃.将多粘类芽孢杆菌KM2501-1 在优化培养基中的发酵上清液稀释5 倍后,作用根结线虫48 h的线虫校正死亡率为 87.15%,比优化前提高了 61.61%;多粘类芽孢杆菌 KM2501-1 在优化培养基上发酵 48 h后的芽孢数为 2.5×108cfu·mL-1,是优化前的 6.25 倍,芽孢率达到 100%时发酵周期为48 h,优化效果十分显著.该研究为多粘类芽孢杆菌KM2501-1 的中试和大规模发酵生产提供了基础数据.%Paenibacillus polymyxa KM2501-1 can effectively inhibit the damage to plants caused by Meloid-ogyne incognita,promote plant growth,and has good application prospects.We optimized the fermentation cul-ture medium and fermentation conditions by an orthogonal experiment.The results show that the optimum for-mulation of fermentation culture medium for Paenibacillus polymyxa KM2501-1 is as follows:3% soybean meal,3% soluble starch,0.05% calcium chloride,and 0.25% sodium chloride.The optimum fermentation pH value is 8.5,and the optimum fermentation temperature is 28 ℃.After 5-fold dilution of the fermentation su-pernatant of Paenibacillus polymyxa KM2501-1 in the optimized culture medium,the nematode correction mor-

tality rate after 48 h exposing is 87.15%,which is 61.61% higher than before optimization.The spore number of KM2501-1 is 2.5×108cfu·mL-1,which is 6.25 times than before optimization.When the sprouting rate reaches 100%,the fermentation period is 48 h,which shows optimization efficiency is very significant.The study provides the basic data for the pilot-scale and large-scale fermentation production of Paenibacillus polymyxa KM2501-1. 【期刊名称】《化学与生物工程》 【年(卷),期】2018(035)006 【总页数】7页(P57-63)

【关键词】多粘类芽孢杆菌KM2501-1;发酵培养基;发酵条件;杀线虫活性;芽孢数 【作 者】杨景艳;程万里;曾立;黄典;蔡珉敏;郑龙玉;喻子牛;张吉斌

【作者单位】农业微生物学国家重点实验室 华中农业大学生命科学技术学院微生物农药国家工程研究中心,湖北 武汉 430070;农业微生物学国家重点实验室 华中农业大学生命科学技术学院微生物农药国家工程研究中心,湖北 武汉 430070;农业微生物学国家重点实验室 华中农业大学生命科学技术学院微生物农药国家工程研究中心,湖北 武汉 430070;农业微生物学国家重点实验室 华中农业大学生命科学技术学院微生物农药国家工程研究中心,湖北 武汉 430070;农业微生物学国家重点实验室 华中农业大学生命科学技术学院微生物农药国家工程研究中心,湖北 武汉 430070;农业微生物学国家重点实验室 华中农业大学生命科学技术学院微生物农药国家工程研究中心,湖北 武汉 430070;农业微生物学国家重点实验室 华中农业大学生命科学技术学院微生物农药国家工程研究中心,湖北 武汉 430070;农业微生物

学国家重点实验室 华中农业大学生命科学技术学院微生物农药国家工程研究中心,湖北 武汉 430070 【正文语种】中 文

【中图分类】TQ458;TQ920

根结线虫是世界上危害最严重的植物寄生线虫之一，每年由根结线虫造成的农业经济损失高达157千亿美元[1]。其中南方根结线虫是一类主要的植物寄生线虫，能够侵染大量的一年生或多年生植物。植物感染根结线虫后往往表现为发育受阻、营养不良、生长衰退、叶黄、矮化等，其中最明显的症状是地下部形成根结[2-4]，受根结线虫侵染的根系容易受到腐生或致病真菌和细菌的次生侵染，引起烂根。目前，根结线虫的防治主要是使用化学杀线虫剂，如噻唑膦、灭线磷、威百亩等[5-7]，但是化学杀线虫剂的使用会带来一系列的环境问题，一些毒性较大的化学杀线虫剂在使用上也受到了[8]，为此研究者正努力开发更环保的杀线虫剂。 近年来，生物来源的杀线虫剂越来越受到研究者的重视，主要来源于植物、真菌、细菌或转化的微生物[9]。多粘类芽胞杆菌是一种植物根际促生细菌，具有防治植物病害和促进植物生长的作用[10]。据报道[11]，多粘类芽胞杆菌WY110对西瓜枯萎病菌具有非常显著的拮抗作用，在室内蛭石育苗实验中对西瓜枯萎病有一定的防治效果。多粘类芽胞杆菌L1-9的发酵液能够有效抑制番茄早疫病菌的菌丝生长和孢子萌发，温室实验中对番茄早疫病的防治作用非常明显[12]。多粘类芽胞杆菌GBR-1的发酵上清液能够有效抑制根结线虫卵的孵化，并且对根结线虫二龄幼虫具有非常显著的防治效果[13]。

多粘类芽胞杆菌KM2501-1发酵上清液对南方根结线虫不仅具有良好的触杀活性，还表现出一定的熏杀效果。作者所在课题组[14]前期通过固相微萃取(SPME)和气

质联用(GC-MS)方法对KM2501-1发酵上清液中的挥发性物质进行分析鉴定，发现多种挥发性物质都具有非常高的杀线虫活性，如2-壬酮、2-十一酮、糠醛丙酮等。此外，还通过温室实验分别检测了KM2501-1菌悬液和发酵上清液对番茄根结线虫病害的防治效果，结果发现，第一次温室实验中KM2501-1菌悬液、发酵上清液和空白对照的番茄根部损伤指数分别为2.40、0.60、4.80；第二次温室实验中KM2501-1菌悬液、发酵上清液和空白对照的番茄根部损伤指数分别为2.40、1.00、4.40。表明，经过KM2501-1菌悬液、发酵上清液处理后的番茄能够有效抑制根结线虫的侵染。因此，多粘类芽胞杆菌KM2501-1在防治根结线虫方面具有良好的应用潜力，有待开发成新型生物杀线虫剂。

在活菌制剂的制备过程中为了延长菌剂的贮存期，往往要求菌体以芽胞形式存在[15-17]。芽胞是细菌休眠体，对多种恶劣条件具有非常强的抗逆性和耐受性，常见的产芽胞细菌主要有芽胞杆菌属、梭菌属和芽胞乳酸菌属[15]。目前，在工业生产过程中主要面临芽胞形成率不高、形成周期长等问题。虽然多粘类芽胞杆菌KM2501-1在原始SBM培养基中芽胞形成周期短，发酵48 h芽胞率接近100%，但不利于杀线虫活性物质的产生。鉴于此，作者对KM2501-1的发酵培养基及发酵条件进行优化，力求在不延长芽胞形成周期的前提下适当提高发酵上清液的杀线虫活性，拟为该菌株的大规模发酵生产奠定基础。 1 实验

1.1 菌种与培养基

多粘类芽胞杆菌KM2501-1(Paenibacillus polymyxa KM2501-1)，分离自江西省湖口县有机复合污染的毛茛根际。

KMB 培养基(g·L-1)：胰蛋白胨20,MgSO4·7H2O 1.5，K2HPO4 1.5，甘油10 mL，pH值7.2～7.4。

SBM培养基(%)：豆粕3，可溶性淀粉3，氯化钙0.10，氯化钠0.25，pH值5.5。

1.2 方法 1.2.1 菌种活化

用接种环从甘中蘸取少量菌液在KMB固体培养基上划线，于28 ℃培养约48 h至长出菌落。 1.2.2 种子液的制备

用接种环挑取单菌落接种于装有灭菌的KMB液体培养基的三角瓶中，于28 ℃、180 r·min-1培养约24 h至菌落生长对数期，即得种子液。 1.2.3 发酵上清液的制备

以1%接种量将种子液接种于装有100 mL SBM培养基的三角瓶中，于28 ℃、180 r·min-1培养约48 h。发酵液经高速冷冻离心机12 000 r·min-1 离心20 min，收集上清液，并经0.22 μm的过滤头过滤除菌，4 ℃冰箱保存,备用。 1.2.4 J2期南方根结线虫体外抑制实验

使用96孔板进行离体生物活性测定实验。依次向96孔板中各加入120 μL发酵上清液、3 μL 30 mg·mL-1的氯霉素溶液、20～40头J2期南方根结线虫[14]。每个样品设置3个重复，并用培养基和无菌水作为空白对照。将96孔板用封口膜密封好，置于20 ℃恒温培养箱中静置培养，分别在48 h、72 h时用针刺法[18]判断根结线虫是否死亡，统计死亡根结线虫数量，并按下式计算根结线虫校正死亡率[19]： 校正死亡率

1.2.5 芽胞染色和计数

用0.5%的番红水溶液染色多粘类芽胞杆菌KM2501-1约5 min，倾去染色液，用缓流水冲洗至流出的水无红色，自然晾干后,在100倍油镜下观察芽胞形态。 采用稀释涂布平板法[20]测定多粘类芽胞杆菌KM2501-1活菌总数。 1.2.6 发酵培养基的优化

以可溶性淀粉、豆粕、氯化钙、氯化钠的浓度为考察因素，以发酵上清液稀释2倍后作用根结线虫48 h的校正死亡率为考核指标，采用正交实验优化发酵培养基，正交实验的因素与水平见表1。 表1正交实验的因素与水平/%

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment/% 水平因素A.可溶性淀粉B.豆粕C.氯化钙D.氯化钠1220.050.102330.100.253440.150.50 1.2.7 发酵条件优化

1.2.7.1 发酵初始pH值的筛选

发酵初始pH值分别为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5时，测定发酵上清液稀释5倍后作用根结线虫72 h的校正死亡率。 1.2.7.2 发酵温度的筛选

发酵温度分别为20 ℃、28 ℃、37 ℃时，测定发酵上清液稀释5倍后作用根结线虫72 h的校正死亡率。 2 结果与讨论

2.1 发酵培养基优化正交实验结果

正交实验结果与分析见表2，方差分析见表3。 表2正交实验结果与分析

Tab.2Results and analysis of orthogonal experiment 实验号ABCD校正死亡率/%1111193.602122295.823133315.01

4212320.675223194.206231293.177313218.268321313.63 9332114. K1204.425132.525200.395202.440K2208.035203.0131.120207.245K346.525122.820127.47049.300R161.51080.82072.925157.945

由表2可知，4个因素对根结线虫校正死亡率的影响大小依次为可溶性淀粉>氯化

钠>豆粕>氯化钙，可溶性淀粉为主要影响因素。发酵培养基的最优配方为A2B2C1D2，即可溶性淀粉3%、豆粕3%、氯化钙0.05%、氯化钠0.25%。 表3方差分析

Tab.3 Variance analysis因素偏差平方和自由度方差F值P值

A5670.102522835.05120.42080.000352603B1298.155929.07790.09630.001538277C1125.60042562.80020.08350.001773678D5380.174522690.08730.39930.000371597sum13474.033386737.0166

由表3可知，发酵培养基成分可溶性淀粉、豆粕、氯化钙、氯化钠对多粘类芽胞杆菌KM2501-1发酵产杀线虫活性物质的影响均极显著(P<0.01)，其中可溶性淀粉的影响最显著，与极差分析结果一致。 2.2 发酵条件优化单因素实验结果 2.2.1 发酵初始pH值

发酵上清液稀释5倍后作用根结线虫72 h。发酵初始pH值对多粘类芽胞杆菌KM2501-1产杀线虫活性物质的影响见图1，对芽胞形成的影响见图2。 由图1可知，随着发酵初始pH值的升高，稀释5倍的发酵上清液的杀线虫活性不断增强，发酵初始pH值为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5时的校正死亡率分别为18.26%、14.53%、31.70%、62.66%、82.65%；发酵初始pH值为9.5时，杀线虫效果最好。表明，碱性条件可能有利于KM2501-1代谢产生大量的杀线虫活性物质。

由图2可知，发酵初始pH值为5.5、6.5、7.5、8.5时，芽胞率均接近100%；发酵初始pH值为9.5时，芽胞率为0%；发酵初始pH值为10.5时，KM2501-1不能正常生长。表明，酸性或弱碱性条件更有利于KM2501-1芽胞的形成，KM2501-1最高耐受pH值为9.5。综合考虑，确定最佳发酵初始pH值为8.5，此时发酵上清液稀释5倍后作用根结线虫72 h后的校正死亡率为62.66%，芽胞

率为100%。

图1 发酵初始pH值对多粘类芽胞杆菌KM2501-1产杀线虫活性物质的影响Fig.1 Effect of initial fermentation pH value on the production ofnematicidal active substance by Paenibacillus polymyxa KM2501-1 图2 发酵初始pH值对多粘类芽胞杆菌KM2501-1芽胞形成的影响Fig.2 Effect of initial fermentation pH value on the formation of spores of Paenibacillus polymyxa KM2501-1 2.2.2 发酵温度

发酵上清液稀释5倍后作用根结线虫72 h。发酵温度对多粘类芽胞杆菌KM2501-1产杀线虫活性物质的影响见图3，对芽胞形成的影响见图4。 由图3可知，发酵温度为20 ℃、28 ℃、37 ℃时，稀释5倍的发酵上清液作用根结线虫72 h的校正死亡率分别为30.43%、62.40%、26.67%。表明，发酵温度为28 ℃时最有利于KM2501-1产杀线虫活性物质。

图3 发酵温度对多粘类芽胞杆菌KM2501-1产杀线虫活性物质的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on the production ofnematicidal active substance by Paenibacillus polymyxa KM2501-1

图4 发酵温度对多粘类芽胞杆菌KM2501-1芽胞形成的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on the formation of spores of Paenibacillus polymyxa KM2501-1

由图4可知，发酵温度为20 ℃时，多粘类芽胞杆菌KM2501-1部分菌体膨大形成梭形芽胞，芽胞率低于10%；发酵温度为28 ℃时，KM2501-1菌体全部膨大形成梭形芽胞，芽胞率接近100%；发酵温度为37 ℃时，KM2501-1以菌体形式存在，芽胞率为0%。表明，发酵温度为28 ℃时最有利于KM2501-1芽胞的形成。综合考虑，确定最佳发酵温度为28 ℃。

2.3 优化效果验证实验

发酵上清液分别稀释1倍、2倍、5倍后作用根结线虫48 h。发酵培养基和发酵条件优化前后对多粘类芽胞杆菌KM2501-1产杀线虫活性物质的影响见图5，对芽胞形成的影响见图6，对芽胞数的影响见图7。

图5 优化前后多粘类芽胞杆菌KM2501-1产杀线虫活性物质的比较Fig.5 Comparison of the production of nematicidalactive substance by Paenibacillus polymyxaKM2501-1 before and after optimization

由图5可知，优化前，发酵上清液稀释1倍、2倍、5倍后作用根结线虫48 h的校正死亡率分别为83.87%、55.26%、25.54%；优化后则分别为100%、100%、87.15%，较优化前分别提高了16.13%、44.74%、61.61%。表明，优化后发酵培养基和发酵条件更有利于多粘类芽胞杆菌KM2501-1产杀线虫活性物质，优化效果显著。

图6 优化前后多粘类芽胞杆菌KM2501-1芽胞形成的比较Fig.6 Comparison of the formation of spores of Paenibacilluspolymyxa KM2501-1 before and after optimization

图7 优化前后多粘类芽胞杆菌KM2501-1芽胞数的比较Fig.7 Comparison of the number of spores of Paenibacilluspolymyxa KM2501-1 before and after optimization

由图6可知，优化前后，多粘类芽胞杆菌KM2501-1 48 h的芽胞率均接近100%。由图7可知，优化前KM2501-1的芽胞数(4×107 cfu·mL-1)明显低于优化后(2.5×108 cfu·mL-1)，优化后芽胞数是优化前的6.25倍。表明，优化后发酵培养基和发酵条件更有利于KM2501-1的大量繁殖，优化效果十分显著。 2.4 讨论

培养基是影响微生物生长的一个重要因素，不同微生物对营养物质的需求不同[21]。

适用于大规模生产的培养基需要考虑两方面的因素：一方面是培养基必须适合微生物的大量繁殖，另一方面是培养基原料要低廉易得[22]。多粘类芽胞杆菌KM2501-1在优化培养基中发酵48 h的芽胞数为2.5×108 cfu·mL-1，在原始SBM培养基中发酵相同时间的芽胞数为4×107 cfu·mL-1，优化后的芽胞数是优化前的6.25倍，优化效果十分显著。该研究不仅提高了KM2501-1的芽胞数，同时发酵培养基成分简单，价格低廉，适用于工业生产。

此外，优化过程中发现，添加农副产品豆粕的发酵培养基在灭菌后pH值有所下降，灭菌前发酵培养基的pH值不能反映KM2501-1真实的发酵pH值，因此本实验探究了灭菌后发酵培养基的pH值即初始发酵pH值对菌株产杀线虫活性物质和芽胞形成的影响。结果发现，发酵pH值在5.5～8.5范围内芽胞率接近100%；发酵pH值为9.5时，芽胞率为0%。表明，酸性或弱碱性条件更有利于芽胞的形成。KM2501-1在pH值5.5～9.5范围内均能生长，pH值为10.5时菌株不能生长。J2期南方根结线虫体外抑制实验结果表明，发酵pH值为9.5时，发酵上清液的杀线虫效果最好。大部分多粘类芽胞杆菌最适发酵pH值都低于9.0左右，据文献[23]报道，随着发酵pH值的升高，多粘类芽胞杆菌HD-1产酶量也随之提高；发酵pH值为9.0时，产酶量达到最高；随着发酵pH值的继续升高，菌株产酶量显著下降；发酵pH值为9.5时，产酶量为0。多粘类芽胞杆菌S960对尖孢镰刀菌有很好的抑菌效果，初始发酵pH值为7.0时，菌株S960发酵液对尖孢镰刀菌有明显的抑制作用，抑菌率达 93.0%[24]。本研究首次发现多粘类芽胞杆菌KM2501-1在弱碱性条件下能够大量繁殖且具有非常高的杀线虫活性。KM2501-1最高耐受pH值为9.5左右，基于这一特点，该菌株在抗线虫功能有机肥的二次发酵中相比其它菌株可能具有一定的优越性，因为抗线虫功能有机肥的制备包括2次发酵过程，第一次发酵是通过加入腐熟菌剂发酵，促进有机质腐熟，第一次发酵后一般pH值升至8.5以上。利用该菌株发酵制备抗线虫有机肥可能具有广阔的应

用前景。多粘类芽胞杆菌KM2501-1在初始发酵pH值偏碱性条件下发酵，其发酵上清液随初始发酵pH值的增大，对抗南方根结线虫活性增强，可能是由于杀线虫活性物质在碱性条件下表达量增加所致。 3 结论

首次通过对发酵培养基和发酵条件的优化来提高抗植物病原线虫的多粘类芽胞杆菌KM2501-1发酵上清液的杀线虫活性，同时严格控制芽胞形成周期。通过正交实验对多粘类芽胞杆菌KM2501-1发酵培养基进行了优化，优化后的发酵培养基配方为：可溶性淀粉3%、豆粕3%、氯化钙0.05%、氯化钠0.25%。在此发酵培养基基础上进行发酵条件的优化，优化后的发酵条件为：发酵初始pH值8.5、发酵温度28 ℃。在优化条件下，发酵上清液稀释1倍、2倍、5倍后作用根结线虫48 h的校正死亡率分别为100%、100%、87.15%，较优化前分别提高了16.13%、44.74%、61.61%。发酵培养基和发酵条件优化后，不仅显著提高了发酵上清液的杀线虫活性，而且在一定程度上增加了芽胞数。该研究为多粘类芽胞杆菌KM2501-1的中试和大规模发酵生产提供了基础数据。 参考文献：

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