微生物肥料产品检验规程(NY2321-2013)

1 范围

本标准规定了微生物肥料样品要求、试样制备和检测方法。 本标准适用于微生物肥料产品的质量检验。 2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 19524.1 肥料中粪大肠菌群的测定 GB/T 19524.2 肥料中蛔虫卵死亡率的测定 NY 525 有机肥料

NY/T 1113 微生物肥料术语

NY/T 1736 微生物肥料菌种鉴定技术规范

NY/T 1978 肥料 汞、砷、镉、铅、铬含量的测定

NY/T 2066 微生物肥料生产菌株的鉴别 聚合酶链式反应（PCR）法 3 术语和定义

NY/T 1113界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出了NY/T 1113中的某些术语和定义。 3.1

微生物肥料 microbial fertilizer

含有特定微生物活体的制品，应用于农业生产，通过其中所含微生物的生命活动，增加植物养分的供应量或促进植物生长，提高产量，改善农产品品质及农业生态环境。微生物肥料包含农用微生物菌剂（即微生物接种剂）、复合微生物肥料和生物有机肥。 3.2

有效菌 functional microorganism; effective microorganism 样品中的目的微生物群体。 3.3

有效[活]菌数 number of functional microorganism 每克或每毫升样品中有效菌的数量。 3.4

杂菌 contaminated microorganism

1

样品中有效菌以外的其它菌。 3.5

杂菌数 number of contaminated microorganism 每克或每毫升样品中有效菌以外的其它菌的数量。 3.6

杂菌率 percentage of contaminated microorganism 样品中杂菌数占有效菌数与杂菌数之和的百分数。 3.7

菌落 colony

微生物在固体基质上生长繁殖形成的肉眼可见的、具有一定形态特征的细胞聚集体。 3.8

总养分 total primary nutrient

总氮（N）、磷（P2O5）和钾（K2O）含量之和，以质量百分数计。 4 样品要求及试样制备 4.1 样品要求 4.1.1 样品信息记录

对待检样品进行唯一性标记编号。记录样品的名称、来源、外观、数量、生产日期、保质期、菌种名称（拉丁文学名）、取（送）样人及取（送）样时间、执行标准、检测方法、保存条件、流转、处置、及保密等信息。记录信息应齐全，内容真实。 4.1.2 样品管理

样品应按产品保存要求冷藏或常温保存，在保存、制备、分样和流转过程中，避免发生混淆、污染、变质、丢失或损坏。出厂检验样品至少保存至检测结果确认后；监督抽查检验样品应按相关规定执行；仲裁检验样品及其他委托检验样品，在客户对检验报告无异议的情况下，应至少保留至检验报告发出后一个月或按有关约定处理。对已检毕的样品或保质期满的样品，应做好清理记录，并按要求处置。 4.2 试样的制备

试样应从混合均匀的样品中分取。用于有效活菌数、杂菌率、粪大肠菌群等微生物相关参数检测的试样制备，应按无菌操作的要求进行。 5 检测方法 5.1 有效活菌数 5.1.1 通则

根据样品中有效菌的种类及其特性，选用平板计数法或最可能数（Most Probable Number，MPN）法。平板计数法包括培养基平板制备、系列稀释、加样及培养、菌落识别和菌落计数5个操作步骤。最可能数（MPN）法采用5管法。采用MPN 5管法测定光合细菌数按附录A的规定执行。 5.1.2 培养基

常用培养基配方及其制备要求遵照附录B的规定。 5.1.3 仪器设备

除微生物实验室常规灭菌及培养仪器设备外，其他仪器设备如下。 5.1.3.1 超净工作台或洁净室：洁净室的洁净等级为1 000~100级。 5.1.3.2 恒温培养箱：温度分辨率不低于0.5 ℃，温度波动允差±1 ℃。 5.1.3.3 振荡器（摇床）。

5.1.3.4 电子天平：感量为0.001 g。 5.1.3.5 pH计。 5.1.3.6 显微镜。

5.1.3.7 刻度吸管：0.5 mL刻度吸管（具 0.01 mL 刻度）、5 mL刻度吸管（具 0.1 mL 刻度）和10 mL刻度吸管（具 0.1 mL 刻度）等。 5.1.3.8 锥形瓶：容量500 mL、150 mL。 5.1.3.9 培养皿：Φ9 cm。 5.1.4 操作步骤

5.1.4.1 培养基平板制备

根据有效菌的种类选用适宜的培养基。将配制并经灭菌（或除菌）的培养基温度保持在45 ℃~50 ℃，在无菌条件下倒入无菌培养皿内，厚度范围在3 mm～5 mm，水平放置，待其凝固后即制备成培养基平板。检测用平板应无污染、无裂痕，平整且无明显可见的冷凝水。 5.1.4.2 系列稀释

固体试样称取10 g（精确到0.01 g），加入带玻璃珠且装有100 mL无菌水的500 mL具塞（棉塞或硅胶塞）锥形瓶中，静置20 min；液体试样取10.0 mL加入带玻璃珠且装有90 mL无菌水的500 mL具塞锥形瓶中。在振荡器上200 r/min充分振荡30 min，即制成基础菌悬液。用5 mL或10 mL无菌刻度吸管吸取5.0 mL基础菌悬液，加入到装有45 mL无菌水的150 mL具塞锥形瓶中，充分振荡摇匀，得到1:1×101的菌悬液；按1:10进行系列稀释，依次得到1:1×102，1:1×103，1:1×104……稀释度的菌悬液。系列稀释过程中，各个稀释度之间应更换无菌刻度吸管。 5.1.4.3 加样及培养

准确吸取0.10 mL菌悬液，加至培养基平板上，用无菌涂布棒将其涂布均匀，在适宜的条件下倒置培养。每个试样至少选取3个连续适宜稀释度的菌悬液，每一稀释度至少重复3次，各个稀释度之间应更换无菌涂布棒。同时以无菌水作空白对照。 5.1.4.4 菌落识别

培养结束后，观察平板上的菌落形态特征，确定存在的菌落类型；选取各类典型菌落进行涂片和染色，在显微镜下观察菌体形态，并根据有效菌的菌落、菌体等特征进行比较和确认。当不能确认有效菌时，应采用生化试验、NY/T 1736或NY/T 2066中鉴别方法进行有效菌确认。当空白对照平板上出现菌落时，检测结果无效。 5.1.4.5 菌落计数

3

菌落计数范围应符合丝状真菌10 个/皿~150 个/皿，其他微生物20 个/皿~300 个/皿。选取在菌落计数范围内的稀释度平板，分别计数有效菌的菌落数和计算每一稀释度上的菌落平均数。若有两个稀释度的菌落平均数均在计数范围内时，应按两者菌落总数之比值决定。若其比值小于等于2应计算两者的平均数；若大于2则以低稀释度的菌落平均数计算。同一稀释度各平板上菌落数之间的标准差按式（1）计算，并符合表1中的规定：

n-1(xi1nix)2 ........................................................................ (1)

n1式中：

δn-1 ——标准差，单位为个/皿；

xi ——同一稀释度平板的菌落数，单位为个/皿； x ——同一稀释度平板的菌落平均数，单位为个/皿； n ——重复次数。

表1 平板上有效菌菌落数对应的允许标准差

丝状真菌 平板上菌落数 个/皿 10~50 51~150 —— 允许标准差 δn-1 ≤ 10.0 ≤ 20.0 —— 平板上菌落数 个/皿 20~50 51~100 101~300 其他微生物 允许标准差 δn-1 ≤ 10.0 ≤ 20.0 ≤ 50.0 5.1.5 结果计算

有效活菌数以质量有效活菌数nm或体积有效活菌数nv计，数值以亿个每克（亿个/g）或亿个每毫升（亿个/mL）表示，按式（2）或式（3）计算：

xkv1108 ........................................................................... (2) nmm0v2

xkv1108 ............................................................................ (3) nvv0v2式中：

x ——菌落平均数，单位为个； k ——稀释倍数，为稀释度的倒数；

v1 ——基础菌悬液体积，单位为毫升（mL）； m0 ——固体试样量，单位为克（g）；

v 2 ——菌悬液加样量，单位为毫升（mL）； v0 ——液体试样量，单位为毫升（mL）； 10-8 ——转换成单位为亿/g（ml）的换算系数。

计算结果的报出值应比对应的产品标准指标要求多保留一位小数，数字修约与数据处理应符合GB/T 8170的规定。 5.2 杂菌率 5.2.1 培养基

细菌杂菌测定采用附录B中营养肉汤琼脂培养基；霉菌及其他真菌杂菌的测定采用马丁培养基或PDA培养基。

5.2.2 仪器设备

按5.1.3的规定。 5.2.3 操作步骤

细菌杂菌、霉菌及其他真菌杂菌的测定方法同5.1.4的规定。 5.2.4 结果计算

细菌杂菌数、霉菌及其他真菌杂菌数的计算同5.1.5中式（2）或式（3），杂菌率以c计，数值以%表示，按式（4）计算：

cn1n2100 ......................................................................... (4)

n1n2n式中：

n1 ——细菌杂菌数，单位为亿个每克（亿个/g）或 亿个每毫升(亿个/mL)；

n2 ——霉菌及其他真菌杂菌总数，单位为亿个每克（亿个/g）或 亿个每毫升(亿个/mL)； n ——有效活菌数，单位为亿个每克（亿个/g）或 亿个每毫升(亿个/mL)。 计算结果保留到小数点后两位，数字修约与数据处理应符合GB/T 8170的规定。 5.3 有机质

有机质的测定按NY 525执行。 5.4 总养分含量

总氮（N）和 磷（P2O5）含量的测定按NY 525中的规定执行。钾（K2O）含量的测定可按附录C中规定的方法或NY 525中的规定执行。 5.5 水分 5.5.1 仪器设备

5.5.1.1 鼓风干燥箱：105 ℃±2 ℃。 5.5.1.2 电子天平：感量为0.001 g。 5.5.1.3 铝盒。 5.5.2 操作步骤

将铝盒置于干燥箱中105 ℃烘30 min，冷却后称量并记录铝盒的质量。向铝盒中加入20 g（精确到0.01 g）试样并记录质量；将加有试样的铝盒置于干燥箱中105 ℃下烘5 h取出，放入干燥器中冷却20 min后进行称量并记录。每个试样两次平行。 5.5.3 结果计算

水分含量以w计，数值以%表示，按式（5）计算：

wm1m2100 ..................................... (5)

m1m0式中：

m0 ——铝盒的质量，单位为克（g）；

m1 ——试样和铝盒的质量，单位为克（g）；

m2 ——烘干后试样和铝盒的质量，单位为克（g）。

5

计算结果保留到小数点后一位，取平行结果的算术平均值为测定结果，两次平行结果的绝对差值应不大于1.0，数字修约与数据处理应符合GB/T 8170的规定。 5.6 细度 5.6.1 一般要求

颗粒剂型或以麸皮、米糠、豆粕、秸秆等为载体的微生物肥料产品的细度测定采用干筛法，其他产品细度测定采用湿筛法。 5.6.2 仪器设备

5.6.2.1 鼓风干燥箱：105 ℃±2 ℃。 5.6.2.2 电子天平：感量为0.01 g。

5.6.2.3 试验筛：孔径Φ0.18 mm、Φ1.0 mm、Φ2.0 mm和Φ4.75 mm等。 5.6.3 操作步骤与结果计算 5.6.3.1 湿筛法

称取50 g（精确到0.1 g）试样放入烧杯中，加200 mL自来水浸泡10 min~30 min后倒入试验筛中，然后用水冲洗，并用刷子轻刷筛面上的试样，直至筛下流出清水为止。将试验筛连同筛上试样放入干燥箱中，在105 ℃烘5 h。冷却后称量筛上试样质量。试样细度以筛下试样质量分数s计，数值以%表示，按式（6）计算：

s[1m1]100 .................................. (6)

m0(1w)式中：

m0 ——试样质量，单位为克（g）； w ——试样水分含量，%；

m1 ——经烘干后筛上试样质量，单位为克（g）。

计算结果保留到小数点后一位，数字修约与数据处理应符合GB/T 8170的规定。 5.6.3.2 干筛法 5.6.3.2.1 颗粒剂型试样

称取50 g（精确到0.1 g）试样，将小孔径和大孔径的试验筛依次叠放在底盘上。试样倒入大孔径试验筛内轻筛，直至筛上试样不再下落，然后称量小孔径试验筛上的试样质量。颗粒细度以g1计，数值以%表示，按式（7）计算：

g1m1/m0100 ..................................... (7)

式中：

m1 ——小孔径试验筛上试样质量，单位为克（g）； m0 ——试样质量，单位为克（g）。

计算结果保留到小数点后一位，数字修约与数据处理应符合GB/T 8170的规定。

5.6.3.2.2 粉状剂型试样

称取50 g（精确到0.1 g）试样放入试验筛中，用刷子轻刷筛面上的试样，直至筛上试样不再下落，称量筛下试样质量。试样细度以筛下试样质量分数g2计，数值以%表示，按式（8）计算：

式中：

g2m1/m0100 ..................................... (8)

m1 ——筛下试样质量，单位为克（g）； m0 ——试样质量，单位为克（g）；

计算结果表示到小数点后一位，数字修约与数据处理应符合GB/T 8170的规定。 5.7 pH值 5.7.1 试剂与材料

水应符合GB/T 6682三级水要求。 5.7.1.1 pH 4.00（25℃）的标准溶液。 5.7.1.2 pH 6.86（25℃）的标准溶液。 5.7.1.3 pH 9.18（25℃）的标准溶液。 5.7.2 仪器设备 5.7.2.1 pH计。

5.7.2.2 电子天平：感量为0.1 g。 5.7.3 操作步骤

5.7.3.1 打开pH计电源预热30 min，用标准溶液校准。

5.7.3.2 用量筒量取40 mL液体试样放入烧杯中，用pH计测定，仪器读数稳定后记录。每个试样两次平行。

5.7.3.3 称取15 g固体试样放入烧杯中，根据基质类型按1:2~5(试样:水)的质量比加入无离子水，搅拌均匀。放置30 min，用pH计测定，仪器读数稳定后记录。每个试样两次平行。 5.7.4 结果计算

计算结果保留到小数点后一位，取平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次测定结果的绝对差值应不大于0.1，数字修约与数据处理应符合GB/T 8170的规定。 5.8 粪大肠菌群数

按GB/T 19524.1的规定执行。粪大肠菌群数测定流程及最可能数（MPN）检索表参见附录D。 5.9 蛔虫卵死亡率

按GB/T 19524.2的规定执行。

5.10 汞（Hg）、砷（As）、镉（Cd）、铅（Pb）、铬（Cr）

按NY/T 1978的规定执行。 5.11 纤维素酶活力

按附录E中E.1的规定执行。 5.12 蛋白酶活力

按附录E中E.2的规定执行。

7

附 录 A

（规范性附录） MPN 5管法

A.1 试剂和材料

常用培养基配方及其制备要求符合附录B的规定。 A.2 仪器设备

除微生物实验室常规灭菌及培养仪器设备外，其他仪器设备如下。 A.2.1 超净工作台或洁净室: 洁净室的洁净等级为1 000~100级。 A.2.2 光照培养箱。 A.2.3 振荡器（摇床）。 A.2.4 pH计。

A.2.5 电子天平：感量为0.001 g。

A.2.6 刻度吸管：0.5 mL刻度吸管（具 0.01 mL 刻度）、5 mL刻度吸管（具 0.1 mL 刻度）和10 mL刻度吸管（具 0.1 mL 刻度）等。 A.2.7 锥形瓶：容量500 mL、150 mL。 A.2.8 螺口试管：容量10 mL。 A.3 操作步骤 A.3.1 稀释

固体试样称取10 g（精确到0.01 g），加入带玻璃珠且装有100 mL无菌水的500 mL具塞（棉塞或硅胶塞）锥形瓶中，静置20 min；液体试样取10.0 mL加入带玻璃珠且装有90 mL无菌水的500 mL具塞锥形瓶中。在振荡器上200 r/min充分振荡30 min，即得到1:1×101的菌悬液。吸取5.0 mL上述菌悬液，加入装有45 mL无菌水的150 mL具塞锥形瓶中，充分振荡摇匀，得到1:1×102的菌悬液；按1:10进行系列稀释，依次得到1:1×103，1:1×104，1:1×105……稀释度的菌悬液。系列稀释过程中，各个稀释度之间应更换无菌吸管。 A.3.2 加样

选择适宜的5个连续稀释度的菌悬液，分别吸取1.0 mL不同稀释度的菌悬液至无菌螺口试管中，并用无菌培养基充满。每一稀释度重复5次，不同稀释度间更换无菌吸管。同时以无菌水作空白对照。 A.3.3 培养

加样后拧紧塑料帽并摇匀，将螺口试管放到适宜的条件下培养。 A.4 结果计算

根据出现光合细菌生长的阳性试管数，查 “MPN（最大可能数），lgMPN表”（表A.1）即可计算出光合细菌的有效活菌数，以n计，数值以亿个每克（亿个/g）或亿个每毫升（亿个/mL）表示，按式A.1计算：

(A.1) nsk108.....................................

式中：

s ——菌数近似值；

k ——数量指标第一位数的稀释倍数；

10-8——转换成单位为亿/g（ml）的换算系数。

计算结果的报出值保留一位或两位小数，数字修约与数据处理应符合GB/T 8170的规定。

A.5 计数规则

在稀释系列中必须最后一个稀释度所有重复间都没有微生物生长。确定数量指标系取稀释系列中所有重复均为阳性的最高稀释度为数量指标的第一位数字，总共取三个连续稀释管的结果查表。 A.5.1 在全部5支试管中均出现生长的稀释度中，把出现生长的稀释度倍数最高的那一级放入数列。

示例：

为5-5-3-0-0时，则取5-3-0数列。

A.5.2 在全部5支试管中均不出现生长的稀释度中，把稀释度倍数最低的那一级放入数列。

示例：

为5-3-0-0-0时，则取5-3-0数列。

A.5.3 如果应用上述两条规则，会出现采用如5-5-4-3-0这样的4个等级的稀释度的情况。此时，可先取前面的5-4-3数列，后取4-3-0数列，分别求出lgMPN，然后算出其真数的平均值。在此列中，数列5-4-3的lgMPN为1.447，数列4-3-0的lgMPN为0.431+1（后一数列与前一数列相应稀释了10倍，故要加1进行校正），（1.447+1.431）/2=1.439，所以MPN=27.5。

表A.1 MPN，lgMPN表

阳性试管数 第一 稀释管 0 0 1 1 2 2 第二 稀释管 0 1 0 1 0 0 第三 稀释管 0 0 0 0 0 1 MPN （相当于第一稀释管1毫升） 0 0.18 0.20 0.40 0.45 0.68 - 0.255-1 0.301-1 0.602-1 0.653-1 0.833-1 lgMPN 第一 稀释管 5 5 5 5 5 5 阳性试管数 第二 稀释管 0 0 1 1 2 2 第三 稀释管 0 1 0 1 0 1 MPN （相当于第一稀释管1毫升） 2.3 3.1 3.3 4.6 4.9 7.0 0.362 0.491 0.519 0.663 0.690 0.845 lgMPN 表A.1（续）

阳性试管数 第一 稀释管 2 2 第二 稀释管 1 2 第三 稀释管 0 0 MPN （相当于第一稀释管1毫升） 0.68 0.93 0.833-1 0.968-1 lgMPN 第一 稀释管 5 5 阳性试管数 第二 稀释管 2 3 第三 稀释管 2 0 MPN （相当于第一稀释管1毫升） 9.5 7.9 0.978 0.8 9 lgMPN 阳性试管数 第一 稀释管 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 第二 稀释管 0 0 1 2 0 0 1 1 2 2 3 第三 稀释管 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 MPN （相当于第一稀释管1毫升） 0.78 1.1 1.1 1.4 1.3 1.7 1.7 2.1 2.2 2.6 2.7 lgMPN 第一 稀释管 0.2-1 0.041 0.041 0.146 0.114 0.230 0.230 0.322 0.342 0.415 0.431 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 阳性试管数 第二 稀释管 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 第三 稀释管 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 4 5 MPN （相当于第一稀释管1毫升） 11.0 14.0 13.0 17.0 22.0 28.0 24.0 35.0 54.0 92.0 160.0 >180.0 lgMPN 1.041 1.146 1.114 1.230 1.342 1.447 1.380 1.544 1.732 1.9 2.204 >2.255 附 录 B

（规范性附录） 常用检测培养基

B.1 营养肉汤琼脂培养基 B.1.1 成分

蛋白胨 牛肉膏 氯化钠(NaCl) 琼脂 蒸馏水 pH值 B.1.2 配制要点

将各种成分溶解于蒸馏水中，调节pH后加入琼脂，加热溶化后分装。121℃灭菌30 min。不耐高温需过滤除菌的成分，应在培养基灭菌后温度不高于50℃时加入。 B.2 阿须贝氏(Ashby) 培养基 B.2.1 成分

磷酸二氢钾(KH2PO4) 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 氯化钠(NaCl) 碳酸钙(CaCO3) 甘露醇(C6H14O6) 硫酸钙(CaSO4·2H2O) 琼脂 蒸馏水 pH值 B.2.2 配制要点

同B.1.2。 B.3 根瘤菌培养基

B.3.1 成分

磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 氯化钠(NaCl) 甘露醇(C6H14O6) 酵母浸膏或酵母浸粉 0.5%刚果红溶液 琼脂 蒸馏水

0.2 g 0.2 g 0.2 g 5.0 g 10.0 g 0.1 g 15~20 g 1 000 mL 6.8~7.0

10.0 g 3.0 g 5.0 g 15~20 g 1 000 mL 7.0~7.2

0.5 g 0.2 g 0.1 g 10.0 g

1.0 g或0.8 g 5.0 mL 15~20 g 1 000 mL

11

pH值 6.8~7.0 B.3.2 配制要点

将刚果红配制成0.5%的溶液，按量加入到其他成分中，其他同B.1.2。 B.4 硅酸盐细菌培养基

B.4.1 成分

蔗糖(C12H22O11) 5.0g 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 2.0 g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5 g 碳酸钙(CaCO3) 0.1 g 0.5%三氯化铁(FeCl3·6H2O)溶液 1.0 mL 琼脂 15~20 g 蒸馏水 1 000 mL pH值 7.2~7.4 B.4.2 配制要点

将三氯化铁配制成0.5%的溶液，按量加入到其他成分中，其他同B.1.2。 B.5 固氮(茎瘤)根瘤菌培养基

B.5.1 成分

乳酸钠(C3H5O3Na) 10.0 g 磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 1.67 g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.87 g 氯化钠(NaCl) 0.05 g 氯化钙(CaCl2·2H2O) 0.04 g 0.4%三氯化铁(FeCl3·6H2O)溶液 1.0 mL 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.1 g 酵母浸膏或酵母浸粉 1.0 g 或 0.8 g 琼脂 15~20 g 蒸馏水 1 000 mL pH 6.8~7.0 B.5.2 配制要点

将三氯化铁配制成0.4%的溶液，按量加入到其他成分中，其他同B.1.2。 B.6 马丁（Martin）培养基

B.6.1 成分

磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.0 g 葡萄糖(C6H12O6·H2O) 10.0 g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5 g 蛋白胨 5.0 g 1%孟加拉红水溶液 3.3 mL 琼脂 15~20 g 蒸馏水 1 000 mL B.6.2 配制要点

将孟加拉红配制成1%的水溶液，按量加入到其他成分中，其他同B.1.2。当需抑制细菌等原核微生物生长时，可添加氯霉素，氯霉素应先用几滴乙醇溶解后，加入到培养基中，使其终浓度达到0.01%。 B.7 改良高氏一号琼脂培养基 B.7.1 成分

钾(KNO3) 1.0 g 磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 0.5 g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5 g 氯化钠(NaCl) 0.5 g 硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 0.01 g 可溶性淀粉(C6H10O5)n 20.0 g 琼脂 15~20 g 蒸馏水 1 000 mL pH值 7.2~7.4 B.7.2 配制要点

将可溶性淀粉用适量冷水浸湿后缓慢加热，并轻轻搅拌调成糊状，再加入到其他成分中，其他同B.1.2。当需抑制细菌和真菌生长时，可添加重铬酸钾（K2Cr2O7），重铬酸钾先配制成5%的溶液，倒平板时再加入到培养基中，使其浓度达到0.005%。 B.8 联合固氮菌培养基

B.8.1 成分

D-葡萄糖酸钠(C6H11O7Na) 5.0 g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.4 g 磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 0.1 g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2 g

酵母浸膏或酵母浸粉 1.0 g 或 0.8 g 氯化钠(NaCl) 0.1 g 氯化钙(CaCl2·2H2O) 0.02 g 三氯化铁(FeCl3·6H2O) 0.01 g 0.2%钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)溶液 1.0 mL 琼脂 15~20 g 蒸馏水 1 000 mL pH值 6.8~7.0 B.8.2 配制要点

将钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)配制成0.2%的溶液，按量加入其他成分中，其他同B.1.2。 B.9 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）

B.9.1 成分

马铃薯 200 g 葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g 琼脂 15~20 g 蒸馏水 1 000 mL B.9.2 配制要点

称取去皮马铃薯200 g切成约1 cm3小块，放入适量蒸馏水中煮沸30 min，然后用双层纱布过滤取汁，再加葡萄糖和琼脂，加热溶化后补足水至1000 mL，分装，121℃灭菌30 min。当需抑制细菌等原核微生物生长时，可添加氯霉素，氯霉素应先用少量乙醇溶解后，加入到培养基中，使其终浓度达到0.01%。 B.10 乳酸细菌培养基（MRS） B.10.1 成分

蛋白胨 牛肉膏 酵母浸膏或酵母浸粉

10.0 g 10.0 g

5.0 g 或 4.0 g

13

柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7] 葡萄糖(C6H12O6·H2O) 吐温80 乙酸钠(CH3COONa·3H2O) 磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 硫酸锰(MnSO4·H2O) 琼脂 蒸馏水 pH值 B.10.2 配制要点

同B.1.2。 B.11 光合细菌培养基 B.11.1 成分

酵母浸膏或酵母浸粉 蛋白胨 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 氯化钙(CaCl2·2H2O) 蒸馏水 pH值 B.11.2 配制要点

同B.1.2。

B.12 固氮类芽孢杆菌培养基 B.12.1 成分

蔗糖

蛋白胨 酵母浸膏或酵母浸粉 氯化钠(NaCl) 碳酸钙(CaCO3) 磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 磷酸二氢钾(KH2PO4) 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 蒸馏水 琼脂 pH值 B.12.2 配制要点

同B.1.2。 B.13 LB培养基 B.13.1 成分

胰蛋白胨 酵母浸膏或酵母浸粉 氯化钠(NaCl) 琼脂 蒸馏水 pH值

2.0 g 20.0 g 1.0 mL 5.0 g 2.0 g 0.58 g 0.25 g 15~20 g 1 000 mL 6.2~6.6

3.0 g 或 2.4 g 3.0 g 0.5 g 0.3 g 1 000 mL 6.8~7.0

10.0 g 1.0 g

1.0 g 或 0.8 g 0.01 g 5.0 g 0.08 g 0.2 g 0.5 g 1 000 mL 15~20 g 7.2~7.4

10.0 g

5.0 g或4.0 g 10.0 g 15~20 g 1 000 mL 7.0~7.2

B.13.2 配制要点

同B.1.2。

15

附 录 C

（规范性附录）

微生物肥料中钾含量的测定 原子吸收分光光度计法

C.1 原理

试样经硫酸和过氧化氢消化，使其中的钾全部消解。消解液稀释后直接吸入空气——乙炔火焰中原子化，其中所产生的钾原子蒸汽吸收特定波长的光，在一定的浓度范围内其吸光度与钾浓度成正比，与标准系列比较定量。 C.2 试剂和材料

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T 6682二级水要求。 C.2.1 硫酸（ρ1.84）。 C.2.2 过氧化氢（30％）。

C.2.3 钾标准贮备溶液（ρ=1 000 mg/L，购国家标准溶液或用基准试剂配置）。

C.2.4 钾标准溶液（ρ=100 mg/L）：用单标线吸管准确吸取10 mL 1 000 mg/L钾标准贮备溶液于100 mL容量瓶中，用水定容，此溶液即浓度为100 mg/L 钾标准溶液。 C.3 仪器设备

实验室常用仪器设备。

C.3.1 原子吸收分光光度计：附钾空心阴极灯。 C.3.2 可调式电热板或电炉。 C.3.3 天平：感量0.1 mg。

C.3.4 高腰烧杯：容积150 mL或250 mL及相配的表面皿。 C.4 操作步骤

C.4.1 建立标准曲线方程

吸取0 mL，2.00 mL，5.00 mL，7.00 mL，10.00 mL，12.00 mL，15.00 mL钾标准溶液（100 mg/L）置于7个100 mL容量瓶中，用水定容、混匀，此溶液为1 mL含钾（K）0 μg、2.00 μg、5.00 μg，7.00 μg、10.00 μg、12.00 μg、15.00 μg的标准溶液系列。

调节仪器测定条件至适宜的灵敏度及较好稳定性，于波长766.5 nm处，依次吸入并测定各标准溶液吸光值，根据其钾浓度和吸光度建立标准曲线方程。 C.4.2 试样制备

将固体试样研磨过Φ0.5 mm试验筛，液体试样摇匀后待用。 C.4.3 试样消解

称取0.5 g（精确至0.000 1 g）试样，置于高腰烧杯中；用少量水冲洗沾附在瓶壁上的试样，加5.0 mL硫酸和1.5 mL过氧化氢，小心摇匀，盖上表面皿，放置过夜；在可调电炉上或电热板缓慢升温至硫酸冒烟，取下稍冷；加15滴过氧化氢，加热10 min，取下稍冷后分次再加5~10滴过氧化氢并继续消煮，直至

溶液呈无色或黄色清液。取下稍冷，小心加水20 mL~30 mL，加热至沸。取下冷却，用少量水多次冲洗表面皿，洗液收入原高腰烧杯中。移入250 mL容量瓶中，加水定容，静置澄清或用无磷滤纸过滤备用。空白对照除不称取试样外，均按上述步骤进行。每个试样需做两个平行。 C.4.4 待测溶液的测定

用刻度吸管准确吸取5 mL 澄清或已过滤待测溶液于50 mL容量瓶中，用水定容、混匀。吸取量可根据待测溶液中钾含量适当减少，使待测溶液的钾浓度处于标准曲线范围内。与标准曲线同样测试条件下测定待测溶液的吸光值，用标准曲线方程计算待测溶液钾浓度。 C.5 结果计算

钾含量以氧化钾（K2O）的质量分数w 计，数值以%表示，按式C.1计算：

w(10)VD1.20100 ............................ (C.1) 6m10式中：

ρ1 ——由标准曲线求得待测溶液钾浓度，单位为毫克每升（mg/L）； ρ0 ——由标准曲线求得空白对照钾浓度，单位为毫克每升（mg/L）； V ——消解试样所定容体积，本操作为250，单位为毫升（mL）； D ——稀释倍数，待测溶液定容体积/分取体积； m ——称取试样质量，单位为克（g）； 1.20 ——将K换算成K2O的因数； 106 ——将μg换算为g的因数。

计算结果保留至两位小数，数字修约与数据处理应符合GB/T 8170的规定。 C.6 允许差

取两次平行测定结果的算术平均值作为试样测定结果，两个平行测定结果允许绝对差值应符合表C.1要求。

表C.1 允许绝对差

钾含量（K2O） % K2O≤1.2 1.2＜K2O≤2.0 2.0＜K2O≤10.0 K2O＞10.0 允许差 % ≤0.07 ≤0.09 ≤0.20 ≤0.30 17

附 录 D

（资料性附录）

粪大肠菌群数测定流程及最可能数（MPN）检索表

D.1 粪大肠菌群数测定流程

样品 稀释 乳糖胆盐发酵管 44.5 ℃ ± 0.5 ℃，24 h ± 2 h 不产气不产酸 粪大肠菌群阴性 报告结果 革兰氏染色 产酸产气或只产酸 伊红美蓝琼脂平板 36 ℃ ± 1.0 ℃，18 ~ 24 h 乳糖发酵管 44.5 ℃ ± 0.5 ℃，24 h ± 2 h 革兰氏阳性 粪大肠菌群阴性 报告结果 革兰氏阴性 无芽孢杆菌 产气 不产气 粪大肠菌群阴性 报告结果 粪大肠菌群阳性 报告结果

D.2 粪大肠菌群数最可能数（MPN）检索表

表D.1 最可能数（MPN）检索表

阳 性 管 数 10 ×3 0 0 0 0 -1MPN 10 ×3 0 1 2 3 -395 % 可信限 下限 ﹤0.5 上限 9 10 ×3 0 0 0 0 -21 g（ mL ） ﹤3 3 6 9 表D.1（续）

阳 性 管 数 10 ×3 0 -1MPN 10 ×3 0 -395 % 可信限 下限 ﹤0.5 上限 13 10 ×3 1 -21 g（ mL ） 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 6 9 12 6 9 12 16 9 13 16 19 4 7 11 15 7 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29 9 14 20 26 15 20 27 34 3 7 44 1 3 36 37 3 36 1 3 23 36 ＜0.5 1 20 21 表D.1（续）

阳 性 管 数 10 ×3 2 2 2 2 -1MPN 10 ×3 0 1 2 3 -395 % 可信限 下限 4 10 上限 47 150 10 ×3 2 2 2 2 -21 g（ mL ） 21 28 35 42 19

阳 性 管 数 10 ×3 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 -1MPN 10 ×3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 -395 % 可信限 下限 上限 10 ×3 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 -21 g（ mL ） 29 36 44 53 23 39 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1 100 ≥ 2 400 4 7 15 120 130 380 7 14 30 210 230 380 15 30 350 380 440 470 36 71 150 1 300 2 400 4 800 注1：本表采用3个稀释度〔10-1、10-2和10-3〕，每稀释度3管。 注2：表内所列稀释浓度若改用10、10 和10 时，表内数字相应降低10倍；若改用10 、10 和10时，表内数字应相应增加10倍。其余可类推。 0-1-2-2-3-4 附 录 E

（规范性附录）

有机物料腐熟剂产品酶活力的测定

E.1 纤维素酶活力的测定——羧甲基纤维素钠（CMC）法 E.1.1 术语和定义 E.1.1.1

纤维素酶活力单位 cellulase activity unit

在50℃和pH 5.0条件下，1g(mL)样品1 min降解羧甲基纤维素钠产生1 μg葡萄糖所需的酶量，定义为1个酶活力单位，以U/g (mL)表示。 E.1.2 原理

用羧甲基纤维素钠（CMC）作底物，经纤维素酶水解后生成还原糖；3，5-二硝基水杨酸（DNS）是一种氧化剂，能与还原糖作用，使硝基还原成氨基，溶液变为橙色，橙色的深度与还原糖的浓度成正比。可采用比色法测定还原糖的含量，进而从还原糖的数量来计算纤维素酶活力。 E.1.3 试剂和溶液

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T 6682三级水要求。 E.1.3.1 葡萄糖标准溶液：ρ（C6H12O6）= 1 mg/mL。

将葡萄糖（C6H12O6）于105 ℃下干燥至恒重，称取0.1 g（精确到0.001 g）于100 mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100 mL容量瓶中用蒸馏水定容，充分混匀。4 ℃冰箱保存，有效期14 d。 E.1.3.2 pH 5.0的柠檬酸缓冲液：ρ（C6H8O7）= 0.05 mol/L。

A液（0.1 mol/L柠檬酸溶液）：称取21.014 g柠檬酸（C6H8O7·H2O），用少量蒸馏水溶解后，移入1 000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，充分混匀。

B液（0.1 mol/L柠檬酸钠溶液）：称取29.412 g柠檬酸钠，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，充分混匀。

取205 mL A液，295 mL B液，充分混匀并用适量A液或B液调节pH至5.0，移入1 000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，即为0.05 mol/L pH 5.0的柠檬酸缓冲液。 E.1.3.3 氢氧化钠溶液：c（NaOH）= 2 mol/L。

称取 8 g 氢氧化钠（NaOH），溶解于100 mL蒸馏水中。 E.1.3.4 3,5二硝基水杨酸（DNS）溶液。

称取6.3 g 3,5-二硝基水杨酸 (DNS)于500 mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入 262 mL 氢氧化钠溶液（2 mol/L），再将其倒入 500 mL 含有 185 g 酒石酸钾钠的热水溶液中，然后加5.0 g结晶苯酚、5.0 g无水亚硫酸钠，搅拌均匀至溶解，冷却后移入1 000 mL容量瓶中定容，充分混匀。储存于棕色瓶中，室温放置 7 d 后使用，有效期6个月。 E.1.3.5 0.51%羧甲基纤维素钠（CMC）溶液。

21

称取0.51 g羧甲基纤维素钠（CMC）于100 mL烧杯中，加入适量 0.05 mol/L pH 5.0的柠檬酸缓冲液，加热溶解后移入100 mL容量瓶中，并用0.05 mol/L pH 5.0的柠檬酸缓冲液定容至100 mL，用前充分摇匀。4 ℃冰箱中保存备用，有效期3 d。 E.1.4 仪器设备

实验室常用仪器设备。 E.1.4.1 分光光度计。

E.1.4.2 电子天平：感量为0.1 mg。 E.1.4.3 恒温水浴锅：50 ℃±0.2 ℃。 E.1.4.4 离心机。 E.1.4.5 粉碎机或研钵。 E.1.4.6 试验筛：Φ2.0 mm。 E.1.4.7 具塞刻度试管：20.0 mL。 E.1.5 分析步骤

E.1.5.1 建立葡萄糖标准曲线方程

取7支洗净干燥的20 mL具塞刻度试管，编好号后按表E.1加入葡萄糖溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液，摇匀。向各试管中加入1.5 mL DNS溶液，摇匀后沸水浴5 min，取出冷却后用蒸馏水定容至20.0 mL，混匀；在540 nm波长下，依次测定各管的吸光度。以葡萄糖含量（μg）为纵坐标，以对应的吸光度为横坐标，建立线性回归方程。

表E.1 配置不同浓度的葡萄糖溶液

管号 葡萄糖标准溶液加入量 mL 1 2 3 4 5 6 7 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水 mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 葡萄糖含量 μg 0 200 400 600 800 1 000 1 200 E.1.5.2 待测酶液的制备

固体试样应粉碎过Φ2.0 mm试验筛，液体试样应充分混合均匀。称取 5.0 g（精确至0.001 g）固体试样或准确吸取 5.0 mL液体试样，加入装有 50 mL（固体试样）或45 mL（液体试样）pH 5.0柠檬酸缓冲液且带有玻璃珠的150 mL锥形瓶中，在振荡器上200 r/min振荡30 min，吸取适量悬液以3 000 × g 离心力离心3 min~5 min；离心后的上清液即为待测酶液。每个试样需做两个平行。 E.1.5.3 纤维素酶活力测定

E.1.5.3.1 将待测酶液放入50 ℃恒温水浴中，预热5 min。

E.1.5.3.2 吸取1.5 mL 0.51%羧甲基纤维素钠（CMC）溶液放入20 mL具塞刻度试管中，加入1.5 mL DNS溶液，在50 ℃水浴中预热5 min。加入0.5 mL待测酶液，充分摇匀，在50 ℃水浴中反应30 min后立即取出，即为空白管。

E.1.5.3.3 吸取1.5 mL 0.51%羧甲基纤维素钠（CMC）溶液放入20 mL具塞刻度试管中，50 ℃水浴中预热5 min。加入0.5 mL待测酶液，充分摇匀，在50 ℃水浴中反应30 min后立即取出，加入1.5 mL DNS溶液，混合均匀，即为试样管。

E.1.5.3.4 将试样管和空白管同时沸水浴5 min，取出后快速冷却，用蒸馏水定容至20.0 mL，充分摇匀。

E.1.5.3.5 在分光光度计540 nm波长下，以空白管溶液调节仪器零点，并测定试样管溶液的吸光度。若其吸光值超出标准曲线范围，应根据酶活力大小将待测酶液稀释至适当浓度后按上述步骤重新测定。 E.1.6 纤维素酶活力计算

纤维素酶活力以质量纤维素酶活力Xm或体积纤维素酶活力Xv计，数值以酶活力单位每克（U/g)或酶活力单位每毫升（U/ mL）表示，按式E.1或E.2计算：

（AKb)V1DXm ................................ (E.1)

V2m30（AKb)V1DXv ................................ (E.2)

V2V30式中：

A ——试样吸光度； K ——标准曲线斜率； b ——标准曲线截距；

V1 ——酶液定容体积，本操作为50，单位为毫升（mL）； V2 ——反应液中待测酶液加入量，单位为毫升（mL）； m ——试样质量，单位为克（g）； V ——试样体积，单位为毫升（mL）； D ——待测酶液的稀释倍数；

30 ——反应时间30 min（以1 min计酶活）。

计算结果保留至一位小数，数字修约与数据处理应符合GB/T 8170的规定。

E.1.7 允许差

取两次平行测定结果的算术平均值作为试样测定结果，平行测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。

E.2 蛋白酶活力的测定——福林法 E.2.1 术语和定义 E.2.2.1

蛋白酶活力单位 proteinase activity unit

在40℃和pH 7.5条件下，1g(mL)样品1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸所需的酶量，定义为1个酶活力单位，以U/g (mL)表示。 E.2.2 原理

蛋白酶在一定的温度与pH下，水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计于波长680 nm下测定溶液的吸光度。酶活力与吸光度成比例，由此可以计算蛋白酶活力。

23

E.2.3 试剂和溶液

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T 6682三级水要求。 E.2.3.1 福林试剂。

于2000 mL磨口回流装置中加入100 g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、25 g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）、700 mL水、50 mL磷酸（85%）、100 mL浓盐酸，小火沸腾回流10 h，取下回流冷却器，在通风厨中加入50 g硫酸锂（Li2SO4）、50 mL水和数滴浓溴水（99%），再微沸15 min，以除去多余的溴水（冷却后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000 mL。混匀，过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。或使用商品福林试剂。 E.2.3.2 福林使用液。

1份福林试剂与2份水混合，摇匀。

E.2.3.3 碳酸钠溶液：с（Na2CO3）=0.4 mol/L。

称取42.4 g无水碳酸钠（Na2CO3），用水溶解并定容至1 000 mL。 E.2.3.4 三氯乙酸（CCl3·COOH）溶液：с（CCl3·COOH）=0.4 mol/L。

称取65.4 g三氯乙酸，用水溶解并定容至1 000 mL。 E.2.3.5 氢氧化钠溶液：с（NaOH）=0.5 mol/L。

称取110 g氢氧化钠，溶于100 mL无二氧化碳的水中，摇匀，注入密闭容器中，放置至溶液清亮。取27 mL清液，用无二氧化碳水稀释至1 000 mL，摇匀。 E.2.3.6 盐酸溶液：с（HCl）=1 mol/L及0.1 mol/L。

各量取90 mL、9 mL浓盐酸，分别注入去离子水，定容至1 000 mL，摇匀。 E.2.3.7 磷酸缓冲液（pH=7.5）。

称取6.02 g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和0.5 g磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O），加水溶解并定容至1 000 mL。

E.2.3.8 酪素溶液：ρ = 10 g/L。

称取1 g（精确至0.001 g）酪素，用少量0.5 mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入约80 mL磷酸缓冲液，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后用磷酸缓冲液定容至100 mL。在4℃保存，有效期为3 d。

E.2.3.9 L-酪氨酸标准溶液：ρ = 100 μg/mL。

称0.100 0 g（精确至0.000 2 g）取预先于105 ℃干燥至恒重的L-酪氨酸，用60 mL盐酸溶液（1 mol/L）溶解后定容至100 mL，为1mg/mL酪氨酸标准溶液。吸取10.00 mL酪氨酸标准溶液（1mg/mL），用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL即得到100 μg/mL L-酪氨酸标准溶液。 E.2.4 仪器设备

实验室常用仪器设备。 E.2.4.1 分光光度计。

E.2.4.2 电子天平：感量为0.1 mg。 E.2.4.3 恒温水浴锅：40 ℃±0.2 ℃。 E.2.4.4 离心机。

E.2.4.5 粉碎机或研钵。 E.2.4.6 试验筛：Φ2.0 mm。 E.2.5 分析步骤

E.2.5.1 建立标准曲线方程

按表E.2配制L-酪氨酸溶液。

表E.2 配置不同浓度的L-酪氨酸溶液

管号 1 2 3 4 5 6 L-酪氨酸标准溶液的浓度，μg/mL 0 10 20 30 40 50 100 μg/mL L-酪氨酸 标准溶液的体积，mL 0 1 2 3 4 5 水的体积， mL 10 9 8 7 6 5 设两次重复，分取1.00 mL上述溶液，各加5.00 mL碳酸钠溶液（0.4 mol/L）、1.00 mL福林试剂使用溶液，置于40℃恒温水浴中显色20 min后取出。

在分光光度计680 nm波长下，以不含酪氨酸的管1为空白，调节仪器零点，分别测定管2至管6的吸光度。以两次重复的吸光度平均值为横坐标，酪氨酸浓度为纵坐标，建立标准曲线。 E.2.5.2 待测酶液的制备

固体试样应粉碎过 Φ2.0 mm 试验筛，液体试样应充分混合均匀。称取 5.0 g（精确至0.001 g）试样或准确吸取 5.0 mL液体试样，加入装有 50 mL（固体试样）或45 mL（液体试样）pH 7.5磷酸缓冲液且带玻璃珠的150 mL锥形瓶中，在振荡器上200 r/min振荡30 min，吸取适量混合液以3 000 × g离心力离心3 min~5 min；离心后的上清液即为待测酶液。每个试样需做两个平行。 E.2.6 蛋白酶活力测定

E.2.6.1 将酪素溶液放入40 ℃水浴中，预热5 min。

E.2.6.2 吸取1.0 mL待测酶液放入试管中，加入2.0 mL三氯乙酸，摇匀，于40 ℃水浴中反应30 min，再加1.0 mL酪素溶液，摇匀后于3 000 × g离心5 min。取1.0 mL上清液加入另一试管中，再依次加入5.0 mL碳酸钠溶液、1.0 mL福林试剂使用液，置于40 ℃水浴中显色20 min后取出，即为空白管。

E.2.6.3 吸取1.0 mL待测酶液放入试管中，置于40 ℃水浴中2 min。加入1.0 mL预热后的酪素溶液，摇匀，于40 ℃水浴中反应30 min，取出后立即加入2.0 mL三氯乙酸，摇匀，于3 000 × g离心5 min。取1.0 mL上清液加入另一试管中，再依次加入5.0 mL碳酸钠溶液、1.0 mL福林试剂使用液，置于40℃水浴中显色20 min后取出，即为试样管。

E.2.6.4 在分光光度计680 nm波长下，以空白管溶液调节仪器零点，测定试样管溶液的吸光度。若其吸光值超出标准曲线范围，应根据酶活力大小将待测酶液稀释至适当浓度后按上述步骤重新测定。 E.2.7 蛋白酶活力计算

蛋白酶酶活力以质量蛋白酶活力Xm或体积蛋白酶活力Xv计，数值以酶活力单位每克（U/g)或酶活力单位每毫升（U/ mL）表示，按式E.3或E.4计算：

（AKb)4V1DXm ............................... (E.3)

m30（AKb)4V1D ............................... (E.4) XvV3025

式中：

A ——试样吸光度； K ——标准曲线斜率； b ——标准曲线截距；

4 ——反应液的总体积，单位为毫升（mL）；

V1 ——酶液定容体积，本操作为50，单位为毫升（mL）； m ——试样质量，单位为克（g）； V ——试样体积，单位为毫升（mL）； D ——待测酶液的稀释倍数；

30 ——反应时间30 min（以1 min计酶活）。

计算结果表示到小数点后一位，数字修约与数据处理应符合GB/T 8170的规定。 E.2.8 允许差

取两次平行测定结果的算术平均值作为试样测定结果，平行测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。

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