作物研究（CROPRESEARCH)
2018,2(2) ：131 -134
拟南芥防御素基因2启动子与GUS
重组载体的构建与转化
刘志霞1周舟S蔡薇1程姣U壬春梅1,4
(1湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128; 2作物基因工程湖南省重点实验室，长沙410128)2基因在植物的防御系统中扮演着重要的角色，其编码产生的植物防御素参与了植物对真菌人侵、 病毒感染、不良环境等逆境胁迫的防御反应。试验利用从拟南芥中通过PCR扩增和克隆的该基因启动子构建 GUS报告基因的表达载体，通过根癌农杆菌浸渍转化法将表达报告基因转人拟南芥中，筛选获得了转化植株。获 得以下主要结果:（1)成功克隆了拟南芥2基因的启动子并将其与带GUS标记基因的载体进行了融合，得 到了重组的融合载体;（2)成功的将带GUS标记基因的拟南芥2基因启动子融合载体转人到拟南芥植株中 并利用其自带抗性标记筛选到了抗性植株;（3)利用GUS染色技术检测了转基因植株中2基因启动子的表 达情况。
关键词:载体构建;2基因;克隆;转化 中图分类号：Q785 文献标识码:A文章编号= 1001-5280(2018)02~0131-04 DOI ：10. 16848/j. cnki. issn. 1001-5280. 2018. 02. 10
摘要:
Construction and Transformation of Recombinant Plasmid
of Pl^nt Defensins Gene PDF1. 2 Promoter
and GUS Gene in Arabidopsis thalisina
LIU Zhixia1,ZHOU Zhou1,CAI Wei1,CHEN Jiao1,REN Chunmei1’2*
(1 College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128 , China；2 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province ,Changsha,Hunan 410128，China)
Abstract ：PZ)Fi. 2 gene plays an important role in plant defense systems, the plant defensins encoded by participates in plant
defensive response against to
ronment conditions. The promoter of
PDF1. 2 gene
was
Arabidopsis
the expression vector of GUS reporter gene in this experiment, then the expression reporter gene was transformed into Arabidopsis through agrobacterium tumefaciens transformation method and the transformed plants was obtained by screening. The main results were showed as follows：. The promoter of Arabidopsis PDF1. 2 gene was successfully cloned and fused with
gene
that amplified
and
cloned by PCR from
the vector carrying GUS report gene to obtain a recombinant fusion vector；. The reconstructive vector was transferred into
and the transgenic plants were screened successfully；. The expression of the promoter of 1. 2
PDF1. 2
adversity stress such as fungal invasion, viral infection and
used
ArabidopsisthalianaPDF
gene in transgenic plants was detected by GUS staining.
Keywords ： vector construction ； 1. 2 gene ； clone ； transformation
PDF
收稿日期：2018-01-16
作者简介:刘志霞（1997 -)女，163.
Email:1026802351@qq.cm。周舟为并列第一作者。*通信作者：任春梅，教授，Email:rncm66@
CB160308)。
com。
基金项目：国家科技部“973”前期研究项目（2014
132
作物研究（CROP RESEARCH)
2018年3月
PDW. 2基因是一个广泛存在于植物中与抗逆
相关的基因[14]。由于其参与植物体内众多的防御 反应，近年来一直受到广泛的关注和研究。目前人 们已经从许多不同的植物中克隆出了该基因，如拟 南芥、小麦、棉花等[〜7]。在植物体内，2基因主要功能是编码产 生一类名为植物防御素的抗性蛋白。植物防御素不 仅能抑制真菌的生长，同时也能在一定程度上抑制 细菌的生长，抑制酶的活性，这些独特的生物学特性 使得植物防御素能有效的帮助植物抵抗来自于各种 不利条件如真菌入侵、病毒感染、不良环境等逆境胁 迫的侵害[8~10]。然而目前对于防御素提高植物抗 性的作用机制并不是很明确。因此，利用基因工程 技术研究2基因的表达模式对于了解防御素 的作用机制具有十分重要的意义。
由于具有操作简单、反应快速、检测准确、技术 成熟等优点，将目的基因的启动子与GUS基因融合 并转化植物，对转基因植物进行GUS染色，通过观 察GUS蛋白在转基因植物中不同器官及组织的表 达来研究目的基因的表达模式是基因工程常用的技 术之一。如胡佳等人利用GUS基因作为显色基因 来研究拟南芥叶片中油体含量[11];张鑫平等人利用
GUS染色技术来分析拟南芥和油菜花药的特异性
表达[12]。因此，本试验中选择GUS基因作为报告 基因来构建2基因启动子的重组载体。1材料与方法1.1
实验材料
实验所用拟南芥（la似
)野生型
Col - 0 ,大肠杆菌(&c/ieric/iia co/i) DH5a,根癌农杆
菌{ Agro bacterium tumefactions )
GV3101，载体
PCAMBIA1301等都由作物基因工程湖南省重点实
验室植物信号传导课题组提供。1. 2
植株培养条件
将拟南芥种子置于消毒液(20% bleach +0. 1%
Trit〇nl00)中浸泡10 ~ 15 min，于超净工作台上用无
菌水冲洗4〜5遍，适当密度播撒在MS固体培养基 上，4°C春化3 d，转入光照培养室22°C长日照（16 h 光照/8 h黑暗）培养。长至7 d时，将其转入营养土 (东北黑土与蛭石的体积比为1 1)中，盖上透明塑
料薄盖1 ~2 d。
1.3载体的构建
在TAIR网上查询拟南芥PDW. 2基因并选取 上游启动子区域序列，用在线软件Plantcare对其进 行启动子元件分析。利用Primer Premier 5. 0引物 设计软件设计1对扩增引物PDF1. 2 - F/PDF1. 2 -
R，在引物5^端分别加上Pst I和Nco I酶切位点，扩
增引物序列为：PDF1. 2 - F：5, - AACTGCAGTAGATCAGGCAG
CCTTTC - 3乂下划线处为酶切位点Ps I )
PDF1. 2 - R：5, - CATGCCATGGGGAAGCAAAC TT - 3 ^下划线处为酶切位点Nc I )
用SDS法提取拟南芥总DNA，以此为模板，用 引物PDF1. 2 - F/PDF1. 2 - R进行PCR扩增，琼脂 糖凝胶电泳后回收目的片段并纯化。将回收纯化后 的目的片段和PCAMBIA1301载体用Pst I和Nco I 性内切酶在37°C下过夜双酶切，将得到的目的 片段和目的载体进行回收。用T4连接酶将
W3W. 2基因启动子连接至pCAMBIA1301载体的
预期位点。通过热激法将重组表达载体转化至大肠 杆菌DH5a，挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定，正确 的进行测序鉴定。1.4表达载体的遗传转化
挑选测序正确的重组质粒，通过电击法转化到 根癌农杆菌GV3101中，将转化液置于含有卡那霉 素(50 mg/L)、庆大霉素（100 mg/L)、利福平（50
mg/L)的YEB固体培养基上28°C黑暗过夜培养，挑
取阳性菌进行扩大培养。采用浸花法转化拟南芥 Col -0野生型。收获T代种子播种于含有潮霉素 (25 m/L)的MS固体培养基上，长日照条件下培养
2周后将抗性植株移栽至营养土中正常生长。1.5 GUS染色
GUS染色液配制:将X- glue溶于磷酸钠缓冲
液中（含100 mm〇l/L pH 7.0的磷酸钠缓冲液，10
mmol/L EDTA,5 mmol/L 铁氛化钟,5 mmol/L 亚铁
），终浓度为1 mmol/L。
挑选长日照条件下生长7d的抗性植株浸入
GUS染色液中，37°C避光过夜。用不同浓度酒精脱
色，显微镜下观察染色情况。2
结果与分析
21目的片段克隆
在Plantccre网
站
对
2基因起始密码子
第32卷第2期
刘志霞等:拟南芥防御素基因raw. 2启动子与GUS重组载体的构建与转化
133
ATG上游约2000 bP左右的启动子序列进行分析，
正确菌落进行测序鉴定，通过序列比对保留目的片 段大小正确、无移码突变现象、且连接处与预期位置 相符的样本进行遗传转化。
2. 3 pPDFl. 2: : GUS重组表达载体的遗传转化通过电击法将转化正确的重组质粒转人农杆菌
细胞中，利用PCR来检测转人情况，结果如图3所 示。在转人质粒的农杆菌样本中成功检测到大小为 2000 左右与目的片段大小相似的条带，证明重 结果发现其中包含了大量核心启动子元件了人丁八-
box、CAAT - box,进一步分析发现其还含有部分与
生物胁迫相关的顺式原件。这一结果表明该段
2基因启动子序列能正常启动该基因的表 达，且
2基因在植物的抗逆和抗病等方面起
到重要作用。
以拟南芥野生型基因组DNA为模板，利用引物
PDF1. 2 - F/PDF1. 2 - R进行扩增，并利用电泳检测
扩增片段，结果如图1所示。所得扩增片段大小约 2000 bp左右，与预期大小相符，且没有非特异性扩 增条带。这一结果表明目的片段克隆成功，PCR产 物可用于下一步实验。
M
1 2
3000
bp 2000
bp
M为Marker(5K) ;Line1为仙打.2基因启动子片段;
Line2为未加DNA模板的对照组。
图1 PDF1.2基因启动子PCR扩增结果 Fig. 1 PCR result of PDF
1. 2 promoter
2. 2重组表达载体构建
将扩增所得目的片段与带有报告基因GUS的
PCAMBIA1301载体进行酶切并用T4连接酶连接，
将PPDF1. 2: : GUS重组表达载体通过热激法转化至 大肠杆菌DH5a。下一步挑选阳性菌进行菌落PCR 来检测转化结果，如图2所示。2〜5号样本中，转 化成功的菌落成功的检测到目的片段，转化未成功 样本无法检测到目的片段。进一步对检测成功的菌
落样本进行Pst I和Nco I双酶切验证。挑取检测
1
2
3
4
5
Line1为Marker(5K) ;Line2 ~5为菌落PCR。
图2菌落PCR结果
Fig. 2 PCR result of recombinant colonies
bp组质粒成功转人到农杆菌中。
挑选转人成功的农杆菌进行扩大培养，采用浸 花法将农杆菌的重组表达载体转人拟南芥CO -0 野生型植株中。利用载体上的潮霉素抗性标记基因 对转基因植株种子进行筛选，结果如图4所示。转 人成功的植株带潮霉素抗性，在含2 mg/L潮霉素
MS固体培养基上正常生长，未成功转人的植株则
在潮霉素培养基上无法正常生长。
1
2
3
4
5
2000
bp
Line1为Marker(2K) ;Line2 ~5为农杆菌阳性克隆。
图3农杆菌菌落PCR
Fig. 3 PCR of agrobacterium colony
Fig. 4 Resistance screening of transgenic plants
2.4 GUS染色检测转基因植株
为了检测重组载体是否成功转人拟南芥植株
中，将通过PCR鉴定的转基因植株种子铺种在含有2 m/L潮霉素的MS培养基上，长日照条件下生长
134
作物研究（CROP RESEARCH)
2018年3月
7 d。挑选无菌的幼苗进行GUS组织化学染色，利 用体式显微镜观察染色结果，如图5所示。转入
PCAMBIA1301质粒（含有35S启动子）的阳性对照
幼苗中，GUS基因在根、茎、叶等器官中都高度表 达;未转入GUS基因的阴性对照幼苗中，GUS基因 没有任何表达;在转入拟南芥PDF1. 2基因启动子 与GUS融合重组载体的转基因植株中，GUS基因在 根中有少量表达，在下胚轴及子叶中有较强的表达， 在真叶叶柄部位有表达而在叶片上没有表达。
GUS阳性对照 GUS阴性对照 转基因植株
图5转基因植株GUS染色表型
Fig. 5 The GUS staining phenotype of transgenic plants
3
结论与讨论
本研究成功克隆了 raw. 2基因启动子片段并 成功构建了
2基因启动子与GUS重组载体，
同时利用农杆菌浸渍转化法将重组载体转入拟南芥 植株中并对转基因植株进行了 GUS染色验证。本 实验结果为进一步研究raw. 2基因在植物体内的 表达以及植物防御素的作用机制打下基础。
随着科学技术的发展，在现代农业生产中，利用 高效、天然、无害的杀菌剂来代替传统的化学杀虫剂 帮助植物抵御外界病虫害及各种逆境的危害是一种 趋势。植物体内raw. 2基因所编码的植物防御素 由于其具有广谱的杀菌活性，能抑制多种细菌及真 菌的生长，同时对动植物细胞无明显的毒性的特点， 使其成为代替传统化学杀虫剂的选择之一。研究 PDW. 2基因的表达模式有利于了解植物防御素的 作用机制。基因的表达受到启动子、终止子等众多 原件的，启动子决定了基因转录的起始位点以 及转录频率，对基因的表达起到了十分重要的作用。 因此构建P^W. 2基因启动子重组载体对于研究
PDW. 2基因的表达模式以及植物防御素的作用机
制是很有必要的。
GUS染色的结果显示，拟南芥PDW7. 2启动子 与GUS基因的融合重组载体成功的转入了拟南芥 野生型中。在转基因植株中，
2基因在下胚
轴及子叶中有较强的表达，说明2基因所参
与和介导的防御途径在下胚轴及子叶中比较活跃;
在真叶叶片上没有表达，说明PDW7. 2基因所参与 和介导的防御途径在这一时期的真叶叶片中未被激 活。PDW7. 2基因在根、叶片、下胚轴等部位的表达 差异，说明了植物防御素在拟南芥不同组织和部位 存在着特异性的表达，然而这种特异性的表达有待 于进一步研究。参考文献：
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