一种松材线虫的形态和分子联合检测方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111057770 A(43)申请公布日 2020.04.24

(21)申请号 201911107975.3(22)申请日 2019.11.13

(71)申请人 重庆师范大学

地址 400047 重庆市沙坪坝区天陈路12号(72)发明人 陈斌　袁缓　司风玲　闫振天　(74)专利代理机构 北京盛凡智荣知识产权代理

有限公司 11616

代理人 戴秀秀(51)Int.Cl.

C12Q 1/6888(2018.01)C12Q 1/686(2018.01)G01N 21/84(2006.01)

权利要求书2页 说明书11页 附图3页

(54)发明名称

一种松材线虫的形态和分子联合检测方法(57)摘要

本发明属于形态和分子联合检测技术领域，公开了一种松材线虫的形态和分子联合检测方法，包括样品的分离、松材线虫的形态学检测、松材线虫的分子检测。本发明设计了简易的松材线虫分离装置；采用口针的有无对腐生线虫和伞滑刃属线虫进行区分，根据松材线虫和拟松材线虫雌成虫尾部及尾尖突形状差异进行形态鉴定；采用特异PCR技术对伞滑刃属线虫、松材线虫和拟松材线虫进行分子鉴定；设计了完整的检测技术体系细节。本发明在DNA的提取时对同个松材样品进行3次重复取样，避免了取样时的偶然性检测误差。本发明满足了林业工作者快速、高效和准确的松材线虫检测需要，为林业部门松材线虫病普查提供了及时、可靠的检测手段与技术保障。

CN 111057770 ACN 111057770 A

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1.一种松材线虫的形态和分子联合检测方法，其内容包括样品的分离、松材线虫的形态学检测、松材线虫的分子检测、技术操作规范；基于形态特征，采用口针的有无对腐生线虫和伞滑刃属线虫进行区分，根据松材线虫雌虫尾部及尾尖突形状这一相对稳定的特征区别拟松材线虫进行形态鉴定；基于形态鉴定，采用特异PCR技术同时对伞滑刃属线虫、松材线虫和拟松材线虫进行分子鉴定。

2.如权利要求1所述的松材线虫的形态和分子联合检测方法，其特征在于，所述样品的分离包括以下步骤：

(1)样品的处理：病木样品为圆盘或长条状心材，用利斧将样品削成拇指指节大小的木块，将每个样品收集100～200g，用自封袋装好并贴好标签纸备用；

(2)分离方法：在贝尔曼漏斗法的基础上结合现有的实验设备自主设计的简易分离装置。

3.如权利要求2所述的松材线虫的形态和分子联合检测方法，其特征在于，所述利用简易装置对松材线虫的分离方法如下：

1)置备一个直径10～15cm的玻璃漏斗，玻璃漏斗末端接上一段长15cm的橡胶管，置于自制的漏斗架上，在具橡胶管末端5cm处夹上一个止水夹；在橡胶管末端下方放置一个50ml的小烧杯防止漏斗中液体滴漏；

2)在漏斗内放置定性滤纸并用少量蒸馏水润湿，将100～200g样品放置在漏斗中，并用蒸馏水将样品淹没，并在漏斗外缘贴好样本信息标签；

3)在室温条件下充分浸泡12～24h后，用50ml离心管置于橡胶管下接取20ml的下层液体，并在离心管外贴好标签；

4)将3)分离得到的液体置于冷冻离心机-4℃，5000r/min下离心3min，然后弃上清液，取下层液体分装于3个2ml的离心管中置于高速微量离心机126000r/min中离心30S，弃上清液；

5)在步骤4)得到的3个离心管中，选取2个离心管分别各添加1ml蒸馏水，分别用于形态学检测与分子检测，另1个离心管添加1ml 95％的酒精保存于-20℃的冰箱作为标本保存。

4.如权利要求1所述的松材线虫的形态和分子联合检测方法，其特征在于，所述松材线虫的形态学检测方法包括以下步骤：

步骤一，取一干净的载玻片置于光学显微镜载物台上，并在载玻片的滴一滴蒸馏水，另取分离样品中蒸馏水保存的一个离心管，用移液吸取线虫分离液20ul滴于蒸馏水中；

步骤二，在5.6*10倍光学显微镜下观察是否有松材线虫或疑似松材线虫；若有，则挑取10条制作成临时装片贴好标签，置于高倍显微镜下观察线虫的形态特征是否为松材线虫的形态特征。

5.如权利要求1所述的松材线虫的形态和分子联合检测方法，其特征在于，所述松材线虫的分子检测方法包括：线虫DNA的提取、特异PCR扩增。

6.如权利要求5所述的松材线虫的形态和分子联合检测方法，其特征在于，松材线虫分子检测中，所述线虫DNA的提取包括以下步骤：

1)取一干净的载玻片置于光学显微镜载物台上，并在载玻片的滴一滴蒸馏水，另取一管保留在蒸馏水中的样品，用移液吸取线虫分离液20ul滴于蒸馏水中；

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CN 111057770 A

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2)在光学显微镜下挑取3头线虫于2ml的离心管中，用100ul的移液加20ul蒸馏水，每个样品做3个重复实验；

3)在上述2)得到的20ul的样品中加入10X chelex 20ul细胞裂解液，再向管中加入4ul 1mg/ml蛋白酶K，斡旋瞬时离心使样品充解；将离心管迅速放入-70℃冰箱保存10min或-20℃保存2h；将离心管迅速置于55℃水浴锅中水浴4～24h，以降解DNase；随后放入95℃水浴3min后取出，以变性蛋白酶K；

4)取步骤3)得到的DNA悬浮液2ul直接做特异PCR或放于-20℃保存备用。7.如权利要求5所述的松材线虫的形态和分子联合检测方法，其特征在于，松材线虫分子检测中，所述特异PCR扩增包括以下步骤：

1)PCR引物：该特异PCR反应体系运用了5种引物：

选择松材线虫的rDNA作为特异PCR鉴定的目标序列，在ITS1区设计松材线虫的特异性引物F1和拟松材线虫的特异性引物F2，在5.8S区设计松材线虫和拟松材线虫的通用引物R1；引物F1与引物R1配对特异性扩增松材线虫ITS1-5.8S区，引物F2和引物R1配对特异性扩增拟松材线虫的ITS1-5.8S区；

2)在ITS1和5.8S区分别设计伞滑刃属线虫特异性引物BF和BR；引物BF与引物BR配对特异性扩增所有伞滑刃属线虫的ITS1-5.8S区；

3)上述1)的特异PCR反应体系包括：2x ES Taq MasterMix(Dye)12.5ul，模板DNA(10ng/ul)2ul，引物F1和F2各1ul，引物R1 2ul，ddH2O 6.5ul；

上述2)的特异PCR反应体系包括：2x ES Taq MasterMix(Dye)12.5ul，模板DNA(10ng/ul)2ul，引物BF和BR各1ul，ddH2O 8.5ul；

PCR反应条件如下：95℃预变性3min；然后按95℃变性30S，51℃退火30S，72℃延伸1min，重复35个循环；最后72℃延伸10min，反应产物在4℃保存；

4)制胶：按2％w/v比例称取琼脂糖，加入1X TAE缓冲液，放入微波炉加热至琼脂糖完全融化没有白色颗粒；插好制胶板，将溶解好的胶液倒入制胶板中凝固；

5)取扩增好的特异PCR产物各3ul上样于2％的琼脂糖凝胶泳道，另点一道DNAMaker作为标记，再点一道已确定有松材线虫的模板样作为参考；

6)电泳：将点好样品的胶块放入小型电泳槽，在100V电压下电泳至样品跑至胶块的1/2～2/3处后停止电泳；

7)将跑好的凝胶放入EB溶液中浸泡3min染色后，放在清水中清洗胶块表面残留的EB染液；

8)将胶块放入凝胶成像系统，观察电泳条带，拍照。

8.如权利要求7所述的松材线虫的形态和分子联合检测方法，其特征在于，5种引物包括：

引物SEQ ID NO.1：F1(5’-GATGATGCGATTGGTGACT-3’)；引物SEQ ID NO.2：F2(5’-TGCGCTGCGTTGAGTCGA-3’)；引物SEQ ID NO.3：R1(5’-CAATTCACTGGGTTCTTC-3’)；引物SEQ ID NO.4：BF(5’-CGTAACAAGGTAGCCGTAGGTG-3)；引物SEQ ID NO.5：BR(5’-GCGCAATATGCATTCAAAAACAT-3’)。

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一种松材线虫的形态和分子联合检测方法

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技术领域

[0001]本发明属于形态和分子联合检测技术领域，尤其涉及一种松材线虫的形态 和分子联合检测方法。

背景技术

[0002]目前，最接近的现有技术：

[0003]松材线虫隶属于线虫动物门(Aschelminthes)、线虫纲(Nematoda)、滑刃目 (Aphelenchina)、滑刃科(Aphelenchoididae)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)，目前伞 滑刃属约有80多种。伞滑刃属的线虫多寄生在昆虫体内，和松树死亡有关的种 主要是松材线虫和拟松材线虫，松材线虫和拟松材线虫的形态特征非常相似。 其主要区别在于雌虫的尾部形态，松材线虫雌成虫尾端宽圆呈指状，尾尖突2微 米以下，而拟松材线虫雌成虫尾端较尖细，尾尖突3-5微米。雄虫尾部似鸟爪， 向腹面弯曲。松材线虫病多发生在高温干旱的气候条件下，松材线虫雌雄虫交 尾后产卵，每只雌虫产卵约100粒。虫卵在25℃下经30小时孵化，幼虫共4龄， 在温度30℃时，线虫3天就可以完成一个世代。在我国松材线虫主要通过松墨天 牛(Monochamus alternatus)等媒介昆虫传播于松树体，从罹患病树羽化出来的天 牛几乎100％携带松材线虫，其中以在头、胸部最多，主要分布在气管系统内， 每只天牛可携带成千上万条线虫，最高可达25万～30万条。

[0004]松材线虫是我国危害最大的林业外来入侵物种，研究显示它最早起源于北 美洲，1971年由Kiyohara和Tokushige定名。1982年在我国南京中山陵首次发现， 以后相继在江苏、安徽、广东和浙江等地成灾，据国家农业局，2006年全国已 有12个省113个县级地区成为松材线虫的疫区，截止2018年，全国已有16个省292 个县级地区成为疫区，仅2017年全国就新增77个疫区，因此控制松材线虫病疫 区的扩散刻不容缓。

[0005]现有技术仅仅是根据松材线虫和拟松材线虫雌成虫尾部及尾尖突形状这一 相对稳定的特征进行形态鉴定。虽然通过尾形的观察可以基本区分两种线虫， 但是由于不同地区、不同株系的线虫间存在一定程度的差异；且拟松材线虫尾 形的相对不稳定性给准确鉴定增加了难度；并且形态学的鉴定局限于雌成虫并 不适用于雄虫和幼虫的鉴别。[0006]随着近年的分子生物学技术不断地发展和完善，PCR技术被广泛用于鉴定检 疫有害生物。其中，伞滑刃属线虫的ITS1-5.8S区基因进化速度较快，适于低级 分类阶元或近缘种的系统发育研究，是区分和鉴定松材线虫与拟松材线虫理想 的分子标记。现有的PCR鉴定技术的DNA提取方法复杂，不能检测所有伞滑刃 属线虫。因此，亟需一种将PCR技术与松材线虫分离及形态学检测相结合的方法， 以解决现有技术存在的问题，满足检测需求。[0007]综上所述，现有技术存在的问题是：根据雌虫尾部及尾尖突形状这一相对 稳定的特征可以基本区分松材线虫和拟松材线虫，但是由于不同地区、不同株 系的线虫间存在一定程度的差异；且拟松材线虫尾形的相对不稳定性给准确鉴 定增加了难度；并且形态学的鉴定局限于雌成虫并不适用于雄虫和幼虫的鉴别。 现有的PCR鉴定技术的DNA提取方法复杂，不能检测所有伞滑刃属线虫。

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解决上述技术问题的难度：1)设计了简单、易行的松材线虫分离装置，便 于基层

森防站使用；2)设计了简单、易行的松材线虫形态鉴定的流程，便于基 层森防站使用；3)筛选出了快速、高效、成本低的DNA提取技术；4)设计了 特异性PCR引物，可以扩增检测所有伞滑刃属线虫，使分子检测更加准确；5) 提出了完整的松材线虫分离、及形态和分子联合检测技术体系。

[0009]解决上述技术问题的意义：满足了林业工作者快速、高效和准确的松材线 虫检测需要，为林业部门松材线虫病普查提供了及时、可靠的检测手段与技术 保障。发明内容

[0010]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种松材线虫的形态和分子联合 检测方法。

[0011]本发明是这样实现的，一种松材线虫的分离及形态和分子联合检测技术， 所述方法包括样品的分离、松材线虫的形态学检测、松材线虫的分子检测：[0012]首先基于形态特征，采用口针的有无对腐生线虫和伞滑刃属线虫进行区分， 其次根据松材线虫和拟松材线虫雌虫尾部及尾尖突形状这一相对稳定的特征进 行形态鉴定；进一步，采用特异PCR技术对伞滑刃属线虫、松材线虫和拟松材线 虫进行分子鉴定。[0013]进一步，所述样品的分离包括以下步骤：[0014](1)样品的处理：各区县林业部门送至实验室的病木样品为圆盘或长条状 心材，用利斧将样品削成拇指指节大小的木块，将每个样品收集100～200g，用 自封袋装好并贴好标签纸备用。[0015](2)分离方法：所述分离方法是在贝尔曼漏斗法的基础上结合现有的实验 设备自主设计的简易分离装置。利用所述简易装置对松材线虫的分离方法如下：[0016]1)置备一个直径10～15cm的玻璃漏斗，玻璃漏斗末端接上一段长约15cm 的橡胶管，置于自制的漏斗架上，在具橡胶管末端5cm处夹上一个止水夹，也 可用强力文件夹替代。在橡胶管末端下方放置一个50ml的小烧杯防止漏斗中液 体滴漏。[0017]2)在漏斗内放置一大小合适的定性滤纸并用少量蒸馏水润湿，然后将 100～200g样品放置在漏斗中，并用蒸馏水将样品淹没，并在漏斗外缘贴好样本 信息标签。[0018]3)在室温条件下充分浸泡12～24h后，用50ml离心管置于橡胶管下接取20ml 的下层液体，并在离心管外贴好标签。

[0019]4)将步骤3)分离得到的液体置于冷冻离心机-4℃，5000r/min下离心3min, 然后弃上清液，取下层液体分装于3个2ml的离心管中置于高速微量离心机 126000r/min中离心30S，弃上清液。

[0020]5)在步骤4)得到的3个离心管中，选取2个离心管分别各添加1ml蒸馏 水分别用于形态学检测与分子检测，另1个离心管添加1ml 95％的酒精保存于 -20℃的冰箱作为标本保存。

[0021]进一步，所述松材线虫的形态学检测方法包括以下步骤：[0022]步骤一，取一干净的载玻片置于光学显微镜载物台上，并在载玻片的 滴一滴蒸馏水，另取分离样品中蒸馏水保存的一个离心管，用移液吸取线虫 分离液20ul滴于蒸馏水中。

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步骤二，在5.6*10倍光学显微镜下观察是否有松材线虫或疑似松材线虫，若 有，

则挑取10条制作成临时装片贴好标签，置于高倍显微镜下观察线虫的形态 特征是否为松材线虫的形态特征。[0024]进一步，所述松材线虫的分子检测方法包括以下步骤：[0025](1)线虫DNA的提取

[0026]1)取一干净的载玻片置于光学显微镜载物台上，并在载玻片的滴一滴 蒸馏水，另取一管保留在蒸馏水中的样品，用移液吸取线虫分离液20ul滴于蒸 馏水中。[0027]2)在光学显微镜下挑取3头线虫于2ml的离心管中，用100ul的移液吸取样 品20ul蒸馏水，每个样品做3个重复实验。

[0028]3)在上述2)得到的20ul的样品中加入10X chelex 20ul细胞裂解液，再向管 中加入4ul 1mg/ml蛋白酶K，斡旋瞬时离心使样品充解；将管迅速放入-70℃ 冰箱保存10min或-20℃保存2h；将离心管迅速置于55℃水浴锅中水浴4～24h，以 降解DNase，随后放入95℃水浴3min后取出，以变性蛋白酶K。

[0029]4)取步骤3)得到的DNA悬浮液2ul直接做特异PCR或放于-20℃保存备用。[0030](2)PCR扩增[0031]1)PCR引物：该特异PCR反应体系运用了5种引物：引物SEQ ID NO.1：F1 (5’-GATGATGCGATTGGTGACT-3’)，引物SEQ ID NO.2：F2(5’ -TGCGCTGCGTTGAGTCGA-3’)，引物SEQ ID NO.3：R1(5’ -CAATTCACTGGGTTCTTC-3’)，引物SEQ ID NO.4：BF(5’ -CGTAACAAGGTAGCCGTAGGTG-3)和引物SEQ ID NO.5：BR(5’ -GCGCAATATGCATTCAAAAACAT-3’)，前三条引物来自于赵立荣(2005)， 后两条引物利用Primer Designer软件自主设计，由重庆擎科生物公司完成引物合 成；

[0032]选择松材线虫的rDNA作为PCR鉴定的目标序列，在ITS1区设计松材线虫的 特异性引物F1和拟松材线虫的特异性引物F2，在5.8S区设计松材线虫和拟松材 线虫的通用引物R1。引物F1与引物R1配对特异性扩增松材线虫ITS1-5.8S区，引 物F2和引物R1配对特异性扩增拟松材线虫的ITS1-5.8S区；

[0033]2)在ITS1和5.8S区分别设计伞滑刃属线虫特异性引物BF和BR；引物BF与 引物BR配对特异性扩增所有伞滑刃属的线虫ITS1-5.8S区；[0034]3)上述1)的特异PCR反应体系包括：2x ES Taq MasterMix(Dye)12.5ul，模 板DNA(10ng/ul)2ul，引物F1和F2各1ul，引物R12ul，ddH2O 6.5ul；[0035]上述2)的特异PCR反应体系包括：2x ES Taq MasterMix(Dye)12.5ul，模板 DNA(10ng/ul)2ul，引物BF和BF各1ul，ddH2O 8.5ul；[0036]PCR反应条件如下：95℃预变性3min；然后按95℃变性30S，51℃退火30S， 72℃延伸1min，重复35个循环；最后72℃延伸10min，反应产物在4℃保存；[0037]4)制胶：按2％w/v比例称取琼脂糖，加入1X TAE缓冲液，放入微波炉加热 至琼脂糖完全融化没有白色颗粒。插好制胶板，将溶解好的胶液倒入制胶板中 凝固；[0038]5)取扩增好的特异PCR产物各3ul上样于2％的琼脂糖凝胶泳道，另点一道 DNAMaker作为标记，再点一道已确定有松材线虫的模板样作为参考。[0039]6)电泳：将点好样品的胶块放入小型电泳槽，在100V电压下电泳至样品跑 至胶块的1/2～2/3处后停止电泳。

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7)将跑好的凝胶放入EB溶液中浸泡3min染色后，放在清水中清洗胶块表面 残留

的EB染液。

[0041]8)将胶块放入凝胶成像系统，观察电泳条带，拍照。[0042]综上所述，本发明的优点及积极效果为：

[0043]本发明提供了一种松材线虫的形态和分子联合检测方法。本发明的优点在 于：1)设计了简单、易行的松材线虫分离装置，便于基层森防站使用；2)设 计了简单、易行的松材线虫形态鉴定的流程，便于基层森防站使用；3)筛选出 了快速、高效、成本低的DNA提取技术；4)设计了特异性PCR引物，可以扩 增检测所有伞滑刃属线虫，使分子检测更加准确；5)提出了完整的松材线虫分 离、及形态和分子联合检测技术体系。本发明的积极性在于：能满足林业工作 者快速、高效和准确的松材线虫检测需要，为林业部门松材线虫病普查提供了 及时、可靠的检测手段与技术保障。附图说明

[0044]图1是本发明实施例提供的松材线虫的形态和分子联合检测方法流程图。[0045]图2是本发明实施例提供的松材线虫的分离流程图。

[0046]图3是本发明实施例提供的松材线虫的形态学检测方法流程图。[0047]图4是本发明实施例提供的引物在rDNA区域的相对位置示意图。[0048]图5是本发明实施例提供的拟松材线虫雌虫形态示意图。[0049]图6是本发明实施例提供的松材线虫雄虫形态示意图。

[0050]图7是本发明实施例提供的rDNA-ITS1-5.8S区特异PCR扩增结果电泳图。具体实施方式

[0051]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。

[0052]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种松材线虫的形态和分子联合 检测方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。[0053]如图1所示，本发明实施例提供的一种松材线虫的形态和分子联合检测方法 包括三个步骤：样品的分离、松材线虫的形态学检测、松材线虫的分子检测；[0054]本发明设计了简易的松材线虫分离装置；采用口针的有无对腐生线虫和伞 滑刃属线虫进行区分，根据松材线虫和拟松材线虫雌成虫尾部及尾尖突形状进 行形态鉴定；进一步，采用特异PCR技术对伞滑刃属线虫、松材线虫和拟松材线 虫进行分子鉴定；设计了完整的检测技术体系细节。

[0055]本发明实施例提供的样品的分离包括以下步骤：[0056](1)样品的处理：各林业部门送至实验室的病木样品为圆盘或长条状心材， 用利斧将样品削成拇指指节大小的木块，将每个样品收集100～200g，用自封袋 装好并贴好标签纸备用。[0057](2)分离方法：所述分离方法是在贝尔曼漏斗法的基础上结合现有的实验 设备自主设计的简易分离装置。

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如图3所示，本发明实施例提供的利用所述简易装置对松材线虫的分离方 法如

下：

1)置备一个直径10～15cm的玻璃漏斗，玻璃漏斗末端接上一段长约15cm 的橡胶

管，置于自制的漏斗架上，在具橡胶管末端5cm处夹上一个止水夹，也 可用强力文件夹替代。在橡胶管末端下方放置一个50ml的小烧杯防止漏斗中液 体滴漏。[0060]2)在漏斗内放置一大小合适的定性滤纸并用少量蒸馏水润湿，然后将 100～200g样品放置在漏斗中，并用蒸馏水将样品淹没，并在漏斗外缘贴好样本 信息标签。[0061]3)在室温条件下充分浸泡12～24h后，用50ml离心管置于橡胶管下接取20ml 的下层液体，并在离心管外贴好标签。

[0062]4)将步骤3)分离得到的液体置于冷冻离心机-4℃，5000r/min下离心3min, 然后弃上清液，取下层液体分装于3个2ml的离心管中置于高速微量离心机 126000r/min中离心30S，弃上清液。

[0063]5)在步骤4)得到的3个离心管中，选取2个离心管分别各添加1ml蒸馏 水，分别用于形态学检测与分子检测，另1个离心管添加1ml 95％的酒精保存于 -20℃的冰箱作为标本保存。

[00]如图2所示，本发明实施例提供的松材线虫的形态学检测方法包括以下步 骤：[0065]S101：取一干净的载玻片置于光学显微镜载物台上，并在载玻片的滴 一滴蒸馏水，另取分离样品中蒸馏水保存的一个离心管，用移液吸取线虫分 离液20ul滴于蒸馏水中。

[0066]S102：在5.6*10倍光学显微镜下观察是否有松材线虫或疑似松材线虫，若有， 则挑取10条制作成临时装片贴好标签，置于高倍显微镜下观察线虫的形态特征 是否为松材线虫的形态特征。

[0067]本发明实施例提供的松材线虫的分子检测方法包括以下步骤：[0068](1)线虫DNA的提取

[0069]1)取一干净的载玻片置于光学显微镜载物台上，并在载玻片的滴一滴 蒸馏水，另取一管保留在蒸馏水中的样品，用移液吸取线虫分离液20ul滴于蒸 馏水中。[0070]2)在光学显微镜下挑取3头线虫于2ml的离心管中，用100ul的移液加20ul 蒸馏水，每个样品做3个重复实验。

[0071]3)在上述20ul的样品中加入10X chelex 20ul细胞裂解液，再向管中加入4ul 1mg/ml蛋白酶K，斡旋瞬时离心使样品充解，然后将离心管迅速放入-70℃ 冰箱保存10min或-20℃保存2h，而后将离心管迅速置于55℃水浴锅中水浴 4～24h，以降解DNase，随后放入95℃水浴3min后取出，以变性蛋白酶K。4)取 步骤3)得到的DNA悬浮液2ul直接做特异PCR或放于-20℃保存备用。[0072](2)PCR扩增[0073]1)PCR引物：该特异PCR反应体系运用了5种引物：引物SEQ ID NO.1：F1 (5’-GATGATGCGATTGGTGACT-3’)，引物SEQ ID NO.2：F2(5’ -TGCGCTGCGTTGAGTCGA-3’)，引物SEQ ID NO.3：R1(5’ -CAATTCACTGGGTTCTTC-3’)，引物SEQ ID NO.4：BF(5’ -CGTAACAAGGTAGCCGTAGGTG-3)和引物SEQ ID NO.5：BR(5’ -GCGCAATATGCATTCAAAAACAT-3’)，前三条引物来自赵立荣(2005)，后 两条引物利用Primer Designer软件自主设计，由

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重庆擎科生物公司完成引物合 成。

[0074]选择松材线虫的rDNA作为特异PCR鉴定的目标序列，在ITS1区设计松材线 虫的特异性引物F1和拟松材线虫的特异性引物F2，在5.8S区设计松材线虫和拟 松材线虫的通用引物R1。引物F1与引物R1配对特异性扩增松材线虫ITS1-5.8S 区，引物F2和引物R1配对特异性扩增拟松材线虫的ITS1-5.8S区；

[0075]2)在ITS1和5.8S区分别设计伞滑刃属线虫特异性引物BF和BR；引物BF与 引物BR配对特异性扩增所有伞滑刃属的线虫ITS1-5.8S区；[0076]3)上述1)的特异PCR反应体系包括：2x ES Taq MasterMix(Dye)12.5ul，模 板DNA(10ng/ul)2ul，引物F1和F2各1ul，引物R12ul，ddH2O 6.5ul。[0077]上述2)的特异PCR反应体系包括：2x ES Taq MasterMix(Dye)12.5ul，模板 DNA(10ng/ul)2ul，引物BF和BF各1ul。[0078]PCR反应条件：95℃预变性3min；然后按95℃变性30S，51℃退火30S，72℃ 延伸1min，重复35个循环；最后72℃中延伸10min，重复35个循环，反应产物在 4℃保存。[0079]4)制胶：按2％w/v比例称取琼脂糖，加入1X TAE缓冲液，放入微波炉加热 至琼脂糖完全融化没有白色颗粒。插好制胶板，将溶解好的胶液倒入制胶板中 凝固。[0080]5)取扩增好的特异PCR产物各3ul上样于2％的琼脂糖凝胶泳道，另点一道 DNAMaker作为标记，再点一道已确定有松材线虫的模板样作为参考。[0081]6)电泳：将点好样品的胶块放入小型电泳槽，在100V电压下电泳至样品跑 至胶块的1/2～2/3处后停止电泳。

[0082]7)将跑好的胶放入EB溶液中浸泡3min染色后，放在清水中清洗胶块表面残 留的EB染液。

[0083]8)将胶块放入凝胶成像系统，观察电泳条带，拍照。[0084]下面结合实施例对本发明作进一步描述。[0085]松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是危害最重的林业检验检疫害虫，能够 引起松树罹患毁灭性病害松材线虫病(pine wilt disease,PWD)。松材线虫与拟松 材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)是近缘种，在形态上相近，难以区分。本发 明设计了样品的分离、松材线虫的形态学检测、松材线虫的分子检测技术，对 来自重庆市14个区县森林病虫害防治检疫站的松材送检样本进行特异PCR检测。 结果显示来自除大渡口、永川、武隆和巫溪4个区县的枯死松树样本中不含有松 材线虫外，剩下10个区县均含有松材线虫。[0086]实施例[0087]1、材料与方法[0088]1.1样本的收集

[00]本发明实施例提供的实验使用的材料来自重庆市彭水、巫溪、铜梁等14个 区县森林病虫害防治检疫站2017年森林病虫害秋季普查活动，共276份样本，保 存于重庆师范大学生命科学学院昆虫与分子生物研究-20℃冰箱。实验用的虫样 均为新鲜活体标本，先经形态学鉴定，其中松材线虫和拟松材线虫标本为主。 案例样本的采集时间，采集地点及寄主植物都详细登记(如表1所示)。

[0090]表1分离伞滑刃线虫样品来源和寄主

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1.2样品的分离

[0094]1.2.1样品的处理：各林业部门送至实验室的病木样品为圆盘或长条状心材 用利斧将样品削成一个拇指指节大小的木块，将每个样品收集100～200g用自封 袋装好并贴好标签纸备用。这一步需要注意的是各个样品之间不能混合。[0095]1.2.2分离方法：本实验的分离方法是在1917年贝尔曼(Baermann)提出的 贝尔曼漏斗法的基础上结合实验室现有的实验设备自主设计的简易分离装置。 利用这种简易的装置对松材线虫的分离方法如下：

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1)置备一个直径10～15cm的玻璃漏斗，玻璃漏斗末端接上一段长约15cm的 橡胶

管，置于自制的漏斗架上，在具橡胶管末端5cm处夹上一个止水夹，也可用 强力文件夹替代。在橡胶管末端下方放置一个50ml的小烧杯防止漏斗中液体滴 漏。[0097]2)在漏斗内放置一大小合适的定性滤纸并用少量蒸馏水润湿，然后将 100～200g样品放置在漏斗中，并用蒸馏水将样品淹没，并在漏斗外缘贴好样本 信息标签。[0098]3)在室温条件下充分浸泡12～24h后，用50ml离心管置于橡胶管下接取20ml 的下层液体，并在离心管外贴好标签。

[0099]4)将上一步分离得到的液体置于冷冻离心机-4℃,5000r/min下离心3min，然 后弃上清液，取下层液体分装于3个2ml的离心管中置于高速微量离心机126000 r/min中离心30S，弃上清液。

[0100]5)在步骤4)得到的3个离心管中，选取2个离心管分别各添加1ml蒸馏水， 分别用于形态学检测与分子检测，另1个离心管添加1ml 95％的酒精保存于-20℃ 的冰箱作为标本保存。

[0101]1.3松材线虫的形态学检测方法

[0102]1)取一干净的载玻片置于光学显微镜载物台上，并在载玻片的滴一滴 蒸馏水，另取上述分离样品中蒸馏水保存的一个离心管，用移液吸取线虫分 离液20ul滴于蒸馏水中。

[0103]2)在5.6*10倍光学显微镜下观察是否有松材线虫或疑似松材线虫，若有， 则挑取10条制作成临时装片贴好标签，置于高倍显微镜下(Olympus)观察线虫 的形态特征是否为松材线虫的形态特征。

[0104]1.4松材线虫的分子检测方法[0105]1.4.1线虫DNA的提取

[0106]1)另取一管保留在蒸馏水中的样品重复形态学检测的第一步骤。[0107]2)在光学显微镜下挑取3头线虫于滴有ddH2O的载玻片上，用100ul的移液 加20ul蒸馏水，每个样品做3个重复实验。

[0108]3)在上述2)得到的20ul的样品中加入10X chelex 20ul细胞裂解液，再向管 中加入4ul 1mg/ml蛋白酶K，斡旋瞬时离心使样品充解，然后将管迅速放入 -70℃冰箱保存10min或-20℃保存2h，而后将离心管迅速置于55℃水浴锅中水浴 4～24h，以降解DNase，随后放入95℃水浴3min后取出，以变性蛋白酶K。

[0109]4)取步骤3)得到的DNA悬浮液2ul直接做特异PCR或放于-20℃保存备用。[0110]1.4.2PCR扩增[0111]1)PCR引物：该特异PCR反应体系运用了5种引物：引物SEQ ID NO.1：F1 (5’-GATGATGCGATTGGTGACT-3’)，引物SEQ ID NO.2：F2(5’ -TGCGCTGCGTTGAGTCGA-3’)，引物SEQ ID NO.3：R1(5’ -CAATTCACTGGGTTCTTC-3’)，引物SEQ ID NO.4：BF(5’ -CGTAACAAGGTAGCCGTAGGTG-3)和引物SEQ ID NO.5：BR(5’ -GCGCAATATGCATTCAAAAACAT-3’)，前三条引物来自赵立荣(2005)，后 两条引物利用Primer Designer软件自主设计，由重庆擎科生物公司完成引物合 成；

[0112]选择松材线虫的rDNA作为特异PCR鉴定的目标序列，在ITS1区设计松材线 虫的特异性引物F1和拟松材线虫的特异性引物F2，在5.8S区设计松材线虫和拟 松材线虫的通用

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引物R1,各引物的相对位置如图4所示；引物F1与引物R1配对特 异性扩增松材线虫ITS1-5.8S区，引物F2和引物R1配对特异性扩增拟松材线虫的 ITS1-5.8S区；[0113]2)在ITS1和5.8S区分别设计伞滑刃属线虫特异性引物BF和BR；引物BF与 引物BR配对特异性扩增所有伞滑刃属的线虫ITS1-5.8S区；[0114]3)上述1)的特异PCR反应体系包括：2x ES Taq MasterMix(Dye)12.5ul，模 板DNA(10ng/ul)2ul，引物F1和F2各1ul，引物R1 2ul，ddH2O 6.5ul。[0115]上述2)的特异PCR反应体系包括：2x ES Taq MasterMix(Dye)12.5ul，模板 DNA(10ng/ul)2ul，引物BF和BR各1ul，ddH2O 8.5ul。[0116]PCR反应条件如下：95℃预变性3min；然后按95℃变性30S，51℃退火30S，72℃延伸1min，重复35个循环；最后72℃中延伸10min，反应产物在4℃保存。[0117]4)制胶:按2％w/v比例称取琼脂糖，加入1X TAE缓冲液，放入微波炉加热 至琼脂糖完全融化没有白色颗粒。插好制胶板，将溶解好的胶液倒入制胶板中 凝固。[0118]5)取扩增好的特异PCR产物各3ul上样于2％的琼脂糖凝胶泳道，另点一道 DNAMaker作为标记，再点一道已确定有松材线虫的模板样作为参考。[0119]6)电泳将点好样品的胶块放入小型电泳槽，在100V电压下电泳至样品跑 至胶块的1/2～2/3处后停止电泳。

[0120]7)将跑好的胶放入EB溶液中浸泡3min染色后，放在清水中清洗胶块表面残 留的EB染液。

[0121]8)将胶块放入凝胶成像系统，观察电泳条带，拍照。[0122]2、结果分析[0123]2.1形态学观察[0124]雌虫：虫体呈线形，长约1㎜；唇区高，缢缩明显；口针细长，14μm左右， 基部略增厚，属于滑刃型食道(aphelenchoid)；中食道球卵圆形，占体宽2/3 以上；食道腺细长，覆盖于肠背面，长约3～4倍体宽；阴门开口于虫体中后部 约73％处，有显著阴门盖；后阴子宫囊长为肛阴距3/4；尾部呈亚圆形，末端 宽圆；一般无尾尖突，少数个体有不超过2μm尾尖突；而拟松材线虫尾呈圆锥 形，末端较尖，且有一明显的尾尖突，长3-5微米(如图5所示)。[0125]雄虫：尾部以前的形态特征与雌虫相似，略短于雌虫；死亡后的虫体呈“J” 形弯曲(如图6所示)，尾端尖细，侧面观为爪状，尾端腹面可见交合伞，多呈卵 圆形或圆形；交合刺基顶和基喙发，基喙通常尖，交合刺大，弓状，成对，喙 突锐尖，远端有盘状突。[0126]2.2PCR扩增

[0127]将待鉴定线虫分离物的rDNA ITS1-5.8S区经PCR扩增后，电泳分析发现所有 的添加F1、F2、R1三条引物的泳道会产生松材线虫388bp(F1,R1)，拟松材线虫256bp(F2,R1)两种大小的稳定条带；添加BF、BR两条引物的泳道会产生伞滑刃 线虫属500bp(BF、BR)左右稳定的条带(如图7所示)。

[0128]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

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