表面等离子体共振在研究中的应用

表面等离子体共振在研究中的应用

摘要：表面等离子共振（SPR）近年来迅速发展为用于分析生物分子相互作用的一种新的光学检测技术。应用SPR原理可检测生物传感芯片上配位体与分析物之间的相互作用情况，在生命科学、医疗检测、药物筛选、食品检测及环境监测等领域具有广泛的应用需求。该技术无需标记、特异性强、灵敏度高、样品用量小，可实现在线连续实时检测。本文阐述了基于表面等离子共振技术生物传感器的基本原理，综述了SPR在蛋白质、水质、有毒气体检测及疾病诊断中的应用，以及利用SPR分析蛋白质—蛋白质相互作用中的主要研究方向，并对其发展趋势进行了展望。

关键词：表面等离子体共振；蛋白质；水质检测；有毒气体检测；疾病诊断

Application in the Scientific Research of Surface Plasmon Resonance

Abstract: The optical technique of surface plasmon resonance(SPR)has been rapidly developed to investigate the interactions of biomolecules in recent years, it can be applied for monitoring of interaction between ligand and analyte on a sensor chip. Thus, it has been largely demanded in the field of life science, medical testing, drug screening, food and environmental monitoring, and so on. SPR technique has many advantages,such as label-free,specificity,sensitivity, sample dosage, real-time and online detection. In this paper, the principle of biosensor chip technology of SPR biosensors was briefly described, its application on protein, water quality, toxic gas investigations and disease diagnosis were reviewed, and the mainly research fields of using SPR analyse interaction between protein and protein were stated. Furthermore，the trend of its development in near future has

been prospected．

Key words: surface plasmon resonance; protein; immunosensor; water quality investigation; toxic gas investigation

表面等离子体子共振(surface plasmon resonance，SPR)是一种利用金属薄膜的光学耦合产生的物理光学现象。表面等离子共振技术利用生物分子间的特异性结合进行分子识别，并通过光激励一分子识别一光输出一电输出的途径，完成分子相互作用的信息传递与检测。1902年，Wood[1]首次发现表面等离子体共振现象；20世纪60年代，Otto和Kretschmann分别发明了用可见光激发表面等离子体的方法[2]；1971年KretschmannLl[3]建立Kretsehmann结构，为SPR传感器奠定基础；1990年，Biacore AB公司开发出了首台商品化SPR仪器[4]。SPR可用于进行实时分析，简单快捷地监测生物分子之间的相互作用[5]，在生命科学、医疗检测、药物筛选、食品检测及环境监测等领域具有广泛的应用需求。

1 表面等离子体共振原理

如图1所示，当光波从光密介质A向光疏介质B传播时，若入射角大于临界角，则会在介质A、B的交界面处发生全内反射。同时，电磁场会透射进入反射面外侧的B介质一定深度(约为1个波长)，且其振幅在垂直于界面的Z方向随入射深度呈指数衰减，称为倏逝波。倏逝波沿界面传播约半个波长，再返回光密介质A中。若光疏介质很纯净，反射光的光能无衰减，反之，光能会损失，反射率R将小于1。因此，当在2个介质的界面上镀一层厚度小于100 nm的金属薄膜(Au或Ag)，当光以某一特定角度或波长入射到金属和介质的交界面时，倏逝波和表面等离子波将发生共振，即表面等离子共振。此时，倏逝波的能量耦合进入表面等离子波，反射光的强度和相位均发生剧烈变化，呈现衰减全反射现

象，反射率出现最小值[6]，该点称为共振波长或共振角。由菲涅尔公式可知，反射率是入射波长或入射角的函数。所以，SPR光谱可以实时监测传感芯片表面液相折射率的变化，而这一变化和传感芯片表面所结合的生物分子的质量成正比[7]，用共振单位(Response unit，RU)相对时间来表示。因此，通过分析反应过程中各时刻的SPR光谱，可在非标记的情况下监测生物分子间的相互作用[8]。

当进行分子间相互作用研究时，将其中一个反应物(称为配体)偶联在传感芯片上，将含有分析物(称为受体)的样品利用蠕动泵以恒定的流速通过传感芯片表面，若发生分子间的结合反应，会导致传感芯片表面分子浓度的变化。将SPR信号的改变以时间对RU连续作图，记录反应过程(见图2)。结合过程的不同阶段包括：持续地流入缓冲液(基线平衡)；注入样品，金膜表面的配体与样品中的受体结合(结合过程)；持续地流入缓冲液(解离过程)；流入再生液(传感器表面再生)；持续地流入缓冲液(基线平衡)。当反应结束后，用再生液洗脱结合在传感芯片上的反应物，可实现传感芯片的再生，进行下一轮结合反应。

Fig．1(left) Principle of surface plasmon resonance(SPR)

Fig．2(right) Sensorgram showing the steps of all analysis cycle

a.baseline step; b.association step; c.dissociation step; d.regeneration step; e.a

new analysis cycle

2 SPR检测方法

2.1 SPR免疫传感器

SPR免疫传感器应用于抗原物质测定时主要有直接法、夹心法(或“三明治”法)、抑制型以及竞争型这4种检测方式，图3即为这种测定方法的示意图。直接法中目标抗原直接与已固定的抗体结合，共振角的变化与目标分析物浓度呈正比，一般用于检测质量大于10 kDa的生物大分子；夹心法中有两层抗体来固定抗原物质，提高了检出限和特异性，一般可用于检测具有多种抗原决定位点如蛋白质、细菌和病毒，及质量大于5000 Da的大分子[9]；小分子的目标分析物(质量<5000 Da)因无法引起足够的折射率变化，通常采用抑制型或竞争型的检测方式：抑制型方式中将已知浓度的抗体与目标分析物混合，并将混合液注射人同定有分析物的传感器表面，未复合的自由抗体可与之结合，反应信号与分析物浓度

呈反比；竞争型方式利用偶联有大分子的分析物和原分析物与抗体的竞争结合，共振角的变化与分析物浓度成反比关系[10]。

Fig.3 Schematic of main detection formats in SPR immunoassay

2.2 SPR分子印迹传感技术

分子印迹又称分子烙印，分子印迹技术(molecular imprinted technique，MIT)，指制备对某一特定目标分子具有特异选择性的聚合物的过程(图4)，常被形象地描绘为制造识别“分子钥匙”的“人工锁”的技术。SPR分子印迹传感技术的原理是：将MIPs作为识别元件同定于SPR传感器表面，MIPs特异性识别待测物质中的小分子模板并与之结合，引起SPR信号变化，从而对小分子目标物进行定量检测。

图4非共价型分子印迹聚合物的合成过程

3 表面等离子体共振在检测中的应用

3.1 SPR在蛋白质检测中的应用

Homola等[11]利用波导调制型SPR免疫传感器检测牛奶中的SEB蛋白。研究中采用了双通道的SPR传感器装置，同时利用直接和夹心检测法来捕捉抗原。其中，直接法的检出限为5μg/L；采用夹心法在缓冲体系和牛奶中检出限均可达到0.5μg/L，明显低于常规免疫学检测方法，如 ELISA和Western印迹法。

Bremer等[12]利用Biacore 3000 SPR设备，研究证实此项SPR免疫技术可追溯级别特异性和定量检测食品过敏原蛋白，其中橄榄油中榛子蛋白的检出限可低至0.08μg/g，该结果可与最为灵敏的ELISA方法相比较或者更优。

心肌肌钙蛋白T(TnT)是心肌损伤的高特异性和高灵敏度的标志物。Dutra等[13]利用SPR免疫传感器来实时快速检测人体的该种蛋白。SPR免疫传感器采用链亲和素自组装膜

的方法偶联修饰有亲和素的抗肌钙蛋白T的抗体，随后通过直接法在连续样本溶液中检测该蛋白，其检出限可达到0.01μg/L。

Tao等[14]利用Plasmonic@SPR设备来检测缓冲液、血清以及注射药品中的ML-I。研究采用了夹心装置，选择连接有烷基矽烷的芯片，结果在血清样本中ML-I的检出限为1.5 mg/L。

3.2 SPR在水质检测中的应用

Soonwoo等[15]建立起一种选择性测定水体中的Hg2十离子的SPR方法，采用1，6—二硫醇在金表面构成自组装膜芯片，在含有汞离子的水样中，汞离子与芯片作用产生信号，在浓度为1×10-9～1×10-5mol/L的范围内具有线性关系，且其他离子如Pb2+，Ni2+，Zn2+和Cu2+离子不产生干扰。

May等[16]通过Cd2+离子对尿素酶的抑制将尿素酶修饰组装在金膜表面，可以测定水样中的镉离子浓度，其线性范围在0～0.01μg/L。

3.3 SPR在有毒气体检测中的应用

Zhu和Lloyd[17]采用Kretchmann棱镜型SPR装置和He/Ne激光器作为光源，分别研究了以酞菁硅(SiPc)和酞菁铜(CuPc)为主的超薄膜(简称LB膜)作为敏感膜检测NO2气体的响应情况，其中，由于NO2与Ag基底的相互作用导致SiPc检测共振角的不可逆偏移，而在Ag表面覆盖一层起保护作用的Ni，阻断Ag与NO2之间接触的可能性，则可消除SPR图谱上由于N02与Ag基底相互作用导致共振角的不可逆偏移。

Rella等[18]以溶胶凝胶法制备掺杂金属酞菁(TiO2+CuPc，TiO2+PdPc，TiO2+FePc)的TiO2多孔膜进行检测，实现NO2的检出限为5×10-5。

3.3 SPR在疾病诊断中的应用

Vaisocherova H[19]等人用SPR生物传感器和酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析人血清中的白细胞活化粘附因子(activated leukocyte cell adhesion molecule／CD 166，ALCAM or CD 166)。ALCAM是一种105kDa的糖蛋白，被确定为乳腺癌、大肠癌、肝癌的潜在生物标志物。实验结果表明：在缓冲液和人血清中SPR检测结果与ELISA可以媲美。

Ladd J等[20]人利用SPR成像技术检测候选癌症生物标记物ALCAM和胶转蛋白-2(Transgelin-2，TAGLN2)，研究结果表明：SPR成像传感器的传感响应与类似的光谱SPR传感器观察结果相符合。后来利用SPR传感器直接检测临床人血清样品中的癌胚抗原。检测癌胚抗原自身抗体的增加，可用于诊断癌症患者。

4 表面等离子共振对蛋白质—蛋白质相互作用研究的主要方向

4.1 蛋白质相互作用动力学研究

SPR技术能实时动态反映蛋白质相互作用的结合速率、解离速率，获得结合常数(Kb)、解离常数(Kd)等动力学信息[21]。假设蛋白分子A和B的亲和反应是简单的一级反应，即：A+B=AB。在反应结合阶段，dR/dt=kαc(Rmax-R)-Rkd。式中，R为时问t时的SPR信号，c为样品的浓度，Rmax为配体表面的最大结合容量。在反应解离阶段，dR/dt=-kdR。分别对上述两式进行非线性拟合，可得结合速率常数kα和解离速率常数kd。，根据速率常数进

而求得结合常数Kb (Kb=kα/kd)和解离常数Kd (Kd =kd/kα)。

Dhanasekaran等[22]在研究载脂蛋白E与脂蛋白相互作用的动力学常数和机理时，利用SPR技术测得的解离常数说明载脂蛋白E与高密度脂蛋白主要是蛋白质一蛋白质相互作用，与低密度脂蛋白主要是蛋白质与脂的相互作用。

4.2 蛋白质结构、功能及突变分析

基于同一蛋白质中不同氨基酸残基与其它分子相互作用时的动力学参数不同，可推测该蛋白内部存在的不同官能团及蛋白在翻译后发生的不同修饰。

Robbio等[23]采用SPR技术，将脂蛋白B-100固定于传感器芯片上，依次注入不同的单克隆抗体。由于不同单克隆抗体与脂蛋白B-100相互作用的能力不同，可以准确鉴定脂蛋白B-100上的不同结构域。当某种蛋白质中单个氨基酸发生改变时，此蛋白与其他分子间的结合会随之改变，由此可在蛋白水平上筛选遗传多态性。

由于使用SPR技术可直接从粗提液中将待分析的蛋白质结合到传感芯片上，因此可很方便地分析蛋白的位点突变。如在研究B淋巴细胞抗原CD22分子的唾液酸识别位点的结构中，对候选区域中的某些残基突变，使用SPR技术测定突变后的亲和力等参数，确定连接位点的基序[24]。

4.3 信号转导

SPR技术能够在不影响酶活性的条件下测定分子问的相互作用，因此在信号转导研究中具有很强的优势。李雪玲等[25]研究胰岛素样生长因子I受体(IGF-1R)的信号通路，利用

SPR传感器PY20能够表达由IGF-1R激活酶不同浸泡时间和不同细胞裂解液引起的不同水平的肽酪氨酸磷酸化。结果表明只有磷酸化的肽能与其下游胰岛素受体发生相互作用。

5 展望

SPR技术的优点：（1）无需任何标记物，避免了标记物对于反应性能的影响或由于标记物存在而产生的假阳信号；（2）可采集在界面上连续、实时的生物分子反应信号，实现快速检测；（3）芯片再生可重复多次使用；（4）具有小型化和多点检测的可行性；（5）通过结合生物识别反应的特异性，可无差错检测避免临床诊断和危险爆炸物检测中的并发情况；（6）应用广泛，不需要对样品进行复杂预处理；（7）样品需要量少，灵敏度较高，商业化SPR设备一般具备检测传感片表面吸附分析物1 pg/mm2的质量变化；（8）能在浑浊甚至不透明的样品中进行检测。

目前，SPR技术的科研人员面临的主要问题在于，如何提高SPR传感器的性能和芯片质量，降低芯片制作成本，以及探索适宜的结合反应条件。当前SPR技术的研究重点主要集中在：（1）改进基底材料的表面处理技术和寻找合适的缓冲体系，提高结合反应效率和减少非特异性结合；（2）建立高效和快速的芯片活化方法，制备出多功能的检测芯片，并能够保持芯片表面物质的稳定性和生物活性；（3）开发出功能更加完善、灵敏度和分辨率更高的仪器和检测方法，通过优化光学结构设计和数据处理方法，继续扩大SPR传感器潜在的应用领域。

由于无需标记、可实时快速检测的优点，SPR光学免疫传感器在蛋白质检测领具有广泛的应用前景，特别是在小型化、便携式仪器的开发上具有优势。但是与常规SPR技术相比，SPR免疫传感技术在降低检测成本，提高生物样本检测性能及实现高通量复合型检测等方面仍具有很大的改进空间。因此今后将继续在硬件开发、生物特异性结合以及SPRI、

LSPR等新型技术方面深入研究。此外，今后的发展也将进一步开发基于新型特异性结合表面，能有效抑制非特异性吸附的先进的光学传感平台，提高免疫传感器工作性能，实现目标蛋白质大分子在复杂样品中的高灵敏度、高特异性快速检测。

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