动物源医疗器械第4部分

ICS 11.080 C

YY YY ××××.4—×××× 中华人民共和国医药行业标准 动物源医疗器械

第4部分：液体灭菌剂灭菌的确认与常规控制

Animal tissues and their derivatives utilized in the manufacture of medical devices

- Part 3: Validation and routine control of sterilization by liquid sterilants

（ISO 14160:1998,IDT）

（草案稿）

（本稿完成日期：2006-12-26）

××××-××-××发布 ××××-××-××实施 国家食品药品监督管理局 发布

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前 言

YY XXXXX的本部分等同采用国际标准ISO14160：1998《含动物源材料的一次性使用医疗器械的灭

菌 液体灭菌剂灭菌的确认与常规控制》。

YY XXXXX的总题目是动物源医疗器械, 由下列部分组成: 第1部分: 风险管理应用

第2部分: 来源、收集与处置的控制

第3部分: 病毒和传染性海绵状脑病因子去除与灭活的确认 第4部分: 液体灭菌剂灭菌的确认与常规控制

本部分附录A和附录B是资料性附录。

本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会提出并归口。 本部分起草单位：国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心、国家食品药品监督管理局中检所医疗器械质量监督检验中心。

本部分主要起草人： 。

I

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引 言

无菌产品是指无存活微生物的产品。当医疗器械必须以无菌的形式供应时，国际标准要求使用一切可行的手段，在灭菌前将医疗器械上的各种外来的微生物污染降至最低限度。产品即使是在符合医疗器械质量体系标准（见YY0287）要求的标准条件下生产，灭菌前可能仍会带有微生物，虽然数量较少。此类产品属非无菌产品。灭菌加工的目的是灭活污染的微生物，从而使非无菌产品转变成无菌产品。

采用物理和/或化学手段灭活纯培养的微生物使医疗器械无菌，通常遵循一个近似的指数规律；这必然意味着微生物从所施加的一定程度的灭菌中存活下来就存在着一个有限概率。对于一个给定的灭菌过程，存活概率取决于微生物的数量和种类，还取决于灭菌过程中微生物所处的环境。因此，经受灭菌处理过程的产品总体中任何单个产品是不能保证绝对无菌的，产品总体的无菌水平只能以器械上有存活微生物的概率来表示。

GB/T 9000族标准、YY/T0287规定了设计/开发、生产、安装和服务的质量体系的通用要求。GB/T 19000系列标准把某些不能由随后的产品检验和试验来充分证实其结果的生产过程称之为“特殊”。灭菌就是这样一个特殊过程，因为其过程的功效不能通过产品的检验和试验来证实。因此，灭菌过程需在用前确认，过程的性能必须进行常规监视，设备需进行维护。

重要的是要认识到，使产品经过正确确认和精确受控的灭菌过程，不是提供产品无菌和在这方面适合于预期用途的可靠保证的唯一因素。还必须注意其它一系列的因素，包括所用原材料和/或组成的微生物状态（生物负载）、随后的贮存，以及产品生产、装配和包装环境的控制。

医疗器械最频繁使用的灭菌手段是湿热、干热、辐射和环氧乙烷灭菌。有些含有动物组织的器械可能适合于这些常用的灭菌方法（如羊肠线通常用辐射灭菌），而另一部分器械，如生物心脏瓣膜或组织斑贴，则不适合于传统的灭菌过程。人们已经认识到，在这些例外情况下可能不得不使用其它灭菌手段。液体化学灭菌剂的手段已经在这些例外情况下得到了广泛应用。同其他灭菌方法一样，该过程在作为常规使用之前，需要证实和记录其过程的有效性。

本国际标准包含了使用液体化学灭菌剂对包括来源于动物材料在内的一次性使用医疗器械进行灭菌的确认和常规控制的要求；附录A中给出了本标准的应用指南。含有动物组织的医疗器械的生产过程，常常包括暴露于化学介质的过程，介质本身能显著降低医疗器械的生物负载。生产过程之后，医疗器械经受一个确定的灭菌过程；本标准规定的确认和常规控制的要求只适用于这一确定的灭菌过程，而没有考虑其它降低生物负载的步骤的灭活作用。

注：附录A中给出的指南是非强制性的，不作为审核人员的检查清单。

II

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动物源医疗器械 第4部分：液体灭菌剂灭菌的确认与常规控制

1 范围

YY XXXXX本部分规定了使用液体化学灭菌剂，对全部或部分包括来源于动物材料在内的一次性

使用医疗器械灭菌的开发、确认、过程控制和监视的要求。

YY XXXXX本部分不适用于人类来源的材料。

YY XXXXX本部分不涉及用于控制所有生产阶段的质量保证体系。

注1： 要注意用于控制包括灭菌过程在内的所有生产阶段的质量体系的标准（见ISO9001和ISO13485或ISO9002和ISO13488）。

YY XXXXX本部分未涉及任何选用的灭菌方法对医疗器械使用的适宜性的试验。

注2： 此类试验是医疗器械设计和开发中的关键组成部分。

YY XXXXX本部分未涉及病毒灭活确认的方法。

注3： 开发包含来源于动物材料在内的医疗器械的加工方法时，由于这些特殊医疗器械生产中所用材料来源的影响，必须考虑液体化学灭菌剂对于潜在病毒污染的影响。对病毒灭活过程的确认的重要性已得到公认，故YY XXXXX本部分不包括这方面的要求，相关内容的欧洲标准正在制定过程中（EN12442-3）。

注4： 通常用于医疗器械中动物组织灭菌的液体化学灭菌剂，可能对灭活传播性海绵状脑病[如：牛海绵状脑病（BSE）]或瘙痒病的致病因子时不起作用。因此不宜用符合YY XXXXX本部分的合格确认结果来推断这一类传染因子已被灭活。

YY XXXXX本部分不包括医疗器械中灭菌剂残留量的水平。

注5： 此类信息见GB/T 16886.17。 2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。

GB/T 19001 质量管理体系 要求

GB 18281.1-2000 医疗保健产品灭菌 生物指示物 第1部分：通则（ISO11138-1:1994）

）

ISO 11737-1:1995 医疗保健产品灭菌 微生物学方法 第1部分：产品上微生物总量的估计1 注：附录B中给出了国际标准和欧洲标准的相互关系。 3 定义

YY XXXXX本部分使用下列定义。 3.1

批 batch

预期或声称其特性和质量是均一的并在一确定的生产周期中生产出的一定数量的散料、半成品或成品。 3.2

生物负载 bioburden

一件产品和/或包装上的活菌的总数。 1）

转化中。

1

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3.3

载体 carrier

涂有试验菌的支持材料。 3.4

试运行 commissioning

获得并出具书面证明，表明设备按技术规范提供和安装后，按照使用说明操作，其功能在规定范围之内。 3.5

D值 D value; decimal reduction value

在一定的作用条件下，灭活90％的试验菌所需时间（以分表示）或辐射剂量（以千戈瑞表示）。 3.6

作用时间 exposure time

在规定温度和灭菌剂浓度条件下，对医疗器械作用的时间。 3.7

灭活 inactivation

微生物生长和/或增殖能力丧失的过程。

注：本国际标准中的微生物包括芽孢菌和非芽孢菌、病毒、真菌和原生动物。

3.8

染菌载体 inoculated carrier 涂覆了规定数量的试验菌的载体 3.9

液体化学灭菌剂 liquid chemical sterilant

用于获得无菌状态的、具有确定化学配方的溶液或液体。 3.10

医疗器械 medical device

由生产厂设计成为下列目的用于人体的，不论是单独使用还是组合使用的，包括使用所需软件在内的任何仪器、设备、器具、材料或其他物品，这些目的是：

——疾病的诊断、预防、监护、治疗或缓解； ——伤残的诊断、监护、治疗、缓解或补偿； ——人体结构或生理过程的研究、替代或修复； ——妊娠的控制

其对于人体内或人体上的主要预期作用不是用药理学、免疫学或代谢的手段获得，但可能有这些手段参与并起一定辅助作用。 3.11

性能鉴定 performance qualification

设备随着试运行获得的并形成文件的证据，表明按过程规范进行操作时，将生产出合格产品。 3.12

灭菌前计数 presterilization count 灭菌前对活菌的计数。 3.13

产品适用性 product compatibility

灭菌过程在不对产品造成损坏的情况下，取得预期效果的能力。 3.14

2

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过程开发 process development

为了根据产品/包装/被灭菌物品摆放方式和/或设备限度来确定灭菌过程所进行的形成文件的研究程序。 3.15

重新确认 revalidation

重复部分或全部确认的试验要求，以再次证实过程的可靠性。 3.16

无菌状态 sterility

无存活微生物的状态。

注：实际上，这种无微生物存活的绝对提法是无法证实的（见3.18灭菌）。

3.17

无菌 sterile 无存活微生物。

注：实际上，这种无微生物存活的绝对提法是无法证实的（见3.18灭菌）。

3.18

灭菌 sterilization

用以使产品无任何类型存活微生物的确认过的过程。

注：在灭菌过程中，微生物的死亡规律用指数函数表示。因此，任何单件产品上存活微生物的存在可用概率表示。该概率可减少到很低，但不可能到零。该概率可用无菌保证水平（SAL）表示，通常用10表示。

-n

3.19

贮存液 storage solution

保存最终使用状态的医疗器械的液体。 3.20

确认 validation

表明某个过程将持续生产符合预定规范的产品所需数据的获取、记录和整理的形成文件的程序，

注：对于液体化学灭菌剂灭菌，确认包括试运行和性能鉴定的全过程。

3.21

活菌计数 viable count

在规定的培养条件下，通过长成的单个菌落数测定微生物的数量。

注：某一单个菌落数不一定来源于一个活的微生物。

4 总则

4.1 生产过程控制

应建立和控制生产过程，以保持灭菌前计数在规定限度之内。

注1：使用符合YY 0287的质量体系满足这一要求。

应建立和保持形成文件的体系，以控制来源于动物的原材料。

注2：YY/T XXXXX.2规定了有关来源、收集和处置的控制。

应有效执行YY XXXXX本部分所要求的形成文件的程序和说明。文件和记录应经过指定人员（见4.2）的评审和批准。 4.2 人员

应由符合GB/T19001规定的、有资格的人员负责设备（见4.4）的维护，使用液体化学灭菌剂进行灭菌的确认（见第5章）和常规控制（见第6章）以及产品的放行。 4.3 校准

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应为灭菌过程确认和常规控制所用的所有控制、指示和记录仪器建立一个有效的校准系统，并形成文件，加以保持。该体系应符合GB/T19001的要求。 4.4 设备维护

应按照形成文件的程序去策划和执行预防性维护。应规定每一策划的维护任务的维护程序和维护频次，并形成文件。

应对设备进行全面的维护并加以记录，否则不能用于医疗器械灭菌。 应按照GB/T19001的规定保留维护记录。

应由一名指定人员（见4.2）定期评审维护计划、维护程序和维护记录。 4.5 过程开发和产品适用性 4.5.1 更新产品、包装、灭菌摆放方式或灭菌过程之前，应对待确认的灭菌过程进行界定，并形成文件。

证明与以往确认过的产品、包装或被灭菌物品的摆放方式等效，应认为符合YY XXXXX本部分的要求，任何等等效性证明，均应形成文件。

注：规定的灭菌过程可包含用多种液体化学灭菌剂分别进行处理。

4.5.2 产品及其包装的设计应能使其与液体化学灭菌剂接触，且灭菌剂的残留量低于生产厂规定的水平。应确定出产品上最难灭菌的部位。

4.5.3 应证实灭菌过程不对产品使用或其包装造成不良影响，并形成文件。如果允许再次灭菌，应评价该过程的效果，并形成文件。 5 确认

5.1 总则

确认程序应形成文件，每一确认的记录应予以保留（见5.4.1）。 5.2 试运行

试运行应证实用于灭菌过程的设备符合规范要求。 5.3 性能鉴定

5.3.1 性能鉴定应证实灭菌过程具有：

a) 对有代表性范围内的微生物有适当的杀灭作用（见5.3.5，5.3.6和A.5）。

b) 确定的加工参数（如：时间、温度、液体化学灭菌剂浓度、 pH值）能在全过程中得到控制。 5.3.2性能鉴定应针对产品最难灭菌的部分来进行，如4.5.2中规定。 5.3.3 应按ISO11737-1的要求规定产品的灭菌前计数。 5.3.4 在进行性能鉴定之前，应对培养存活菌之前中和液体化学灭菌剂的方法予以确认，该方法本身不应对结果的解释产生不良影响。

5.3.5 应识别过程规范内最低杀微生物活性的条件组合，并应在性能鉴定中使用此条件组合。 5.3.6 微生物性能鉴定应包括以下三个阶段：

a) 筛选试验，用于识别对灭菌过程具有高抗力的微生物（见A.4.2.3）。 b) 灭活动力学的确定。

这包括对被认定为对过程具有高抗力的微生物建立其存活对数曲线。该灭活曲线应至少由能能覆盖数量降低千倍以上的5点组成（另见A.4.2.4.1和A.4.2.5）。若产品不适合于上述过程，可使用A.4.2.4.2中规定的MPN方法，这应说明理由，并形成文件。

微生物应存在于能代表医疗器械的载体材料上经受灭菌过程。

c) 对灭菌前微生物计数的灭活的评定，因为它们也被引到组织载体上生长。

所用的微生物范围，除生物负载中所包括那部分微生物之外，还应包括对灭菌过程具有已知高抗力的微生物。在任何情况下，其抗力应等同于符合GB18281.1要求的枯草杆菌牙孢（见表A.2）。

注：在这一试验的设计过程中，宜考虑有机和/或无机污染的水平和重复试验间的差异。

5.3.7 灭菌过程的作用时间应不少于D[6＋log10（100＋B）]，D是指在性能鉴定过程中所识别出的其

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抗力为最大的微生物的D值，B是指按ISO11737-1要求估计出的生物负载值。

注：本条文这一规定提供了至少1×10的微生物存活概率。EN556规定这是标注无菌的最终灭菌器械的要求（见附录C）。

-6

5.3.8如果在灭菌过程完成后对医疗器械进行无菌转移，则：

a) 应按照相应的国际标准对产品组成（如：容器，贮存液）的灭菌过程进行确认和常规控制。 b) 应按照ISO13408（见A.4.2.7）的要求对液体化学剂灭菌后的转移程序进行确认。 5.4 确认的出证

5.4.1 应以文件形式出具确认报告，包括全部确认过程的结果。报告应由负责编制、审核和批准的指定人员进行签署。应按GB/T19001中规定的要求保存确认报告。

5.4.2 确认报告应包括或引证形成文件的液体化学灭菌剂过程规范。该过程规范应规定所确认的医疗器械，并应详述以下方面（适当时包括各值和允差）：

a) 生物负载估测的频次、方法和作用限；

b) 制备液体化学灭菌剂、准备容器以及进行无菌转移（见5.3.8）的环境规范； c) 授权可从事无菌转移（见5.3.8）人员的培训以及人员证书的批准准则； d) 确保液体化学灭菌剂溶液（见A.6）中无活菌的方法； e) 液体化学灭菌剂的配方以及其组成的规范； f) 液体化学灭菌剂的pH值；

g) 灭菌过程之后，液体化学灭菌剂在化学浓度和/或杀微生物活性方面所需的残留活性；

h) 产品受液体化学灭菌剂作用所用容器的规范，包括构成材料、大小以及适用的所有预处理的详

细说明；

i) 每单位体积的液体化学灭菌剂可灭菌产品的数量； j) 灭菌作用时间； k) 灭菌温度；

l) 过程开发中的测定的其它关键过程变量；

m) 存放灭菌（见5.3.8）后产品的贮存液的灭菌方法。

5.4.3 如果对某一具体器械的确认也认为适合于其它器械，其理由应形成文件。 5.5 重新确认

5.5.1应至少每年对确认和随后的重新确认数据进行评审，应对是否需要重新确认说明理由并形成文件。

除非有足够的数据证实灭菌过程的持续适宜性，否则应进行重新确认。确认评审程序和重新确认的数据的评审程序应形成文件，并应保留重新确认的记录。

5.5.2 重新确认报告应形成文件。该报告应由负责出具、评审和批准该原先确认报告（见5.4.1）的同一机构/组织的指定人员进行签署。 6 过程控制和监视

6.1 应按ISO11737-1的要求，在规定的时间间隔内对生物负载进行估计。如果在灭菌前计数的常规估计中分离出一种在以往的性能鉴定时未曾研究过的微生物，应对其进行5.3.5中的步骤。

6.2 应记录并保留每一批灭菌产品的数据，以证实符合灭菌过程规范。这些数据应至少包括下列内容：

a) 适宜时，最终容器灭菌过程中监视的变量； b) 适宜时，贮存液灭菌过程中监视的变量； c) 液体化学灭菌剂的最初化学浓度和pH值； d) 液体化学灭菌剂制备过程中监视的参数；

e) 适宜时，任何对灭菌溶液过滤效果的试验结果； f) 作用时间；

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g) 作用时间过程中的温度；

h) 适宜时，无菌转移过程环境监视的结果； i) 下列人员的识别：

1） 制备贮存液和液体化学灭菌剂溶液的人员； 2） 控制灭菌过程的人员，和； 3） 适宜时，进行无菌转移的人员； j) 灭菌产品的号码（或其它唯一性识别）。

6.3 对使用化学灭菌剂进行灭菌的每一批医疗器械，应检验以下各项是否有活菌的存在：

a) 化学灭菌剂溶液； b) 贮存液，适用时； c) 以下至少一项：

1） 成品；

2） 已完成全部生产过程，但被剔除的产品；或

3） 一块分离的动物组织，证明能代表该医疗器械，并已经过全部的生产过程。

6.4 对每批医疗器械，应对

a) 液体化学灭菌剂，或

b) 灭菌过程后剩余的液体化学灭菌剂溶液

用一个接种了符合ISO11138-1要求、至少带有106、已知对灭菌过程具有高抗力（正如在性能鉴定中所识别的，见5.3）的微生物的动物组织载体，在该医疗器械相同的条件下进行挑战试验。

注：宜采取适当的预防措施，使污染生产设备造的风险降至最低。

6.5 如果使用大规模化学灭菌过程，就不适于将试验菌引入灭菌容器或生产环境中；如果

a) 液体化学灭菌剂的化学组成与其杀微生物活性之间的关系已经得到证实；且 b) 按6.4进行检验至少30批医疗器械的灭菌过程未出现不合格。 则可不必再持续进行6.4中所规定的试验，而应在灭菌过程结束后对剩余的液体化学灭菌剂进行全面的化学分析，以证明符合过程规范的限度。

注：30批这一数值的提出，是基于这样一个假定，即不合格达到0.95（α：0.95）的置信水平和0.9的置信区间的二项分布。

6.6 从6.2、6.3和6.4或6.5所得的结果，应作为允许无菌产品放行的证据的一部分，并应作为灭菌记录的一部分予以保留。

6.7 所有记录应按GB/T 19001所规定予以保留。 7 灭菌后产品的放行

7.1 对给定的灭菌过程是否符合要求的准则应形成文件。这些准则应包括：

a) 过程规范的符合性；和

b) 在微生物试验中（见6.3和6.4）培养后，无微生物生长。

7.2 如果下列情况发生，则应认为一个给出的灭菌过程是不合格的，不合格的产品应按GB/T 19001的规定进行处置：

a) 过程变量在文件规定的允差之外；或

b) 微生物试验（见6.3和6.4）培养后，表明有微生物生长。

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附录A

(资料性附录) 指 南

A.1 引言

本指南不作为评定是否符合YY XXXXX本部分的检查清单。

本指南提供的解释以及方法，适用于达到符合规定的要求。本指南用以帮助对YY XXXXX本部分的统一理解和执行。可使用本指南之外的方法，但宜证实所采用的这些方法能有效符合IYY XXXXX本部分的要求。

本指南不拟详细论述，而是只给出宜引起注意的重要方面。本指南给出了就如何认可其它能获得相同结果的方法来满足要求的例子。同时本指南也针对那些不易引起那些不熟悉医疗器械灭菌的人所重视的方面给出提示。

与本附录中的指南相对应的YY XXXXX本部分条文在方括号中给出。 A.2 人员[4.2]

不同层次人员所需的资格、培训和经验水平取决于其所从事的工作。GB/T19004.1中给出了作为质量保证体系组成部分的培训的总体指南。

宜对具有以下职责的人员进行具体的资格培训：

— 微生物学试验； — 兽医微生物学； — 化学分析和配方； — 设备安装； — 设备维护； — 物理性能鉴定； — 常规灭菌器的操作； — 校准； — 过程设计； — 设备规范； — 无菌加工； A.3过程开发和产品适用性[4.5]

A.3.1一个具体医疗器械的灭菌过程的开发，需要建立一个对医疗器械既有效又适用的过程。因此在产品的设计阶段，在确定和/或优化灭菌过程的实验的同时，就可开展产品适用性的最初研究。 GB/T19001和YY0287中规定了包括医疗器械设计在内的质量体系的要求。 A.3.2 在液体化学灭菌过程中，产品可能会承受环境压力。产品也可能会与所用的液体化学灭菌剂反应。因此产品的设计宜确保在预计的灭菌条件范围内，产品的功能性和安全性不会受到影响。

A.3.3选择医疗器械的灭菌过程时，宜将影响过程功效的所有因素考虑在内。考虑因素可包括（另见第1章的注5）：

a) 灭菌设备的可得到性；

b) 适用的灭菌设备提供的灭菌条件的范围； c) 其它产品已在使用的灭菌过程；

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d) 残留化学物质和/或化学反应产物的水平的要求；

e) 过程开发实验的结果；

f) 使用液体化学灭菌剂导致有抵抗力的微生物增殖的可能性。 A.3.4 一个过程开发中可包括一系列的要素：

a) 灭菌过程活动中，关键过程变量和这些变量范围的测定； b) 产品上生物负载的估计，以此确定灭菌过程的生物指示物; c) 宜确定性能鉴定和常规监视所用的被接种载体的适宜性。 过程开设活动的结果便是能确定一个灭菌过程。此灭菌过程的适宜性则是在性能鉴定研究（见5.3）中得到证实。 A.4 确认[5]

A.4.1 过程确认中生物负载的估计[5.3.3]

由于对动物组织进行生物负载进行估计特别困难，除按ISO11737-1外，本附录还提拱了指南。 估计生物负载的目的，有以下三个方面：

— 确定存在于产品上的污染微生物的属性； — 确定存在于产品上的微生物数量；

— 确定变量范围，从而通过比较连续批间染菌数量的变异程度来确定该污染的一致性。 宜对以下方面进行生物负载的估计：

— 来源于动物的始料；

— 每一重要加工阶段完成后的材料；

— 即将灭菌之前的产品（即：灭菌前计数）；

任何估计生物负载的方法只能表示出所含微生物的有限比例的数量和种类。因此，宜针对从产品上提取微生物的效率和检测这些微生物所用培养的效率中所固有的误差对生物负载值进行修正。估计动物组织的微生物的恢复效率可能变化很大，也可能非常低。因此为了保险起见，5.3.7中给出的作用时间的计算式中对生物负载增加了100这样一个安全系数，用于补偿上述局限。

宜注意选择适宜的培养基和计数所用的培养条件。另外，宜考虑分离与动物来源的材料相关的微生物的要求。表A.1中的培养基可能在某些情况下适用。 A.4.2 性能鉴定[5.3] A.4.2.1 总则

对来源于动物材料用液体化学灭菌过程的确认所用微生物种类的选择，宜考虑以下准则：

— 存在于动物组织来源的微生物种类；

— 产品生物负载估计过程中分离的微生物种类；

— 从动物组织采集的环境中和最终医疗器械生产的环境中分离的微生物种类； — 已证实对液体化学灭菌剂具有高抗力或可能会有增长抗力的微生物种类； — 微生物种类的范围。

表A.2中给出了已得到应用的一些微生物的示例， 早期已证实表中所列动物组织上的微生物对液体化学灭菌剂具有显著的抗力。此表仅作为指南，不作为必须评价的微生物的一览表。

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表A.1—促进生长的媒介、培养条件和微生物一览表 培养基1） 可能培养条件3） 证实能促进生长的 4） 试验微生物枯草杆菌 肺炎杆菌 绿脓杆菌/缺陷假单胞菌 表皮葡萄球菌 枯草杆菌 肺炎杆菌 绿脓杆菌/缺陷假单胞菌 酿酒酵母 红色毛菌 草分枝杆菌（3周） 枯草杆菌 肺炎杆菌 绿脓杆菌/缺陷假单胞菌 表皮葡萄球菌 肠球菌粪便 产孢梭菌 酿酒酵母 红色毛菌 产孢梭菌 1. 胰胨豆汤和 胰胨大豆琼脂 需氧 30℃－35℃ 2. 营养肉汤和营养琼脂 a. 需氧 30℃－35℃ b. 需氧 20℃－25℃ 需氧30℃－35℃ a. 需氧30℃－35℃ b. 需氧30℃－35℃ 3. 勒文斯坦氏（1） 4. 血液琼脂 5. 马铃薯葡萄糖琼脂 6. 罗伯逊氏疱肉（2） 需氧20℃－25℃ 需氧30℃－35℃ 1） 除了L-J培养基的特殊环境，其他培养基中不宜混入使指示剂染料（通常会抑制微生物的生长）颜色发生改变的颜色。当检测在液体培养基中的生长情况时，宜通过混浊度或者特殊的密度/显微镜方法进行目测，必要时，可用适宜的固态介质中的次培养基进行确认。 2） 这是带有降低特性的培养基，还可能适用于厌氧生长检测。 3） 除L-J培养基宜最少培养3周外，所有促进生长的最少培养期宜为两周。温度宜控制在给定范围的允差之内。受损微生物可能需要较长的培养期。 4） 宜对每一批的培养基进行试验，以证实该培养基对每个接种体可恢复10－100个微生物。（一批宜指用同一时间高压灭菌的同批原材料进行的单一制备）。宜用公认的标准菌库中的确定菌株进行试验。 如果使用含有10个微生物的接种体，则在固体培养基上很少能恢复10个菌落形成单位（cfu），因为： a) 在总计数和活菌计数方面将存有差异，和 b) 接种体上微生物的精确数量将以10为均值而左右变化。 只要恢复了接种微生物的一个或多个菌落形成单位（或在液体培养基中的可见生长），就能证明该培养基能支持试验菌生长。在对液体培养基进行试验时，如为了避免因稀释而带来的抑制作用，宜采用小体积（10cm3）。 微生物性能鉴定的三个阶段（筛选、存活曲线的构成和对组织载体灭活的评定）分别在A.4.2.3、A.4.2.4和A.4.2.5中予以考虑。 A.4.2.2 中和[5.3.4]

在着手进行微生物的性能鉴定之前，必须确保鉴定实验的结果没有受到因残留的液体化学灭菌剂

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引入到了恢复系统从而导致杀微生物或抗微生物作用的不利影响。可通过稀释、过滤去除或与中和剂反应的方法来降低杀微生物或抗微生物的物质的影响。

中和系统的选择将受液体化学灭菌剂组成的影响，并宜在性能鉴定开始之前，证实所选系统的有效性。

A.4.2.3微生物分离的筛选[5.3.6 a] A.4.2.3.1 总则

由于对产品上所有分离菌进行灭活研究通常是不切实际的，因此宜进行一个筛选试验。将组织样本置于低于加工条件的环境中时，较高抗力的分离菌便能很快地被分离出来以用于灭活研究。宜对比确认中（见表A.2）中选用的基准微生物具有更高抗力的所有分离菌充分进行识别。

由于灭菌过程所用的的液体化学物的应用是相对固定的，必须对检测、筛选和试验中所发现的那些会对灭菌过程产生显著抗力的微生物予以特别注意。由于在生产过程中具有可能引入新的微生物或微生物发生变异的风险，而这些微生物对灭菌过程的抗力可能比原试验和确认微生物更高，因此，宜建立对生产过程和环境中存在的微生物的抗力进行不断筛选和评价的程序（微生物分离菌筛选程序）（另见A.5）。

宜进行微生物筛选过程，以确保及时检测和评价新的或变异的微生物。 微生物分离菌筛选程序宜包括三个阶段： a) 微生物分离菌的收集； b) 微生物分离菌的识别； c) 挑战性试验（筛选）。 A.4.2.3.2 微生物分离菌的收集

宜从生产医疗器械的生产过程和环境中收集微生物分离菌。开始时，宜着重收集灭菌前的产品上存在的已知微生物（生物负载分离菌）。除产品上的生物负载以外，还宜从生产产品的生产环境中收集分离菌。此处所指的环境可包括，但不仅限于，加工溶液、工作表面、纯化水系统、原材料和人员。 A.4.2.3.3 微生物分离菌的表征

宜为评价所收集微生物分离菌进行表征和/或识别其是否适合于作为将来的基准。表征宜至少包括：菌落形态、细胞形态学、革兰氏反应和生长速率描述。可能时，最好是对种类或亚种类进行识别。 A.4.2.3.4 挑战试验（筛选）

宜按5.3.6的要求进行微生物分离菌的挑战试验。宜全面评价在最初挑战试验中表明对灭菌过程具有显著抗力的微生物分离菌，并将其与最初过程鉴定和确认研究中使用的微生物进行比较。宜评价该挑战微生物分离菌对整个灭菌过程的抗力。

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表A.2—用于特定液体化学灭菌剂活性评定的微生物示例 种类 芽孢属于： 产孢梭菌 枯草杆菌 短小杆菌 毛壳球菌 灰色微囊 营养细胞属于： 龟分枝杆菌 extroquens 甲基杆菌 白吉尔氏毛芽孢菌 3584 6051 9372 27142 6205 16594 35752 435 22310 ATCC1) － 3610 10327 － － 946 － － 菌库编号 NCTC2) 10696 3610 10692 － － 1474 9399 － NCIMB3) 注：可使用布达佩斯协定的规定菌库中的相似或等同菌种。 1）美国标准菌库 2）国家标准菌库 3）国立工业和海洋细菌收藏所 初始挑战性试验的一种方法是在最低灭菌过程规范条件下，将至少含有105的分离菌的菌悬液暴露于液体化学灭菌剂中，作用时间等于性能鉴定中所用的最高抗力微生物的D值。若试验完成后，仍能检测出存活菌，则表明该分离菌的抗力至少比性能鉴定中所用的最高抗力的微生物高20％。此时，宜对该分离菌进行全面的定性，并对其进行详细的灭活动力学研究。 A.4.2.4 微生物灭活动力学的研究[5.3.6] A.4.2.4.1 总则

性能鉴定应包含每一种微生物的灭活曲线，曲线应最少包括五个点，且数量上至少降低千倍。每一点通常采用三次重复测定，且宜在两倍标准偏差范围内具有重现性。

该试验过程中所用最高抗力的微生物的D值可由试验所得结果计算得出。只有对数存活曲线（存活数量的对数值相于对作用时间的曲线）呈线性，才可能进行D值的计算。若偏离线性，则较难预测一个有效的灭菌过程，宜进一步研究此类偏离，以便更好地表征灭活动力学。

当可恢复的微生物的存活分数较低时，为估计其D值，可用最大可能数（MPN）法测定三种对灭菌过程有极大抗力的微生物。该D值可表明计算出的作用时间是否可接受。

GB 18279附录B中给出了D值测定的MPN法，在YY XXXXX本部分A.4.2.4.2中也有进一步的论述。

A.4.2.4.2 研究阶段

液体化学灭菌过程的确认，宜能使试验微生物与医疗器械之间可能发生的相互作用得到评价。这可通过对带有该试验微生物的器械或接种上该试验微生物的器械的灭活动力学的确定来完成。

此项评价需要研究人员进行以下四个基本阶段的研究工作：

— 确定液体化学灭菌剂最难到达的组件；

— 明确医疗器械或选择组件上微生物的建立方法；

— 确认医疗器械或选择组件上试验微生物的恢复/检测方法； — 确定医疗器械或选择组件上该试验菌菌的灭活动力学。

试验方法可采用直接计数建立存活菌数量－时间曲线（存活曲线）的方法，也可用最大可能数

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（MPN）估计的方法（如：Stumbo、Murphy、Cochrana或Spearman karber法）[17]。最好是用存活曲线法，因为该法能获得足够多的数据来确定在有医疗器械或所选组件的情况下试验微生物相对于时间的灭活动力学。如果因有医疗器械或组件的存在而无法对存活菌群进行恢复（即：无法浸透医疗器械或载体，从而无法估计存活微生物菌群），就只能使用MPN方法。

虽然直接计数建立存活菌曲线的方法提供了较多的有关试验菌灭活动力学的信息，但即需要消耗较多的时间和财力。直接计数程序是在预定的液体化学灭菌剂中的暴露时间完成之后，设法提取全部活的试验菌。可按生物负载估计（ISO11737-1）中所用的提取技术。如：用均化该试验组件和制备适于存活菌计数的稀释液。

可以在无菌稀释液中无菌浸透或混合试验组件（即：动物组织）使该组件均化。制备一系列的相同稀释液，用标准计数方法（见ISO11737-1）对相应的稀释液进行存活菌计数。 A.4.2.5 组织载体的使用 A.4.2.5.1 总则

使用悬浮液试验中被证实对液体化学灭菌剂具有最高抗力的微生物，宜评价试验组件中该试验菌的灭活动力学。这一研究设计宜包括接种过的或培养过的试验组件在液体化学灭菌剂中相对于时间的对照（“最坏状况”）暴露。样品宜在预定时间间隔内取出，用确认过的恢复方法估计存活菌的总数。

根据完成的灭活动力学研究，宜绘制估计出的存活菌数的对数值对应于时间的存活菌曲线。然后便能确定最坏状况的灭菌条件下，试验组件上试验菌的D值。宜进行不少于三次灭活动力学的评价，以证实其重现性。

A.4.2.5.2 载体选择

微生物灭活动力学研究宜在最不利于灭菌过程的载体材料上进行。载体的选择宜考虑载体与液体化学灭菌剂的接触和/或相互作用（如：疏水性的纤维状材料会比亲水性的光滑表面更难以灭菌）。

如果载体不易选择，则宜进行能识别最难灭菌载体的筛选试验。 A.4.2.5.3建立试验组件（载体）上的微生物

为了创建一个模拟试验，以便评定灭菌过程的有效性，并以一种与实际的灭菌方式相近的方式进行估计，液体化学灭菌剂作用前在载体上建立存活微生物的方法非常重要。在试验组件上建立存活微生物的方法有两个：直接接种法或在模拟生产条件下培养法。

直接接种法是在暴露于液体化学灭菌剂之前，将活芽孢或细胞悬液接种于载体上。宜考虑在暴露于液体化学灭菌剂之前，向载体内渗透和附着的接种时间。另外，也宜对载体上细菌的影响予以考虑。

宜采用模拟生产条件下培养的方法，当所选定的微生物在正常生产条件下能在产品内/上生长时，该方法优先于直接接种法。宜确立试验菌载体的培养条件。在此条件下，产品内/上所存在的活菌的水平必须不低于1000cfu，并在液体化学灭菌剂作用之前，同一培养系统中各组件上彼此是均匀的。在即将进行灭活动力学研究之前，宜收集用以证实最小数量和均匀性的数据。

宜对受液体化学灭菌剂作用之后的恢复载体上存活微生物的方法进行确立和确认。该确认宜能证实所选择的恢复存活微生物的方法具有重现性。 A.4.2.6 有机物质的影响

对某些产品来说，有机物质造成的污染会成为过程功效的因素。研究宜包括对含相应有机物质（如：血清、白蛋白等）的溶液或无菌浸透的组织悬液的评价。有机物质的种类及浓度宜形成文件。

对于含有机物质并要经过干燥的产品，接种过相应微生物的载体也宜在适宜的有机物质中被干燥。这样所接种过的载体宜包括抗干燥微生物，如：产孢梭菌芽孢、谷草杆菌芽孢、肠球菌粪便、龟分枝杆菌、白色念珠菌（见表A.1和A.2）。 A.4.2.7 无菌操作过程的确认[5.3.8]

产品由灭菌剂中移至最终无菌容器中的无菌转移过程也需进行确认，该确认宜包括以下：

a)按灭菌过程的国际标准（见GB18278、GB18279和GB18280）的要求对空容器灭菌所用的过程； b) 用于产品无菌转移的贮存液的灭菌过程；

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b) 注：宜按照ISO13408-1的要求进行过滤除菌。

c) 无菌转移所处环境的物理和微生物监视；

d) 利用媒介试验，模拟从灭菌剂溶液向最终容器转移时的可能暴露环境的无菌转移技术。 A.5 常规微生物监视[6.1]

宜常规性地进行微生物分离和挑战性试验。此类试验的目的是用来监视在灭菌过程中存在的微生物可能发生的改变。确认程序是用以针对给定范围的微生物评价灭菌过程，而常规试验则是为灭菌过程中所存在的微生物不比最初确认研究（另见A.4.2.3.1）中所用的微生物具有更高的抗力提供证据。 A.6 过程控制和监视[6]

使用液体化学灭菌剂的灭菌过程通常包含多个阶段：

— 液体化学灭菌剂的制备；

— 在控制温度的条件下，产品受灭菌剂作用一个规定的时间； 若非最终灭菌过程，则附加以下两个阶段：

— 产品的初包装及其所用贮备液的制备和灭菌； — 产品由灭菌剂移至初包装的无菌转移过程。

需仔细控制灭菌剂的制备过程，宜保留诸如批号、批量的有关记录，并宜通过分析确定符合这些活性成分的最终浓度。灭菌剂溶液通常在使用前被过滤，以滤除灭菌剂各组分中的微生物和其它杂质。过滤后宜对过滤器性能进行测试。

灭菌过程要求在温度受控的条件下，并在有明确技术规范的灭菌容器中进行。

为评定一个过程的常规可接受性，宜在产品取出后检查灭菌剂的组成，此类检查可以是化学的或生物学的。化学检查可以通过试验确认在过程全部完成之后，各组分在规范要求的范围之内。微生物检查则例如，将接种过的载体暴露于该灭菌剂中，以证实其持续的杀灭微生物的功效。

在受灭菌剂作用之后，产品可能要无菌转移至最终容器中。在转移过程中，宜对周围环境进行微生物监视。

宜建立和保持经考核的从事无菌转移的人员的名单。这一被批准的人员名单宜保持不断的评审，并在规定间隔内重新考核。鉴定和重新鉴定一般都采取介质转移的形式，类似于鉴定过滤除菌和无菌操作过程所用的“营养肉汤灌装（broth fills）”的方法。

如果产品存放在贮存液中，贮存液在使用前宜进行灭菌。如果使用了无菌操作过程，则宜符合ISO13408-1。

在最终产品上进行无菌试验只能为一批产品提供一个有限的无菌水平。然而灭菌过程（见6.3）完成后，这一特殊应用，可通过微生物污染试验来检测出某些大的失误。当进行此类微生物学试验时，要确保残留的杀微生物活性的灭菌剂或贮存液（见A.4.2.2）已全部去除。

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参考文献

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[11] EN12442-2:2000医疗器械生产用动物组织及其衍生物 第2部分：来源、收集和处置的控制 [12] EN12442-3: 2000医疗器械生产用动物组织及其衍生物 第3部分：病毒和传播媒介的去除与灭

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