金银花活性成分绿原酸与不同蛋白质相互作用机制的比较分析研究

金银花活性成分绿原酸与不同蛋白质相互作用机制的比较分析研究

目的：分析比较金银花活性成分绿原酸（chlorogenic acid，CGA）与乳铁蛋白（bovine lactoferrin，BLF）及血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的分子作用机制。方法：光谱法结合计算机模拟技术测定药物与蛋白质相互作用的结合参数、能量转移参数与热力学函数，探讨分子作用机制并比较分析绿原酸与不同蛋白质的相互作用差异。结果：CGA与BLF的相互作用表现为动态分子作用机制，而CGA与BSA结合生成静态复合物，结合强度因温度不同存在一定差异；金银花活性成分与各蛋白质的结合距离 r 均很小，说明发生了能量转移现象；分子模建结果显示药物与蛋白质的相互作用力主要是氢键，兼有范德华力和疏水作用。结论：计算机模拟与实验测试获得了一致性结果。

标签： 绿原酸；乳铁蛋白；血清白蛋白；荧光光谱；紫外吸收光谱；分子模建

血清蛋白质高丰度组分含有白蛋白、转铁蛋白（乳铁蛋白为转铁蛋白家族之一）、免疫球蛋白等。白蛋白、乳铁蛋白具有贮运内源代谢产物和外源药物分子/离子等重要生理功能[3-4]，是药物分子与蛋白质分子相互作用研究中的理想模型分子。开展不同种类蛋白质与药物分子相互作用机制的比较分析研究，对于更全面地了解药物的功效性能、蛋白质的结构与功能以及蛋白质与药物之间相互作用的本质都有重要意义。BLF与BSA结构迥异，BLF由6个氨基酸残基组成，呈“二枚银杏叶型”立体结构，包括C叶和N叶，中间通过“铰链区”联接。每叶又包括2个结构域（N-1和N-2，C-1和C-2）。在每个叶的2个结构域之间结合铁离子[5-7]。BSA[8]由582 个氨基酸残基组成，空间结构含3个结构域，每个结构域由2个亚结构域以槽口相对的方式形成圆筒结构，圆筒内部构成疏水腔。CGA作为一种活性中药成分与乳铁蛋白的相互作用研究未见报道，也仅有与亲和色谱HSA（人血清白蛋白）固定相的相互作用研究，故开展CGA与BLF，BSA相互作用机制的研究非常有必要。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 绿原酸（CGA，≥99%，南京泽朗医药科技有限公司）；牛乳铁蛋白（bovine lactoferrin，BLF，≥98%），牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA， ≥98%），三羟甲基氨基甲烷（Tris， GR） 均购自上海华美生物工程公司；其他试剂均为分析纯，实验用水为亚沸蒸馏去离子水。配制0.1 mol·L-1，pH 7.3 Tris-HCl缓冲溶液（内含0.10 mol·L-1 NaCl维持离子强度），用此缓冲溶液配制1.0×10-5 mol·L-1BFL/BSA溶液及1.0×10-3 mol·L-1CGA溶液。F-4500型荧光光度计（日本Hitachi公司）；UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；SGI O2计算机图形工作站。

1.2 方法 CGA-BLF/BSA荧光光谱及同步荧光光谱测定：移取2.5 mL BLF，BSA溶液于1 cm石英比色皿中，微量进样器逐次加入1.0×10-3 mol·L-1 CGA溶液进行荧光滴定（滴定剂累加体积≤200 μL），Tris-HCl缓冲溶液做荧光空白校正，

狭缝宽度为2.5 nm，扫速200 nm·min-1，固定激发波长282 nm，绘制250～500 nm发射光谱；荧光光谱仪扫描激发和发射波长之间波长差分别为 Δλ =15 nm和 Δλ =60 nm上述溶液体系的同步荧光光谱。

CGA-BLF/BSA紫外吸收光谱测定：移取2.5 mL Tris-HCl缓冲溶液于1 cm石英比色皿中，逐次加入1.0×10-3 mol·L-1 CGA溶液，使其浓度为1.0×10-5 mol·L-1，测定200～500 nm紫外吸收谱。

1.3 计算机模拟 利用SGI O2工作站上的DOCK 4.02程序包建立药物与蛋白质相互作用模型，进行分子模拟计算。受体蛋白BLF的晶体结构从PDB蛋白质晶体数据库获得，编码3O97；受体蛋白BSA的晶体结构以HSA模拟替代，编码为1h9z。ChemDraw工具构建CGA分子结构，基于MM2力场优化生成实验分子模型，分子对接预处理时使用AutoDock Toolkit（ADT）进行受体与配体的优化处理。分子对接技术确认BLF和HSA活性部位[9-10]，经验势能函数评价配体与受体的最佳结合方式。

2 结果与分析

2.1 CGA与BLF，BSA的荧光光谱、紫外光谱及作用机制 CGA-BLF/BSA体系随CGA浓度变化的荧光光谱图见图1，随着CGA浓度的增加，蛋白质的荧光有规律地猝灭，同时CGA-蛋白质体系的荧光谱峰出现了较规则的红移，表明此结果是增大了各蛋白质微区环境的极性。CGA本身无荧光现象，CGA的加入造成BLF/BSA产生荧光猝灭，说明CGA与BLF/BSA发生了相互作用。a.CGA荧光； c（CGA）=1×10-5 mol·L-1。

图1 CGA-BLF/BSA体系的荧光猝灭光谱（25 ℃）

Fig.1 The fluorescence quenching spectra of CGA-BLF/BSA systems（25 ℃）

CGA与BLF和BSA相互作用的紫外吸收光谱见图2，可知随着CGA用量增加，各体系的吸光度呈规律性降低，也说明2种蛋白质与CGA都存在相互作用。荧光光谱与紫外光谱的结果均表明，CGA与BLF/BSA确实存在相互作用，并且使蛋白质的微区环境发生了变化。温度为42 ℃条件下各体系的荧光光谱、紫外光谱类似于图1，2，不一一列出。

图2 CGA-BLF/BSA体系的紫外吸收光谱（25 ℃）

Fig.2 The ultraviolet absorption spectra of CGA-BLF/BSA system（25 ℃）

荧光猝灭机制可分为静态猝灭和动态猝灭[11]。动态猝灭过程遵循Stern-Volmer[12]方程：

式中， F 和 F0分别为加入和不加入CGA时BLF，BSA溶液的荧光强度； Kq为双分子猝灭过程速率常数； τ0是猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命（ τ0

为1×10-8 s[13]）；[ D ]是猝灭剂的浓度； Ksv为Stern-Volmer猝灭常数，即双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比率。

为确定CGA对BLF/BSA的猝灭机制，按Stern-Volmer方程处理各组荧光猝灭数据，获得猝灭常数 KSV及双分子猝灭过程速率常数 Kq，见表1。可见随着温度升高（25 ℃至42 ℃），CGA-BLF体系的猝灭常数随着温度升高而增大，表明猝灭机制应为动态猝灭；而CGA-BSA体系的猝灭常数呈降低趋势，表明猝灭机制应为静态猝灭。由于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2.0×1010 L·mol-1·s-1[14]，而从表1结果来看， Kq数量级在1012，从这点考虑，猝灭机制应均为静态结合反应[12]。但考虑到实验体系为离子溶液，离子强度是影响猝灭系数的重要因素，可以认为 Kq的增大可能是离子强度影响的结果。

表1 不同温度下CGA分别与BLF/BSA相互作用的猝灭 参数

Table 1 The quenching constants of CGA on BLF/ BSA at different temperatures L·mol-1

2.2 CGA与BLF和BSA相互作用的结合常数及结合位点 药物-蛋白质相互作用研究根据具体的反应机制采用不同的理论方程。本实验采用方程式（2）拟合实验数据，从而获得结合参数[15]。

式中 F 和 F0的含义与公式（1）中的相同， K 为结合常数， n 为结合位点数，[ Dt]为猝灭剂的浓度。由图1所得实验数据，根据方程（2）线性拟合计算结合常数和结合位点数，见表2。由表2可知：①不同温度下，所求结果都有良好的相关系数，且CGA与BLF/BSA的结合常数均较大，说明CGA与BLF/BSA均有较强的结合作用；②各体系的结合常数随着温度的升高而降低，说明随温度的升高，药物CGA与BLF/BSA的结合作用减弱；③相同温度下，由于BLF及BSA分子结构不同，CGA与BLF及BSA的结合常数不同。CGA-BLF体系的 K 均大于CGA-BSA体系，说明CGA与BLF的结合能力强。

表2 不同温度下CGA与BLF/BSA相互作用的结合参数

Table 2 The binding constants of CGA with BLF/BSA at different temperatures

注： n =7。2.3 体系能量转移参数的测定 按照Fōrster能量转移理论[16]，荧光发射体和荧光猝灭体之间能量转移效率 E 与两者之间的距离 r 及临界能量转移距离 R0相关：

其中 E 为能量转移效率， R0是 E =50%时的临界能量距离（nm）：

式中： K 2为偶极空间取向因子 （ K 2=23[17]）； N 为介质的折射指数 （ N =1.336）； Φ 为蛋白质分子的光量子效率（Φ=0.13）； J 为蛋白质分子荧光发射光谱与药物吸收光谱间的光谱重叠积分（cm3·L·mol-1）。其中：

式中： F （ λ ）为蛋白质分子在波长 λ 处的荧光强度；ε（ λ ）为药物在波长 λ 处的摩尔吸收系数，L·mol-1·cm-1。则能量转移效率 E 可按式（6）确定：

CGA与BLF/BSA的重叠光谱图，见图3。按式（5）计算CGA-BLF/BSA体系的光谱重叠积分，代入公式（4），（6）求得各体系 R0及 E ，进而由公式（3）求出CGA与BLF/BSA间的结合距离 r ，求得的能量转移参数，见表3。

图3 CGA与BLF/BSA的荧光发射光谱（1）和紫外吸收光谱（2）的重叠图（25 ℃）Fig.3 Overlapping between the fluorescence spectra（1） and UV absorption spectra（2） of CGA and BLF/ BSA （25 ℃）

表3 CGA与BLF/BSA相互作用的能量转移参数

Table 3 The energy transfer parameters among CGA and BLF， BSA

由表3和图3可见，CGA与BLF/BSA结合距离均小于7 nm，说明药物与血清蛋白质之间确实发生了非辐射能量转移。分析结果得出如下规律：①CGA-BLF，CGA-BSA体系的能量转移效率均随温度升高而增大，但能量转移效率未发生显著改变，均在20%左右；②温度对CGA-BLF，CGA-BSA体系的结合距离参数产生一定影响，随着温度升高，结合距离 r 逐渐减小；③由于BLF及BSA分子结构不同，相同温度下，CGA-BLF体系的结合距离略小于CGA-BSA体系，说明CGA与BLF的结合更紧密。

2.4 同步荧光光谱 蛋白质同步荧光光谱中， Δλ =15 nm显示酪氨酸残基的光谱特征， Δλ = 60 nm显示色氨酸残基的光谱特征[18]，同步荧光光谱可显示蛋白质色氨酸残基、酪氨酸残基所在位域的微区环境极性，进而由微区环境的极性变化推断蛋白分子构象的改变。CGA与BLF/BSA结合反应的同步荧光光谱，见图4。

A. Δλ =15 nm，B. Δλ =60 nm。

图4 CGA-BLF，CGA-BSA体系的同步荧光光谱图（25 ℃）

Fig.4 Effect of CGA on synchronous flurescence spectra of BLF， BSA（25 ℃）

从图4可见，随着CGA的加入，各体系蛋白质酪氨酸与色氨酸残基的内源荧光均发生了一定程度的猝灭，但色氨酸的荧光强度变化程度明显大于酪氨酸，表明CGA主要是与蛋白质分子的色氨酸残基结合形成复合物，而导致蛋白质的构象发生变化。 Δλ =15 nm时，随着CGA浓度的增大，同步荧光光谱最大发射波长基本上没有发生位移； Δλ =60 nm时，随着CGA浓度的增大，同步荧光光谱最大发射波长均发生不同程度的红移，可见BLF，BSA的构象变化主要是由于色氨酸残基的微区环境改变所致。

2.5 热力学参数和作用力类型的确定 药物和蛋白质之间的作用力包括氢键、范德华力、静电作用力、疏水作用力。根据反应前后热力学焓变 ΔH ﹑熵变 ΔS 的相对大小，可判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型[19] ： 当 ΔS >0 时，为疏水作用力； ΔH 0主要为静电作用力； ΔH <0， ΔS <0主要为氢键或者范德华力。根据范特霍夫公式[20]，可由不同温度下的结合常数，求得各体系的 ΔH ， ΔS 和 ΔG 。通过公式（7），（8），（9）计算CGA与BLF/BSA结合过程的热力学参数，见表4。分析表4数据可知：CGA与BLF/BSA体系相互作用的 ΔH <0， ΔS <0，因此，可以判断CGA与2种蛋白质分子之间的相互作用力主要为氢键和范德华力。

Table 4 Thermodynamic parameters of every system at different temperatures

2.6 分子模拟研究 本文分子模建CGA与BLF，BSA相互作用的结合反应模型时，分子对接通过参数对比来寻找CGA结合BLF/BSA的活性位点与最优结合模式[21]。因为蛋白质数据库中目前尚无BSA分子的完整结构信息，参考相关文献后了解到，采用同源建模方法构建BSA空间三维结构与直接选用高序列同源性HSA进行对接的方法均可行。考虑到本实验室条件有限（缺少同源建模软件），也没有相关的工作基础，故选用HSA结构数据进行CGA与BSA分子的计算机模拟研究。拟在后续研究中开展同源建模法构建BSA三维空间结构，进而开展分子模拟计算并进一步进行2种方法的对比研究。基于CGA的结构特点，进行分子对接模拟计算时，考虑HSA的Sudlow’s sites I，sites II，6个脂肪酸结合位点及warfarin药物结合位点进行CGA分子对接的模拟计算工作。CGA-BLF体系分子模拟结果见图5（显示配体周围10.0 范围内的氨基酸残基）、图6（显示配体周围20.0 范围内的氨基酸残基），CGA-HSA体系分子模拟结果见图7（显示配体周围10.0 范围内的氨基酸残基）。结果显示，BLF和HSA分子活性对接位点对接CGA获得了最优结果，图5和图7清晰展现CGA与BLF和HSA的结合位域及相互作用力。

图5 CGA与BLF作用的分子对接（A）及疏水表面图（B） （10.0）

Fig.5 Interaction mode （A） and hydrophobic surface map （B） between CGA and BLF， only residues around 10.0 of the ligand are displayed

图6 CGA与BLF作用的分子对接图 （20.0）

Fig.6 Interaction mode between CGA and BLF， only residues around 20.0 of the ligand are displayed

由图5可以看出，CGA分子结合在BLF的表面活性口袋处，整个分子处于被包围状态。CGA分子距BLF酪氨酸残基（Tyr668）及苯丙氨酸残基

图7 CGA与HSA作用的分子对接图（A）及疏水表面图（B） （10.0）Fig.7 Interaction mode （A） and hydrophobic surface map （B） between CGA and HSA， only residues around 10.0 of the ligand are displayed

（Phe156）很近，这很好解释了CGA能够猝灭BLF内源荧光的现象。同时，CGA分子与BLF结合过程中，CGA羰基上的氧原子与Gly 652发生氢键相互作用，且CGA羟基上的氧原子与Gly 652，Leu 661，Val 591发生氢键相互作用；另一方面，CGA非共价结合在BLF活性位点域，其结合口袋周围主要由Ala 412，Ala 590，Ala592，Ala 5，Pro409，Pro429，Pro593，Pro655，Leu651，Leu661，Val591，Val666氨基酸残基形成一个疏水区域。由分子模拟结果可知氢键在CGA-BLF复合物形成中起重要作用，是该药物和蛋白质分子结合的主要驱动力，同时也兼有疏水作用存在，此结果与热力学实验结果相一致。

光谱实验结果显示BLF中色氨酸残基所在微区位域与CGA分子之间具有明显的相互作用，实验测得CGA-BLF分子的结合距离为3 nm左右，而由图5可见在配体周围10.0范围内没有色氨酸残基，因此将CGA-BLF周围20.0的氨基酸残基通过分子对接图显示出来（没有改变CGA-BLF内核结构及相互作用力），结果见图6。从图6可见，在该结合距离范围，确实存在色氨酸残基Trp347，Trp361，Trp448，Trp467，Trp549，并且对接结果显示的Trp347与CGA分子的距离与实验所测得的结合距离相符，这充分提供了CGA猝灭BLF内源荧光的证据。

由图7可见，CGA分子结合在HSA的表面活性口袋处，CGA分子距HSA酪氨酸残基（Tyr668）及苯丙氨酸残基（Phe156）很近，这解释了CGA猝灭HSA内源荧光的现象。同时，CGA羰基上的氧原子与HSA的Arg485发生氢键相互作用，CGA羟基上的氧原子与HSA的Leu481，Lys195发生氢键相互作用；另一方面，CGA非共价结合在HSA活性位点域，其结合口袋周围主要由Met446，Ala194，Ala201，Ala499，Leu457，Leu453，Leu198，Leu481，Leu345，Val343，Val344，Val455，Val482，Pro384，Pro486，Phe211，Trp214氨基酸残基形成一个疏水区域，说明有疏水作用存在。由图7分子模拟结果可知，CGA与HSA之间的主要作用力为氢键作用，兼有疏水作用存在，此结果与热力学实验结果相一致。

为了验证DOCK对接体系对所做的分子对接是否适用，作者进行了re-dock验证。把3O97体系中的配体IAA（indole acetic acid）抽提出来后再将此配体与BLF用DOCK方法重新进行对接，对接完成后与原对接体系进行比较，经过比较发现2次对接后配体在蛋白中的位置很相近。在原体系中，IAA配体周围的氨基酸残基分别为Thr430，Gly432，Pro593，Asn594，Tyr660，Gly662。在re-dock后的体系中，IAA配体周围的氨基酸残基分别为Thr430，Gly432，Pro593，Asn594，Tyr660，Gly662，Glu6，Tyr665，即氨基酸残基基本相同。同理，1h9z体系中的配体RWF（R-Warfarin）抽离出来并用DOCK方法进行对接后，再与原对接体系进行比较发现2次对接后配体在蛋白中的位置很相近。在原体系中，RWF配体周围的氨基酸残基分别为Ala215，Arg218，Arg257，Leu260，Ser287，Ala297。在re-dock后的体系中，IAA配体周围的氨基酸残基分别为Ala215，Arg218，Leu238，Arg257，Leu260，Ser287，Ala297，即氨基酸残基大致相同。此结果说明采用的分子对接方法可信。

3 结论

本文利用光谱实验结合分子模拟技术研究了金银花活性成分绿原酸与2种不同蛋白质的相互作用。实验结果表明，CGA与BLF的反应机制为动态猝灭机制，而与BSA之间的反应机制为静态猝灭机制。根据能量转移理论求得了药物分子与BLF和BSA的结合距离和能量转移效率，表明发生了非辐射能量转移现象。同步荧光光谱结果显示，CGA的加入可以引起2种蛋白质构象型态的转变。

分子模拟结果揭示了药物在2种蛋白质上的结合位域、非共价相互作用结合位点以及起主要作用的氨基酸残基等结构信息，并综合热力学实验结果，确定了BLF和BSA与CGA的主要作用力为氢键；本工作在一定程度上从分子水平阐明了绿原酸与2种蛋白质的分子作用机制，所得结果对于绿原酸的药用机制研究具有一定参考意义。

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Study on honeysuckle active ingredients and comparative analysis on their

interactive mechanisms with different proteins

GUO Ming*， ZHAN Min-zhong， LU Xiao-wang， FAN Wen-xiang

（School of Engineering， Zhejiang Agriculture & Forestry University， Lin′an 311300， China）

[Abstract] Objective： To analyze and compare molecular mechanisms of active ingredients of honeysuckle （chlorogenic acid， CGA） with bovine lactoferrin （BLF） or bovine serum albumin （BSA）. Method： The spectral experiment and the computer analog technology were combined to determine the binding parameters， energy transfer parameters and thermodynamic functions between CGA and proteins， study the molecular mechanism， and compare the differences in interactive mechanism between CGA and BLF or BSA. Result： The interactive mechanism between CGA and BLF or BSA was a dynamic molecular mechanism， whereas the static quenching mechanism existed between the interaction of CGA and BSA， with differences in the bonding intensity due to difference temperature. The binding distance r between CGA and BLF/BSA was very short， indicating the phenomenon of energy transfer. The results of the molecular modeling showed that the main interaction force between CGA and BLF or BSA was hydrogen bonds， together with Van der Waals′ forces and hydrophobic effect. Conclusion： The computer analog shows consistent results with spectral experiment.

[Key words] chlorogenic acid； bovine lactoferrin； bovine serum albumin； fluorescence spectroscopy； UV absorption spectroscopy； molecular modeling

doi：10.4268/cjcmm20131633