细胞生物学课程论文 植物种质的超低温保存研究
摘要：植物超低温保存技术在濒危植物资源的保存中发挥着巨大的作用，并正处于快速的发展中，已经能够较为有效、安全地长期保存一些珍贵稀有的种质。本文先介绍了超低温保存的意义，之后详细叙述了超低温保存的步骤与不同的方法，阐述了当下此技术的研究进展与问题，并对今后此技术的研究作出了展望。 关键词：超低温保存；意义；方法；进展；展望
1.珍稀植物种质的深低温保存意义
我国是一个植物资源较为丰富的国家, 约有高等植物3万多种,占世界第三位,并且特有程度高, 生物区系起源古老, 是世界上屈指可数的植物遗传资源起源中心之一。但是近年来, 随着人们对自然资源需求的增加与地球气候变化,植物种质资源的多样性急剧下降，物种流失的态势不容乐观。“全球植物保护策略”讨论了中国植物濒危状况,估计我国受威胁的物种比例达20-25%，甚至更高。世界自然保护联盟(IUCN) 在《植物红皮书》中指出: 在全世界分布的约25万种维管束植物中,估计约有2万～2.5万种处于很稀少或受严重威胁的状况，这意味着人类赖以生存的植物资源陷入了生存危机。因此，如何保存现有的植物种质不再受到破坏，保护植物种质资源的多样性已成为全球关注的话题。植物育种技术的发展,高产品种单一化日益明显, 植物遗传基础越来越窄。常规的植物种质资源保存以田间种植、室内贮藏等形式为主,需要大量的人力、物力等,使之难以广泛应用。近年来, 在离体培养技术基础上发展起来的超低温保存技术,以其无菌培养、保存稳定、占用空间少等优点在植物种质资源的长期保存中受到了人们的重视, 得到了广泛的应用。植物种质超低温保存是指在低于-80℃的低温条件下对植物器官、组织或细胞进行保存，一般以液氮为冷源。植物材料在这样的低温下，活细胞内的代谢和生长活动几乎完全停止，能够有效保持植物材料的遗传稳定性, 同时又不会丧失细胞活力和形态发生的潜能。这就有可能极大地延长储存材料的寿命，避免细胞和组织的染色体数目因长期继代而发生的变化和离体材料在长期无性繁殖过程中可能造成的退化和病虫侵害，从而有效、安全地长期保存那些珍贵稀有的种质。同时，它还有利于国际间进行种质交换，为遗传育种和理论研究提供较好的材料。 2.超低温保存方法与技术
目前超低温保存的主要方法有：快速冰冻法、慢速冰冻法、两步冰冻法、逐级冰冻法、
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干燥冰冻法、玻璃化法、包埋干燥法、包埋玻璃化法等。
超低温保存技术基本操作包括七个步骤。选择适宜年龄和生长状态的冷冻材料是超低温保存技术中的第一步, 它不仅关系到材料本身的抗寒力, 而且与此后冰冻保护剂的选择、降温冰冻和化冻速度等都有密切关系。由于植物的基因型、抗冻性以及器官、组织和细胞的年龄、生理状态等因素对超低温保存效果有较大的影响，而且这种差别不仅表现在种间, 即使是同种内不同品种间也不同。从而要根据所选的的材料在整个保存处理过程中采取相应的方法。第二步是对生物材料进行预培养，主要为了提高相细胞的比例和减少细胞内自由水的含量，提高植物材料对低温环境的抗性而使材料达到最适于超低温保存的生理状态。预培养的方式主要有冷驯化和在培养基中添加保护性物质如蔗糖、山梨醇、甘露醇、DMSO等。
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在培养基中加入冰冻保护剂或诱导抗寒力的物质已经在许多植物获得成功, 是应用最广
泛的一种预处理方法, 该法经常结合冷驯化一块使用进一步提高存活率。第三步是在冰浴条件下加入0℃预冷的冰冻保护剂，促进保存材料组织在结冰早期进行保护性脱水,阻止冰晶生长,从而使之较易达到玻璃化状态，同时帮助材料恢复培养。这是植物种质超低温保存成功的关键。常用的冰冻保护剂有渗透性冰冻保护剂，如二甲基亚砜、甘油、乙二醇、乙酰胺等，和非渗透性冰冻保护剂，包括蔗糖、葡萄糖、聚乙二醇等。一般冰冻保护剂混合使用, 效果较好。第四步是降温冰冻，常用的降温方法主要包括快冻法、慢冻法、逐级冰冻法、干冻法、玻璃化法、包埋脱水法和包埋玻璃化法。目前,玻璃化法以其要求设备简单、材料处理步骤简便、效果和重演性好等优点倍受人们推崇,成为较理想的植物种质资源保存方法。
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但是玻璃化法采用的冰冻保护剂浓度很高，对植物材料的毒性很大，且较难在同一时间内处理大量材料。包埋脱水法与玻璃化法相比，冻存后恢复生长较慢，脱水所需时间较长，有些植物得到的存活率和再生率都较低。包埋玻璃化法是在玻璃化法和包埋脱水法基础上发展起来的超低温保存植物种质的新技术，它具有能同时处理大量材料，处理后恢复生长快，对材程序料的毒害作用较小及成芽率高等优点。慢冻法操作起来需要较为昂贵的程控降温仪，较为复杂。总之，每种超低温保存方法均有其优点和可取之处，应根据所选材料的特点和试验的实际情况来选择最佳的保存方案。第五步是放入液氮中冻藏，贮存过程中, 只要不断补充液氮, 就可以长期保存植物种质。第六步是化冻，多数研究采用一般采取在37～40℃温水浴中快速化冻的方式，化冻后的材料需立即进行洗涤。第七步为进行活力鉴定，然后再培养，观察恢复生长的速度及植株的再生能力，分析冻后材料或再生植株的遗传性状。超低温保存成功的关键在于避免降温时及化冻过程中的细胞内结冰。所以对细胞进行适当程度的脱水，降低材料含水量是各种冻存方式的中心原则，根据不同的材料，通过改变冰冻保护剂、
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降温方式及化冻方式的组合就能够得到最恰当的保存效果。3.研究进展
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植物超低温保存技术在濒危植物资源的保存中发挥了巨大作用，能有效防止植物种质材料衰老和遭受病虫害，长期有效地保存植物种质而且不使种质资源发生变异。研究还发现超低温保存可以去除一些病毒。近年来超低温保存技术的发展已经进入一个新阶段, 成功保存种质材料的报道越来越多。在超低温保存果树种质资源研究中发现许多种果树的不同部位, 如杏的种子、种胚和花粉, 苹果的休眠接穗、花粉、愈伤组织、茎尖、分生组织, 草莓的分生组织和愈伤组织, 猕猴桃的茎尖和愈伤组织, 李属的5个树种的花粉等都能成功保存在液态氮(-196℃)温度下。
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Plair等通过实验证明了利用包埋玻璃化法能长期有效地保存两个
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濒危品种Crotalriaavonensis和Rhexiaaristosa。有许多新的技术开始应用于超低温保存实践中。低温冻存技术离不开冷冻保存剂，抗冻蛋白作为一种新型冷冻保存剂, 已经引起研究者的高度重视而成为目前的研究热点之一。在保存方法上，已利用玻璃化法已成功保存了梨、杏、柿、马铃薯、番木瓜、苹果、小球藻等100余种植物材料,冻存材料包括植物茎尖、原生质体、愈伤组织、合子胚、细胞等。还有包埋玻璃化法，用其冻存的材料遗传稳定性较好，已成功用于橄榄树、苹果、枳橙、甜柿、辣根、烟草等20 余种植物,在植物种质资源的保存上显示出巨大的应用潜力。在测定技术方面也有很大的进展。随着研究的不断深入,产生了多种特殊的染色法, 如Evan’s蓝法、FDA 法、TTC 还原法、FDA2酚藏红花双染色法、同工酶电泳等。此外, 超低温保存后遗传性状的分析和检测方法也在不断更新, 相继出现了保存后染色体数目的观察、保存过程中细胞超微结构的变化、蛋白质变异检测、POD 同工酶变异检测、RAPD检测等一系列新方法,而AFLP指纹图谱分析近几年来更被广泛应用。但是超低温保存后再生材料的遗传稳定性到底如何, 目前还没有最终的定论, 可能与所用材料本身的遗传特性及研究方法等都有一定的相关性, 也可能受检测手段所。作为一项重要的生物技术, 超低温保存对植物材料遗传稳定性的影响,应该给予进一步的关注。 4.展望
经过多年的不断研究，超低温保存己经取得了很大的的进展。超低温保存的详细步骤已经比较成熟，并且发现了多种超低温保存的方法和许多新的技术。已经成功保存了许多植物和一些植物的茎尖、分生组织、体细胞胚、悬浮细胞、原生质体等，研究还发现超低温保存能够去除病毒。但超低温保存技术仍在快速发展之中,还有许多问题有待解决。首先，超低温保存植物的存活率不高。植物超低温保存的影响因素很多，不同的植物或是同一植物的不
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同组织用同种方法保存会有难易之分， 所以在保存时必须根据材料的特性, 对影响超低温保存的因素进行研究研究并建立与之相适应的保存方法或体系，从而提高保存成活率。之后，上文中已提到，超低温保存后再生材料的遗传稳定性到底如何, 目前还没有最终的定论，可能与所用材料的遗传特性及研究方法有关，或是超低温保存过程涉及到的一系列胁迫可能对不同基因型的材料产生选择效应等等，而我们在种质保存的过程中必须保持遗传基因的稳定性，因此今后可以研究记录后代的形态特征及生长发育状况，进行较大规模的遗传稳定性试验。其次，近年来超低温保存技术成功保存的种质材料越来越多，但至今仍未建立起专有物种的种质资源库，建立种质资源库将是超低温保存研究的趋势。
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