血红蛋白的提取和分离1

【学习目标】

凝胶色谱法的原理和方法

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 【基础知识预习】 1．凝胶色谱法

凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由 构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 2．缓冲溶液

缓冲溶液的作用是 。缓冲溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是 ，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。 3．电泳

电泳是指 。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。

两种常用的电泳方法是 和 ，在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 以及 等因素。 4．蛋白质的提取和分离

蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。 【教学过程】

【课题背景】：新华网首尔１２月２９日电（记者 干玉兰）韩国浦项工业大学科学家２９日宣布，他们已查明可抑制艾滋病病毒感染的“ＴＲＩＭ５”蛋白质核心部分的结构。

浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天公开了“ＴＲＩＭ５”蛋白质内核心部分“Ｂ３０．２／ＳＰＲＹ”的三维分子结构，并称已弄清楚这一结构的正确位置及它与其他结构之间的相互作用。研究成果发表在最新一期《分子细胞》杂志上。

2００４年英国《自然》杂志曾刊登论文说，“ＴＲＩＭ５”蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各地的很多科学家开始研究“ＴＲＩＭ５”蛋白质的结构，但到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。

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对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。通常科学研究需要获得纯度较高的蛋白质。怎样才能从复杂的混合物中提取和纯化蛋白质呢？

基础知识：

通过DNA的提取与鉴定，你有没有关于分离大分子的思路呢？

1、凝胶色谱柱的结构： 工作原理：

凝胶色谱柱的制作： (根据P68页内容，总结其制作步骤)

讨论：根据此项操作的目的，你认为大分子在分离的过程中经过的路程长还是短？我们应该什么时候进行收集？ 2．在洗脱的过程中，蛋白质的活性很可能受到外界环境的影响而变性，那么对洗脱液有何要求？

3、凝胶色谱法分离后可以去除相对分子量较大或较小的杂质，获得的蛋白质纯度如何检测？

实验操作：

1．1 初步获取血红蛋白的原理和方法 【思考】：

1、采集的血液如何才能防止凝固？血液的成分有哪些？血红蛋白主要存在于哪里？

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2、如何去除血浆获得红细胞溶液？怎样才能释放其中的血红蛋白？

3、如何从破裂红细胞释放的混合物中分离出血红蛋白？

4、透析的目的是什么？

5、讨论(1)：在红细胞的洗涤过程中，哪些因素是影响洗涤效果的关键因素？为什么？

讨论(2)：以上对于红细胞的操作和处理，属于我们整个蛋白质的提取和分离实验步骤中的哪些步骤？

6、利用什么方法进一步纯化血红蛋白？ 1．2 分离纯化血红蛋白的原理和方法 1．2．1 凝胶色谱柱的制作 底塞的制作：

1．2．2 凝胶色谱柱的装填（阅读P68，完成例题1） 【例题分析1】．凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而由简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：

(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ， 原因是 。 (2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构 可由 替代。 (3) 若选用SephadexG－100，则“G”表示 100表示 。 【讨论】：在凝胶色谱柱装填时，尽量紧密，不得存在气泡的原因是什么？ 一旦出现气泡，怎样处理？

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1．2．3 样品的加入和洗脱(如右图所示) 结合课本内容P68-69，思考：

(1)在此过程中，需要几次打开下端的流出口 ？其目的分别是什么？

(2)在进行加样的过程中，我们需要注意什么？

(3)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体 (填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是 。

1．3 鉴定蛋白质纯度的原理与方法——( )

(1)在测定蛋白质分子量时常用的电泳方法是哪一种？在这样一种电泳过程中，不同蛋白质的分离取决于什么？

总结与归纳：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？(请用一定的流程图表示)

例题2．下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是………………( ) A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞

C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液 例题3．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列问题：

(1)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步： 、 、 、 和 。

(2)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。

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①加入柠檬酸钠的目的是 。 ②以上所述的过程即是样品处理，它包括红细胞洗涤、 、分离血红蛋白溶液。

③洗涤红细胞的目的是 ，你如何知道红细胞已洗涤干净？ 。 ④分离红细胞时对离心速度及离心时间要求分别是 、 。 ⑤如若离心速度过高和时间过长结果会怎样？

。 (3)收集的血红蛋白溶液在透析袋中透析，这就是样品的粗分离。

①透析的目的是 ； ②透析的原理是 ； (4)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 ①样品纯化的目的是 。 ②血红蛋白有什么特点？ 。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？ 。

【血红蛋白的提取和分离】 选择题：

1．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是………………( ) A．防止血红蛋白被氧化

B．血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和 C．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程

D．让血红蛋白处在稳定的PH范围内，维持其结构和功能

2．随着人类跨入蛋白质时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是…( ) A．弄清各种蛋白质的空间结构 B．弄清各种蛋白质的功能 C．弄清各种蛋白质的合成过程 D．获得高纯度的蛋白质

3．将释放出的血红蛋白以2000r/min的速度离心10min后，可以看到试管中的溶液分为4层，其中哪一层是血红蛋白的水溶液………………………………………………………( ) A．第一层无色透明 B．第二层白色 C．第三层红色透明 D．第四层暗红色

4．蛋白质的各种特性的差异，可以用来分离不同种类的蛋白质，下列正确的一项是…( ) A．分子的形状、大小和溶解度 B．所带电荷的性质和多少、吸附性质 C．对其他分子的亲和力 D．以上三项都是

5．用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是………………( ) A．相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质 B．相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质 C．相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质

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D．二者根本无法比较

6．对采血容器中预先加入柠檬酸钠的目的是………………………………………( ) A．调节PH B．维持红细胞的能量供应 C．防止微生物生长 D．防止血液凝固

7．凝胶色谱法分离蛋白质中使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶(SephadexG-75),其中G、75的含义分别是…………………………………………………………………………………( ) A．G表示凝胶的使用量，75表示加75克水 B．G表示凝胶的交联程度，75表示需加热75℃

C．G表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，75表示每克凝胶膨胀时吸水7.5克 D．G表示凝胶的膨胀体积，75表示每克凝胶膨胀后体积可达75cm3

8．取1ml血红蛋白溶液装入透析袋中进行透析，相关说法不正确的是…………( ) A．透析液为300ml 20mmol/L的磷酸缓冲液

B．透析时间至少为1－2h，时间过长血红蛋白也会渗漏出去 C．除去了相对分子质量较小的杂质，实现了样品的粗分离 D．透析也可用于更换样品的缓冲液

9．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，其分子大小、电荷的性质和数量情况如右图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是………………………………( ) A．将样品装入透析袋中透析12h，若分子乙保留在袋内，则分子丙也保留在袋内

B．若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快 C．若将样品以2000r/min的速度离心10min，分子戊存在于沉淀中，则分子甲也存在于沉淀中

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D．若用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最远

10．(多选)有关透析的叙述，正确的是…………………………………………………( ) A．用于透析的薄膜要具有选择透过性 B．透析膜一般是用纤维素制成的

C．透析能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内D．透析可用于更换样品的缓冲液 二、非选择题：

11．下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入(左图)和洗脱(右图)示意图，请据图回答下列问题。

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(1)一同学利用琼脂糖凝胶电泳技术将得到的蛋白质进行分离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速度的因素包括蛋白质分子的 、 以及分子的形状等。而另一位同学则利用凝胶过滤法分离蛋白质（右图），他在操作中加样的正确顺序是 。待蛋白质接近色柱底端时，用试管连续收集流出液。先收集到的蛋白质与后收集到的蛋白质的区别是 。 (2)用吸管加样时，应注意正确操作，分别是① ；② ；③ 。 (3)等样品 时，才加入缓冲液。

12．右图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题： (1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主 要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋 白质具有___________功能。

(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是__ ；乙装置中，C溶液的作用是 。 (3)甲装置用于_________，目的是 ，用乙装置分离蛋白质的方

法叫 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。

(4)用乙装置分离血红蛋白时，待 时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。 A

1．(1)样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定

(2)①防止血液凝固 ②血红蛋白的释放 ③去除血浆蛋白 离心后的上清液没有黄色 ④低速500r/min；短时间如2min；⑤离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度

(3)①去除相对分子质量较小的杂质 ②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内 (4)①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去②血红蛋白呈现红色 在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 DDCDADCBA ;BCD 1．（4）带电性质 分子大小 ④①②③ 先收集到的蛋白质分子量大，后收集到的分子

量小（2分）

3． (1)不要触及破坏凝胶面 贴着管壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动

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(2)完全进入凝胶层 33．（8分）选做题：

A.（1）运输（2）磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白 （3）透析（粗分离） 去除样品中分子量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分子质量的大小 （4）红色的蛋白质接近色谱柱底端

(呈现出红色、这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？课后练习)

（本身有颜色，通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。从而使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集）

2．红细胞含有大量血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：样品处理、粗分离 纯化 纯度鉴定。请回答下列有关问题：

①样品处理，它包括 、 、收集血红蛋白溶液。

②收集的血红蛋白溶液在透析袋中经过透析，这就是样品的粗分离。透析的目的是 透析的原理是 。 ③通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的是 。

2．(1)a a相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快

(2)尼龙网和尼龙纱 (3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果

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(4)凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围 凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水10g (5)相同 保持恒定 DD

2．① 红细胞的洗涤 血红蛋白的释放

②去除相对分子质量较小的杂质 透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在透析袋内

③通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去 (3)红色的蛋白质 5

3．在对固氮基因产物的生产研究中，需要从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质。下图表示蛋白质提取和分离实验涉及的相关原理。

①图甲表示相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶色谱法分离的过程。试管中收集到的液体最先出现的是相对分子质量较大的蛋白质，原因是

。 ②图乙所示实验模拟电泳现象，U型管左侧的颜色逐渐变深，原因是 。

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Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，在电场作用下向阴极移动。

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