第３４卷第４期 湖北畜牧兽医 Ｖｏ１．３４ Ｎｏ．０４ ２０１３年０４月 Ｈｕｂｅｉ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｖｅｔｅｆｉｎａ￣Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａ ２０１３ ＨＳＮ１禽流感病毒核酸多重ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的建立 廖秀云，徐海聂，徐博文，沙才华，罗宝正，薄清如，杨素 （珠海出入境检验检疫局，广东珠海５１９０１５） 摘要：根据禽流感病毒的基质蛋白ｆｊ ）基因序列和Ｈ５亚型禽流感病毒血凝素（ＨＡ）基因、神经氨酸酶（ＮＡ）基因设计 并合成了三对特异性引物，用于建立Ｈ５Ｎ１禽流感病毒核酸的ＲＴ—ＰＣＫ分型鉴定方法。试验证明，建立的多重 ＰＣＰ．方法可以将Ｈ５Ｎ１与Ｈ６Ｎ２、Ｈ９Ｎ２有效区分。该方法具有较好的灵敏度和特异性，适合在基层动物防疫和监 督部门进行Ｈ５Ｎ１禽流感病毒核酸的检测。 关键词：禽流感病毒；Ｈ５Ｎ１；多重ＲＴ—ＰＣＲ；检测 中图分类号：￥８５４．４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—２７３Ｘ（２０１３）０４—０００５—０３ 高致病性禽流感是一种严重危害养禽业发展的 发公司；ＡＩＶ Ｈ６Ｎ２、Ｈ９Ｎ２病毒以及新城疫病毒Ｌａ． 烈性传染病．被ＯＩＥ列为必须通报的传染病［ 。禽流 ｓｏｔａ疫苗株（ＮＤＶ）、鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）和传 感病毒（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉ‘ｒａｓ．ＡＩＶ）属于正粘病毒科 染性支气管炎病毒（ＩＢｖ），本室留存。 Ａ型流感病毒属．ＡＩＶ除了可感染禽类外，部分亚型 １．２生化试剂 还可感染人、猪、马等。ＡＩＶ基因组由包括基质蛋白 Ｅｘ—Ｔａｑ Ｅ、ｄＮＴＰ（２５ ｍｏＥＬ，内含Ｍ ）、ＲＮＡ酶 （Ｍ）基因、血凝素（ＨＡ）基因和神经氨酸酶（ＮＡ）基因 抑制剂、反转录酶ＡＭＶ、１０ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ以及ＤＮＡ 在内的８个负链单股ＲＮＡ片断组成．其中Ｍ基因 Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００均购自宝生物工程（大连）有限公 组序列高度保守，ＨＡ基因组变异性最强．ＮＡ基因组 司：ＲＮＡ提取液购自科登生物工程有限公司；０．１％ 变异次之 ＨＡ基因和ＮＡ基因某些位点的变异可导 ＤＥＰＣ水由本室自制：二甲基亚砜购自上海生工生 致不同的ＨＡ亚型和ＮＡ亚型［ ．目前发现ＡＩＶ有ｌ６ 物工程有限公司。 个ＨＡ亚型和１０个ＮＡ亚型。其中Ｈ５、Ｈ７亚型常表 １．３引物设计及合成 现为高致病性．除了给养禽业带来严重经济损失外［ ． 参考基因库中禽流感病毒Ｍ基因、ＨＡ基因和 还可感染人。甚至导致死亡［３］。目前，病毒分离、血清 ＮＡ基因序列．经Ｃｌｕｓｔａｌｘ序列软件比对后，选择在保 学试验仍是诊断ＡＩ和对ＡＩＶ进行定型普遍采用的 守区域用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计了３对引物（表 方法，但病毒分离不仅操作繁琐、复杂和耗时，难以 １）上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。 对ＡＩ进行快速诊断，还存在潜在散毒的危险。ＰＣＲ 表１多重ＲＴ—ＰＣＲ引物 方法是一种基因体外扩增技术．可以在数小时内对 某片断基因扩大数百万倍。该技术具有特异性强、敏 引物名称 引物寡核苷酸序列（５，一 ３ ） 产物长度 ｐ 感性高、检测快速等特点，已广泛应用于生物学、医 学、兽医学的各个领域。多重分型ＰＣＲ是一种特殊 ＰＣＲ形式．其最突出的特点是一次反应可以达到既分 型又能够鉴定亚型的目的，在Ａ、Ｂ、ｃ三种流感及其他 病源混合感染的鉴别诊断上具有独特优势和很高的 实用价值［ Ｉ５］ 根据ＲＴ－ＰＣＲ技术的原理。研究建立了 １．４病毒ＲＮＡ的提取 鉴定Ｈ５、Ｎ１、Ｍ１的多重ＲＴ－ＰＣＲ分型技术。 （１）１．５ ｍＬ离心管中加入１２０ ＲＮＡ提取液 １材料与方法 和１２０ Ｌ样品，混匀，室温放置５ ｍｉｎ。 １．１试验用材料 （２）加入１２０ Ｌ一２０ｏｃＮ冷的氯仿，混匀，室温 ＡＩＶ Ｈ５Ｎ１抗原．购自哈尔滨维科生物技术开 放置３ ｍｉｎ。 收稿日期：２０１３—０３—２３ 作者简介：廖秀云（１９８０一），女，广东惠州人，兽医师，主要从事动物检疫工作。 第４期 廖秀云等：Ｈ５Ｎ１禽流感病毒核酸多重ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的建立 １ 物。而Ｈ５、Ｎ１为分别针对Ｈ５、Ｎ１亚型的特异性引 同时．该多重ＲＴ—ＰＣＲ分型法不需要进行多次 物。能够分别特异性地检测相对应的亚型 利用这３ ＰＣＲ扩增．在数小时内就可完成对ＡＩＶ Ｈ５亚型的 对引物．通过对多重ＲＴ～ＰＣＲ扩增条件的优化．建 快速检测鉴别．能够在分型同时一步鉴定到亚型，达 立了快速检测鉴定ＡＩＶ Ｈ５亚型的多重ＲＴ—ＰＣＲ分 到快速诊断和鉴别ＡＩＶ的双重目的，对及时有效控 型技术。 制ＡＩＶ感染有重要意义．对ＡＩＶ Ｈ５亚型感染制定 该多重ＲＴ—ＰＣＲ分型方法检测结果显示．ＡＩＶ 有效的防制措施具有实用价值和指导意义 Ｈ５Ｎ１在３８０、８７８、２２９ ｂｐ位置同时出现３条ｃＤＮＡ 参考文献： 扩增带。而Ｈ６Ｎ２、Ｈ９Ｎ２病毒仅扩增出Ｍ１ ｃＤＮＡ １ ［１］ＳＥＮＮＥ Ｄ Ａ，ＰＡＮＩＧＲＡＨＹ Ｂ，ｋＡＷＡＯＫＡ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｓｕ￣ｅｙ ｏｆ 条带，传染性支气管炎病毒、新城疫Ｌａｓｏｔａ疫苗株 ｔｈｅ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ）ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｈ５ ａｎｄ Ｈ７ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ：ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｔ ｔｈｅ ＨＡ （ＮＤＶ）和减蛋综合征病毒则呈阴性。多重ＲＴ—ＰＣＲ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ［Ｊ］．Ａｖｉａｎ 敏感性试验结果表明．Ｈ５Ｎ１抗原最低检测稀释度 Ｄｉｓ，１９９６，４０：４２５—４３７． 为１０－３。Ｈ５亚型特异性试验结果表明．仅Ｈ５呈阳 ［２］ＡＬＥＸＡＮＤＥＲ Ｄ Ｊ．Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ａｖｉａｎ ｉｌｆｎｕｅｎｚａ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｒｄ 性，其他Ｈ６、Ｈ９亚型和ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＥＤＳＶ均呈阴性。 ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，７４：３－１３． 对所扩增片段进行回收、纯化并测序，其测序结果经 ［３］ＨＩＥＮ Ｔ Ｔ，ＬＩＥＭ ＮＴ，ＤＵＮＧ ＮＴ，ｅｔ ａ１．Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ （Ｈ５Ｎ１）ｉｎ １０ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｖｉｅｔｎａｍ［Ｊ］．ＮＥｎｇｌ ＪＭｅｄ，２００４，３５０： ＤＮＡＳｔａｒ基因分析软件分析．这些片段分别与ＡＩＶ ｌ １７９一ｌｌ８８． ＨＡ基因、ＮＡ基因和Ｍ基因有着高度同源性，提示 ［４］ＰＡＮＧ Ｙ，ＷＡＮＧ Ｈ，ＧＩＲＳＨＩＣＫ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ 这些扩增基因的序列与原参考序列的基因来源一 ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｖｉａｎ 致，即分别来源于ＡＩＶ的Ｈ５亚型ＨＡ基因、ＮＡ基 ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ［Ｊ］．Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ，２００２，４６（３）：６９１－６９９． ［５］赵建梅，魏荣，王志亮，等．一步法多重ＲＴ—ＰＣＲ检测新城 因和Ｍ基因．表明该多重ＲＴ—ＰＣＲ分型方法具有高 疫、禽流感、传染性支气管炎病毒试验的研究［Ｊ］．中国动物检疫， 度特异性 ２００３．２０（１）：２２—２４． ・＋・ ◆市场信息◆ ・＋”＋“＋”＋”＋”＋”＋”＋”＋”＋”＋”＋”＋”＋“＋”＋”＋”＋”＋”＋”＋・ ２０１３年内蒙古乌拉特中旗农畜产品质量安全监测 重点做好五项工作 ２０１３年以来．中旗农畜产品质量安全监测重点做好了五项工作。 一是制定完善了《农畜产品质量安全突发事件应急预案》。二是加大了新修订的《饲料和饲料添加剂管 理条例》的宣传力度。同时做好对各农资经营企业、规模养殖场户的培训工作。三是建立健全了农畜产品质 量安全监管机制．做好常态化管理工作 各农资管理部门建立了农畜产品质量监督管理档案。记录日常监督 检查、违法行为查处等情况。监督检查现场填写了完整“农资生产、经营、使用企业检查记录表”并归档。四是 进一步规范农资经营及使用企业。落实禁止经营者分包、拆包、再加工、再添加的法律规定，督促经营者健全 购销台帐。做好购销记录。养殖者按照产品使用说明书和注意事项使用饲料。在饲料或者动物饮用水中添加 饲料添加剂的，遵守饲料添加剂安全使用规范。养殖者使用自行配制的饲料的，遵守自行配制饲料使用规范， 并不得对外提供自行配制的饲料。五是强化质量安全监测。组织实施农畜产品质量安全监测、”瘦肉精”等违 禁物质专项监测。在完成上级相关单位下达的监测任务基础上，增加抽检频次，提高监测力度。 下一步中旗农畜产品质量安全监管工作，以《农产品质量安全法》为准则，强化农畜产品质量安全。严格 准入，强化监管、从严执法，努力规范农畜产品生产、经营和使用行为，构建公平有序的市场环境。全面提升 农畜产品质量安全监管工作。进一步提高行业预测预警能力及服务水平。重点整治与专项行动相结合，加大 对使用“瘦肉精”等违禁添加物质的打击力度．进一步保障该旗农畜产品质量安全。 （来源：中国畜牧兽医信息网）
