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安徽农业科学。Ｊｔｍｍａｌ ａｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉ．Ｓｃｉ．２１３Ｏ８。３６（１９）：８０２１—８０２２ 责任编辑王淼责任校对马君叶 酵母双杂交技术的应用及进展 刘骥 ，张秀娟 ，范建平２，张子义 （１．内蒙古农业大学生物２１２程学院，内蒙古呼和浩特０１００１８；２．内蒙古乌海市治沙站，内蒙古乌海０１６０００） 摘要酵母双杂交技术能有效检测蛋白与蛋白之间的作用，已成为检测蛋白重要手段之一。笔者在酵母双杂交技术的建立、工作原理、 优点和局限性４个方面作了叙述，并介绍其进一步的发展及展望。 关键词 酵母双杂交技术；蛋白之间的作用；酵母单杂交；酵母三杂交；逆向双杂交系统 中图分类号Ｓ１８８ 文献标识码Ａ 文章编号０５１７—６６１１（２００８）１９—０８０２１—０２ Ａ翻埘 ｍ咂ａｎｄＰｎ， Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｆＹｅａｓｔＴｗｏ・ｒｌｙｂ￣ ｘ ＵＵ Ｊｉ ｅｔ ａｌ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ。［ｎｌｌｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ０１００１８） Ｉｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔＯ ｄｅｔｃｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｃｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｆｆｃｔｅｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｈａｄ ｂｅｃｏｍｅ ｏｎｅ ｏｆｔｈｅ ｉｎｅｒｒａｎｔ ｗａｙｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，，Ｉｌｌｅ ｙｅａｓｔｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｔｃｈｎｉｅｑｕｅｗａｓ ｄｅｓｃｒｆｌ￣ｂｙｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｉｎｆｏｕｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆｔｃｈｎｉｅｕｅ ｂｕｉｑｌｄｕｐ，ｗｏｒｋｉｎｓｐｒｉｎｃｉｐｌｅ。ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄｌｉａ－ｒ ｉｔａｔｉｏｎｓ．ａｎｄｉｓｆｔｌｌｉ＇ｔｈｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓｗｅ ａｌｓｏｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；Ｅ ｅｃｔ ｂｅｔｗｅｃｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｙｅａｓｔ ｏｎｅ－ｈｙｂｒｉｄ：Ｙｅａｓｔ ｔｈｒｅｅ－ｈｙｂｒｉｄ；Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ １酵母双杂交技术的建立 随着生命科学的不断发展，各种生物技术研究手段层出 不穷，酵母双杂交系统就灶在这样的条件下建立的…。ｌ：ｉｅｌｄ￣ 种酵母菌株既含有特定报告基因，并且已是去掉相应转录因 子的编码基因，因此本身无报告基因的转录活性。如果蛋白 质ｘ和Ｙ可以互相作用，则即导致ＢＤ和ＡＤ在空间上的接 近，从而激活ＵＡＳ下游启动子调节的报告基因的表达，反之， Ｓｏｎｇ首先提出酵母双杂交系统，这是一种直接于酵母细胞内 检测蛋白质之间互相作用的新方法，可有效地用来分离能与 一ＢＤ与ＡＤ就不能结合，报告基因也不能被启动表达［ ］（图１）。 种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因＿２Ｊ。该技 术以其简便、灵敏、高效以及能反映不同蛋白质之间在活细 胞内的相互作用等特点得到广泛应用。它们证明了任何可 以互相配对的蛋白质都可以通过结合将互相分开的ＢＤ和 ＡＤ拉近，并从而形成一个转录激活复合物。在一个典型的 酵母双杂交系统中，通常包括２个融合蛋白，一个由已知的 蛋白ｘ与ＢＤ组成，另一个由未知蛋白Ｙ与ＡＤ组成，前者通 常被称为诱饵（ｂａｉｔ），而后者通常被称为猎物（ｐｒｅｙ）。此外， 还包括一个人工构建的，具有ＢＤ结合位点以及报告基因 （ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）的质粒。如果诱饵和猎物能够在宿主细胞内 同时表达，那么由于两者的互相作用，ＢＤ和ＡＤ形成转录激 活复合物，从而激活报告基因的表达＿３Ｊ。 ２酵母双杂交技术的工作原理 图１酵母双杂交体系的原理 №．１ ＰＩ ｅ ０ｆｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈＣｏ￣ｓｙａｎｎ 酵母双杂交系统最初是根据真核转录的特点建立 的。真核生长转录因子含有两个相对的功能区域（ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｇ ｎｄｏｍａｉｎ）和转录激活结构域（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ，ＡＤ）。 ３酵母双杂交系统应用的优点 酵母双杂交系统具有以下优点：①敏感性。主要是由于 系统能使融合蛋白过量表达。激活结构域和结合结构域形 成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使 ＤＮＡ－ＢＤ能够识别效应基因的上游激活序（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｇ ｎＳｅｑｕｅｎｃｅ，ＵＡＳ），并与之结合。ＤＮＡ－ＡＤ则是通过同转机 （Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）中的其他成分之间的结合作用，以启 动ＵＡＳ下游的基因进行转录。ＢＤ和ＡＤ可以人为的分离， 分离的ＤＮＡ－ＢＤ和ＡＤ单独分别作用，并不能激活转录反应， 融合蛋白各组分间结合更趋于稳定。检测结果是基因表达 产物的积累效应，如酵母的表形，因而可检测存在于蛋白之 间微弱或暂时的互相作用。②真实性。检测在活细胞内进 行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表了细胞 内的真实情况。③简洁性。融合蛋白互相作用后，减少了纯 化蛋白质的繁琐步骤。④广泛性。酵母双杂交系统可采用 但当两者在空间上较为接近时，则呈现完整的转录因子的转 录激活活性，将ＤＮＡ－ＢＤ序列与一已知的蛋白质ｘ（常成为诱 饵）的基因结合，构建出ＢＤ－Ｘ融合表达载体，将ＡＤ序列与 拟研究的另蛋白Ｙ．靶蛋白（ｐｒｅｙ）的基因结合，构建出心Ｙ 表达载体。将这２个表达载体共转化至酵母细胞内表达，此 基金项目 中国农业大学一内蒙古农业大学合作项目。 作者简介 刘骥（１９８２一），男，黑龙江齐齐哈尔人。硕士研究生，研究 方向：植物分子生物学。＊通讯作者。 收稿日期 ２００８－０４．２３ 不同组织器官细胞类型和分化期的材料构建ｅＤＮＡ文库 ５， 能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞 质，细胞核及膜结合蛋白。 ４酵母双杂交系统的局限性 酵母双杂交系统在研究蛋白一蛋白、蛋白一核酸间互相 作用方面快速有效，有广泛的应用，但也存在一些局限性。 它有些弊端是不容忽视的，“假阳性 Ｊ，’是酵母双杂交的一 个重要问题。由于某些蛋白质本身具有激活转录功能或在 维普资讯 http://www.cqvip.com ８０２２ 安徽农业科学 ２００８年 酵母内表达时的转录激活作用，使ｐｒｅｙ．ＢＤ融合基因与 ｂａｉｔ．舡）融合基因表达产物无需特异结合，就能启动转录系 统。另外有些蛋白质表面有对其他蛋白质的低亲和力区，容 易形成蛋白体复合物，能够引起报告基因的表达，使酵母表 现出相应的表形，产生假阳性结果。所分析的可能互相作用 的蛋白质必须定位于核内，才能激活报告基因，但是很多蛋 白质的相互作用依赖翻译后加工如二硫键等的形成等，而此 过程要在细胞质内完成，这样，有许多蛋白质不适用此方法。 的因素也就很重要。逆向双杂交系统由Ｓｈｉｈ等创立，可作为 酵母双杂交系统较好的补充。与酵母双杂交系统比较，突出 的特点在于构建一种反向筛选报告基因即蛋白间特异相互 作用所激活的报告基因能阻碍转化体的生长，从而发现蛋白 间结合的解离因素。Ｓｈｉｈ等用该系统对阻断环腺苷酸效应 分子结合蛋白与辅助因子相互作用的诱变剂进行了研 究 。Ｖｉｄａｌ等据此发现了影响转录因子Ｅ２Ｆ１中与ＤＰ１相 互作用的点突变 ３ｌ。 某些诱饵蛋白质或待筛选蛋白质在酵母中大量表达时，可能 对酵母产生一定的毒性作用，如使酵母体内的信号传导通路 阻断，干扰酵母中正常基因的表达，抑制酵母细胞的分 ５．４酵母双杂交的进一步展望 从酵母双杂交系统理论的 提出至今，已得到不断完善和迅速推广，在蛋白质研究中成 为首选的方法。尽管还有许多问题没有解决，也有一些相应 裂，甚至使酵母细胞在选择性培养基上不能生长等，使得某 的缺陷，但随着这些问题的解决，从而得出蛋白质联系图谱， 些种类的蛋白质不能在该系统中进行分析。 并且为细胞活动机制的研究提供重要的信息，它将继续在蛋 ５酵母双杂交系统的进一步发展及展望 白功能的研究乃至其他生命科学领域发挥更重要的作用。 ５．１单杂交系统Ｗａｎｇ和ＲｏｄｄＥ７Ｊ 基于酵母双杂交系统 参考文献 提出单杂交系统提出单杂交系统，用于研究ＤＮＡ－蛋白质间 ［１］朱静仪．酵母双杂交技术的发展［Ｊ］．中山大学研究生学刊，２０ ，２３ 互相作用。不同之处仅在于它省略了双杂交系统中ｂａｉｔ．ＢＤ （２）：４４—５２． １２Ｊ ＦＩＥＬＤ Ｓ，ｓ０ＮＧ Ｏ．Ａ ｒ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ０ｔｅ ｅｒａ ０隅【Ｊ］． 蛋白杂代之交体 Ｊ，代之以具有与之特异结合位点的ＤＮＡ， Ｎａｔｕｒｅ，Ｎ６９，３４０：２４５—２４６ 可以利用ＤＮＡ序列捕获具有与之特异结合的结构域的蛋白 ［３］吴志聪，王一飞．酵母双杂交系统［Ｊ］．生物技术，２０∞，１３（５）：４３—４４． ［４］朱金鑫，李小方．酵母双杂交技术及其在植物研究中的应用［Ｊ］．植物 质。通过对酵母细胞内报告基因的表达状况的分析，来鉴别 生理学通讯，２ＯＯ４，４ｏ（２）：２３５—２４０． ＤＮＡ结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对ＤＮＡ结合 ［５］Ｍ旺 ＧＡＲ肼Ｍ，Ｓ（ ｕ０Ｎ Ｐ， 吣Ｊ Ｒ．ａ硼ｉｎｇ ａＩ ｄ删硼 ａ ｈ 凼Ｂ Ｘ岫１ｄｉｎｇ ｉｎ ｔｈａｔ ｉｒＩ ｈａｂｉ协 ｒ印Ｉｉ ∞［Ｊ］ ， 位点进行分析。运用此技术能快速筛选到与ＤＮＡ结合的蛋 １９９８，７２：１７３７—１７４３． 白质。酵母单杂交系统灵敏性高，可直接获得与ＤＮＡ特异 ［６］ＳＩＥＰＨＥＮＤ Ｊ，ＢＡＮＩＩＮＧＧ． ｎ１ｅＩ玛ｅ ｙｅａｓｔｔｗｏ＿ｈ蜘ｄ ｉｒＩ ｓｔ ｐ ：Ｐ衄 ｉｎｔ￣ｅｆｉｏｎ ｉｒｌⅦＩｖ耐ｉｒＩ 匠出Ｉ１ｇ［Ｊ］．＇ｒｌ￣ｃ， １０）：７６３． 结合蛋白质的基因序列。与双杂交类似，同样也会出现假阳 ［７］ⅥＡ№ＭＭ，ＲＥＥＤＲＲ．ＭｄｅｃＩｄ盯ｄｏｎｅ Ⅱ１ｅｄ ０ｒｙ ｌⅡ∞ａｌ恤哑妞脚 性问题，有待进一步完善Ｌ９Ｊ。 ｆａｅｔ￣ＯＩｆ－Ｉ ｂｙ窘臼懈ｉｃ ｒ，ｅｌｅｅｆｉｏｎｉｒＩ ｙｅ８ｒｓ【ＪＪ．Ｎ眦 ，１９９３，３６４：１２１一ｌ ． ５．２三杂交系统 三杂交系统是ＳｅｎＧｕｐｔａ＿１。。等发展起来 ［８］ＢＡＲＩＩＩ，ＰＬ，Ｆ砌６ ｓ．，Ｉｌｌｅｔｗｏ ｓ￣ｔｅｍ［Ｍ］．ＮｅｗＹｏｒｋ：０）【 ｒｄ Ｕｎｉ． ｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９７：２８９—２９７． 的，与双杂交系统相似，只是２个杂交蛋白需通过第三个分 ［９］ＺＨＡＮＧＪ，ＩＡＵｒＡＲ Ｓ．Ａ ｙｅａｓｔｔｗｏ ｈｉｄｍ ｔｏｄｏｎｅ ｍａｒ删ｅｉｎ 一 ｐ 呷ｍ∞ Ｊ Ｊ．Ａｎ Ｂｉｏｄｍ，１９９６，２４２（１）；６８—７２． 子介导。三杂交必须满足：２个蛋白无直接作用，必须通过第 ［１０］ＢＡｅＩ－ＩＡ￣ＣｔｔＥ，Ｇ 下ＳＰ．Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｉ硼ｌ啪ｎ ｉｎ砌咖ｃ ｃｉｅｎｃｙ ｖｉｎ玛ｔｙｐｅ， 三个成分才能激活转录，第三个分子具有２个蛋白的位点。 ｃ日ｇ ｔｏ ｖｉａ，ＲＮＡ％ 咖∞６酬．ｍｔｈｅ ｙｅａｓｔｔｈｒｅｅ ｈ ｄ ｓ 许多细胞内信号传递过程中，两蛋白间互相作用涉及第三个 ［Ｊ］．Ⅵｒｄ，１９９８，７２（８）：７６３—７９＂／． ［１１］ＭＣｃＲＡⅡＨＳ，ＨａＩＺＡＭＴ，Ｍ０６ＳＢ，ｄ ａ１．Ｃ￣ｏｎｅ１ｗｉｄｅ锄ａｌ ｓ ｖ毛ｌｃＩ五 ａ 分子。而这第三种分子可以是蛋白质，小分子多肽和核酸。 ｖｉｒｕｓ呻 ｒ卜 ｉｎｔ￣ｅｔｉｏｎ［Ｊ Ｊ．Ｐｉｎｅ№１ Ａｃ Ｓｅｉ ＵＳＡ，２０Ｏｏ，９７：４ｇ７９ —４８８４． 因此，此方法的发明大大扩展了酵母双杂交系统的应用 【１２Ｊ Ｓ删ＨＭ，Ｇ０Ｉ删＾ＮＰＳ， ０ＡＪ，ｄ ａ１．Ａ ６ 窘邮Ｅ五ｃ ｒ，ｅｌｅｅｆｉｏｎ 范围。 ｆｏｒＩ￣ｌｌａ（ｉＱｎ 吐 哺ｄｎｊＩ吐％ ｍ：Ｉｄ 矗ｃ ｍｄＤＲＥＢｌｌｌｌ￣Ｑｎｔｈ习噍 ５．３逆向双杂交系统ｌｌＩＪ 酵母双杂交系统创立的初衷是研 ｐｒｅｖ 【ａｓｓ０ｄ面∞ｗ汕ｔｈｅ ｏ０ｒａ击ｖ址 ａ ［Ｊ］．Ｐｉｎｅ Ｎａｌｉ Ａｅａｄ Ｓｅｉ ＵＳＡ， １９９６，９３：１３８９６—１３９０７． 究蛋白间互相作用，如果这种作用很重要，那么解离作用必 ［１３］ＶＩＤＡＭ，ＢＰ＆ＣＨＮＡＮＮＲＫ，Ｆ．￣ｒＡＲＹ Ａ，ｄ ａ１．ＲｅｖＨ吕ｅ－ｈｙｈｉｄ∞ｄ∞ｅ ｈｙ— 然导致对生物的重大影响，而研究阻断蛋白之间的相互作用 ｌａｉｄ ｓｙｓｔｅｍｔ０ ｄｄｅｄ ｄｉｓ ∞ ｄｎ ａＩ】ｄ ｎ ＤＮＡ ｉ￣ｅｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｐｉｎｅ Ｎａｉｌ Ａｃａｄ Ｓｅｉ。ＵＳＡ，１９９６，９３：１（１３１５—１（１３２０． ・十一＋一‘ ・・＋一＋一＋一＋一＋＊＋”‘ ＊＋－＋一＋ （上接第８０２０页） 加 ：１４８—１４９、 岩是保酸性玻璃质火山喷出的岩石，具有球珍珠状裂纹。 ［２］林．花卉组织培养［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２０（１２：２８—２９． ［３］刘坤，白乃茂．植物组培快繁过程中几个关键过程［Ｊ］、河北果树，２０∞ 用于基质的珍珠岩也是经过高温煅烧而成的膨化制品，具 （３）：３４—３５． 有保温、隔热、通气、无毒、化学性质稳定的特点。但配方中 ［４］郑文静 的常见问题及其解决办法［Ｊ］．辽宁 珍珠岩的使用应该慎重，并要做进一步的筛选工作。珍珠 农业科学，２００１（２）：４９—５１、 ［５］赖钟雄、矮杆一串红离体培养快繁技术［Ｊ］．福建农业大学学报，２００１， 岩在不同试验中表现不稳定的原因，可能是在珍珠岩的加 ３ｏ（４）：４８３—４８５． 工及贮存过程中，会造成性质的改变，从而失去了应有的品 ［６］欧阳磊．邓恩桉组培生根影响因子的研究［Ｊ］．福建林学院学报，２００６， （１）：７８一 ． 质 ８Ｊ。至于不同基质的理化性状及营养成分如何影响红姬 ［７］郑启发，胡桂兵，陈大成．正交试验法在 艮和荔技组织培养中的应用 凤梨的成活需要进一步探讨。 ［Ｊ］．果树科学，２０Ｏｏ，１７（４）：２６９—２７３． ［８］尹颖，李增援，刘慧敏．移栽基质对赤桉试管苗移栽成活和苗木生长的 参考文献 影响［Ｊ］．植物生理学通讯，２０∞，４１（２）：２１１—２１１． ［１］王玉国．观叶植物的栽培与装饰［Ｍ］．北京：科学技术文献出版社，
