中西医结合肝病杂志２０１３年第２３卷第６期 ・３５５・ ・实验研究－ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－０２６４．２０１３．０６．０１３ ＲＮＡｉ检测大鼠转酮酶基因在肝癌细胞系ＳＭＭＣ ７７２１增殖中的作用 梁超 方肇勤 胡 卫 吴中华 高必峰。 １．上海中医药大学基础医学院实验中医学教研室（上海，２０１２０３） ２．三峡大学医学院中医系中医基础教研室３．美国科罗拉 多大学医学院 摘要目的：观察不同中医治法对肝癌大鼠ＴＫＴ（转酮酶）基因表达的差异，以及ＴＫＴ基因在人肝癌细 胞增殖中的作用。方法：①采用ＤＥＮ（二乙基亚硝胺）诱发大鼠肝癌，分别经健脾理气、清热解毒、活血化瘀等中 药治疗后，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｒａｔ ２３０Ａ基因芯片检测大鼠肝癌组织ＴＫＴ基因表达的差异；②设计３个人ＴＫＴ基因ｓｉＲＮＡ（小 干扰ＲＮＡ）序列，将ｓｉＲＮＡ经脂质体转入ＳＭＭＣ－７７２１人肝癌细胞株，ＭＴＦ（噻唑蓝）比色法检测细胞生长增殖情 况、ＲＴｑＰＣＲ（实时荧光定量聚合酶链反应）检测该基因的表达差异。结果：①芯片结果显示，ＴＫＴ基因在大鼠肝癌 形成后表达显著增加，不同中药对其具有不同程度的下调作用，其中健脾理气法下调作用较明显；②采用ＭＴＹ比色 法筛选到１个ＴＫＴ基因ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干扰）有效靶序列，转染４８小时后细胞的生长增殖得到了明显的抑制（与阴性 对照组相比，Ｐ＜０．Ｏ１）；③ＲＴｑＰＣＲ检测表明，转染４８小时后该基因的表达明显降低。结论：ＴＫＴ基因的高表达与 肝癌细胞恶性增殖有关，而中药健脾理气治法对其具有下调作用。 关键词肝癌；转酮酶；基因芯片；ＲＮＡ干扰；治法 ＲＮＡｉ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ０ｆ ＴＫＴ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌｉｎｅ ＳＭＭＣ－７７２ １ ＬＩＡＮＧ ＣＨＡＯ ，ＦＡＮＧ ＺＨＡＯ—ＱＩＮＬ。ＨＵＷＥｒ，ＷＵ ＺＨＯＮＧ—ＨＵＡＬ，ＧＡＯ ＢＩ－ＦＥＮＧ３ １．Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ；Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｕｎｉ— ｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｅｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，２０１２０３）Ｃｈｉｎａ ２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｅｎ；ＳａｎＸｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ３．Ｍｅｄｉｃｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｏｄａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｄｅｎｖｅｒ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＴＣＭ）ｆｏｒｍｕｌａ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ（Ｔａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ）ＴＫＴ，ａｎｄ ｄｉｓｃｕｓｓ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃｌａ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＴＫＴ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：①Ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ）ｍｏｄｅｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｉｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ（ＤＥＮ），ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＫＴ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｎｏｕｒｉｓｈｉｎｇ ｓｐｌｅｅｎ ａｎｄ Ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ ｑｉ、Ｃｌｅａｔｉｎｇ ａｗａｙ ｈｅａｔ ａｎｄ ｔｏｘｉｃ ｍａｔｅｒｉｌａ、Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．￣）Ｔｈｒｅｅ ｓｉＲＮＡ ｔｒａｇｅｔｓ ｔｏｗａｒｄ ＴＫＴ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｔｏ ＨＣＣ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＳＭＭＣ－７７２１，ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＫＴ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｍｒｉｎｅｄ ｂｙ ＭＴＦ ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：①Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｒｅｓｕｌｔｓ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＫＴ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ａｆｔｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＣＣ，ｓｅｖｅｒｌａ ＴＣＭ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕ— ｌａｔｉｎｇ ｏｆ ｎｏｕｒｉｓｈｉｎｇ ｓｐｌｅｅｎ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ ｑｉ ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｉｖｉｏｕｓ．（ Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ＴＫＴ ｗａｓ ｇｏｔ，ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｇｒｅａｔｌｙ ａｔ ｔｈｅ ４８ ｈｏｕｒ ｆａｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ．￣Ｍａ ｒ ａｓｓａｙ ｒｅｓｕｈ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｒｇｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｗｈｅｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｌｙ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ ４８ ｈｏｕｒｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴＫＴ ｇｅｎｅ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔａｒ— ｇｅｔ ｗｈｉｃｈ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｅｄ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｎｏｕｒｉｓｈｉｎｇ ｓｐｌｅｅｎ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ ｑｉ，ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＫＴ ｈａｓ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ；ＴＫＴ；ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｂｉｏｃｈｉｐ；ｈｅｐａｔｏｅｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＲＮＡ 基金项目：国家自然基金（Ｎｏ．３０６７２５７４；３０２７１５７６；８１２７３６４１），上海市教委项目（Ｎｏ．２０１０ＪＷ０５，２０１２ＪＷ０３）；Ａ通讯作者，Ｅｍａｉｌ：ｚｑ— ｆａｎｇ＠ｓｈ１６３ｄ．ｓｔａ．ｎｅｔ．ｃｎ ・３５６・ 原发性肝癌（Ｐｒｉｍａｒｙ ｌｉｖｅｒ Ｃａｎｃｅｒ，ＰＬＣ）是我国高发的 恶性肿瘤之一。中医药辨证论治在防治原发性肝癌方面具有 一定的疗效，其常用的治则治法主要包括健脾益气、清热解 毒、活血化瘀…。我们前期的研究发现，中药治疗组与模型 组和西药对照组相比，这些治法均能不同程度地延长ＤＥＮ诱 发的肝癌大鼠生存期 。在进一步探索其作用机制的过程中， 课题组采用Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｒａｔ ２３０Ａ基因芯片检测，发现在ＤＥＮ 诱导大鼠肝癌发生与发展过程中存在着大量的异常表达且能 够被不同中医治法调节的基因 ，４ ，其中包括转酮酶（Ｔｒａｎ． ｓｋｅｔｏｌａｓｅ，ＴＫＴ）基因。 ＴＫＴ是一种焦磷酸硫胺素（ｔｈｉａｍｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＴｈＤＰ） 依赖性酶，负责催化磷酸戊糖通路中的一个关键反应。ＴＫＴ 在大多数生物体内广泛存在，在人类基因组中，已经确定了 一个ＴＫＴ基因和两个ＴＫＴ相似基因，即ＴＫＴ、转酮酶样基因 （ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ ｌｉｋｅ，ＴＫＴＬ）一１和ＴＫＴＬ－２，ＴＫＴ是由上述基因 编码的一个异二聚体。 ＴＫＴ基因在肝癌细胞中表达升高具有什么病理意义？该 基因是否是健脾益气治法治疗肝癌细胞的靶点之一？我们采 用ＲＮＡｉ技术令该基因在肝癌细胞中表达后沉默，通过观察其 表达沉默后肝癌细胞增殖的变化，初步探讨其在肝癌细胞 ＳＭＭＣ－７７２１中的生物学功能，及不同中医治法对其的 意义。 １材料与方法 １．１ 大鼠肝癌模型的制备及分组与治疗 雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠， 体重１００～１２０ｇ，７２只，随机分为６组，除正常组外，各造模 大鼠自由饮用含８０ｐｐｍ ＤＥＮ（购自中国科学院南京土壤研究 所）水溶液，至２０周末处死动物；各治疗组，于造模１４周 后开始给药至实验结束，中药浸膏和西药水溶液拌入颗粒饲 料，摄人剂量中药约为成人用量的１０倍、西药约为５倍。分 组和处方见表１。 表１ 动物分组及治疗方法 １．２药品中药饮片购自上海市徐汇中药饮片厂；ＦＦ－２０７购 自上海华联制药有限公司。 １．３芯片检测 取正常组、模型组及各药物干预组大鼠的 肝癌组织用Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒提取组织总ＲＮＡ后，由美国科罗拉 中西医结合肝病杂志２０１３年第２３卷第６期 多大学医学院进行Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｒａｔ ２３０Ａ基因芯片检测。 １．４ ＲＮＡｉ检测的主要材料与方法 １．４．１ ＲＮＡｉ检测的主要仪器和试剂 ①实时荧光定量ＰＣＲ 仪为Ｒｏｔｏｒ—Ｇｅｎｅ ３０００（ＧＥＮＥ公司）；酶标仪为ＥＬＸ８００ （ＢＩＯ—ＴＥＫ公司）。②转染细胞为ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞株（中 国科学院上海细胞所）；ｓｉＲＮＡ合成（上海吉凯基因化学技术 有限公司）；实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒（ＴＡＫＡＲＡ，ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）；Ｌｉｐｏｆｅｅｔ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏ— ｇｅｎ）。③ＴＫＴ基因的ＲＮＡｉ靶序列分别为：ＴＫＴ１：ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＡＡＧ Ａ；ＴＫＴ２：ＣＣＧ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＧＡ ＡＧＡ ＡＡＧ Ａ；ＴＫＴ３：ＣＡＧ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＡＣ Ｔ。ＴＫＴ基因干扰效 率的ＲＴｑＰＣＲ检测引物为：上下游ＣＧＣ ＴｒＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＴＣＣ ＡＡＧ ＧＧＣ，ＡＡＧ ＣＴＹ ＧＴＹ ＴＣＧ ＧＧＡ ＣＣＧ ＧＧ，扩增产物长度 为１４２ｂｐ。ＧＡＰＤＨ内参基因的ＲＴｑＰＣＲ检测的上下游引物分 别为：ＡＡＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＣＣＧ ｒｒＡ ＧＧＡ ＡＡ，ＧＣＧ ＣＣＣ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＣ ＡＡＡ ＴＣ，扩增产物长度为１６８ｂｐ。 １．４．２ ＲＮＡｉ检测的方法①通过ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎ． ｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏ１）工具比对大鼠与人的ＴＫＴ基因。②从Ｇｅｎ— Ｂａｎｋ数据库中搜索到人ＴＫＴ ｍＲＮＡ序列，确认ｃｄｓ区。③针 对ＴＫＴ ｍＲＮＡ序列的ｃｄｓ区，应用Ａｍｂｉｏｎ公司在线的ｓｉＲＮＡ 靶点设计软件选择３个ＲＮＡｉ靶点，并进行ＢＬＡＳＴ比对，以 确定干扰序列的特异性。将靶序列提交上海吉凯基因公司合 成３对ｓｉＲＮＡ。④将合成后的同一干扰位点上的两条单链，退 火结合成双链。⑤采用Ｌｉｐｏｆｅｅｔ２０００将ｓｉＲＮＡ转入ＳＭＭＣ－７７２１ 肝癌细胞株中，转染方案据试剂说明书标准流程。⑥转染后， 分别于２４小时、４８小时、７２小时后进行ＭＴＴ检测；６孔板 中，４８小时后提取其总ＲＮＡ，进行ＲＴｑＰＣＲ检测。⑦ＭＴｒ检 测：常规ＭＴｒ检测（波长为４９０ｎｍ），每个样本平行做４个 复孔。（￣）ＲＴｑＰＣＲ检测：收集转染４８小时后的细胞，用Ｔｒｉｚｏｌ 液提取其总ＲＮＡ并检测所得ＲＮＡ的质量、浓度，各实验组 取２ｌｘｇ总ＲＮＡ进行反转录，再以反转录产物为模板，用 ＴＡＫＡＲＡ公司的ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅｌａ Ｔｉｍｅ）试 剂盒进行标准曲线的绘制，并以ＧＡＰＤＨ为内参做相对表达量 分析。扩增反应体系（共计２５ １）为：消毒双蒸水９．５ ｌ， ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（２×）１２．５ ｌ，上、下游引物（各 ５ＩｘｍｏＵＬ）２ ，ＲＴ产物１Ｉｘｌ。扩增反应条件：９５ｏｃ×３０秒； ９５ｏＣ ｘ３０秒，６０℃×３０秒，４０个循环。结果以采用△ＡＣＴ 法加以分析。 １．５统计学方法 基因芯片数据的分析：详细步骤和灵敏 度问题以及定量的方法参考Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ网站的技术手 册；所有计量资料均采用ＳＳＰＳ １２．０软件包的方差分析。 ２结果 ２．１ ＴＫＴ基因在大鼠肝癌中表达及不同中西医治法对其调 节作用 芯片检测结果表明，ＴＫＴ基因在正常大鼠肝脏表达 中西医结合肝病杂志２０１３年第２３卷第６期 ・３５７・ 较高，芯片读数计算值接近２５９０，而肝脏所有１５７１０个基因 的平均计算值为８９０。在肝癌形成过程中，ＴＫＴ基因表达逐渐 ｌ・４ ｌ・２ ｌ・０ 升高，在１６周芯片读数达到８０００，见图１；肝癌形成后，该 啪啪瑚咖 喜；啪啪 Ｏ ０ Ｏ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ 铷０・８ ｏ ６ 基因芯片读数计接近６０００。不同中医治法对该基因的表达有 不同程度的下调作用，其中，健脾理气治法下调该基因的作 用最强，西药化疗作用相反，具有轻微上调的作用，见图２。 薹叫 ０．２ ０．Ｏ 正常 阴性ＴＫＴ１ ＴＫＴ２ ＴＫＴ３ 图４ ＴＫＴ基因转染４８小时后的千扰效率 ３讨论 课题组已往的研究发现，与正常大鼠肝脏比较，ＴＫＴ基 Ｏ周 ４周 ８周ｔ６周 肝病 图１ ＴＫＴ基因在肝癌形成过程中表达变化 ７０００ ６∞０ ５∞Ｏ ４０００ ３０００ 均２００Ｏ １０ｏ０ ０ 正常组模型组西药组清热 活衄 健脾 解毒组化瘀组理气组 图２ ＴＫＴ基因在不同治疗组芯片读数 ２．２人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１的增殖与ＴＫＴ基因的表达 Ｍ１Ｔｒ法检测空白对照组、阴性对照组、ＲＮＡｉ组ＳＭＭＣ－７７２１ 肝癌细胞的生长增殖情况。１个ＲＮＡｉ靶序列有明显的效果， 转染该ｓｉＲＮＡ后，ＭＴｒ检测显示，转染４８小时后对ＳＭＭＣ一 ７７２１的增殖抑制，该组ＯＤ值逐渐下降，与阴性对照相比具 有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。表明经ＲＮＡ干扰引起的ＴＫＴ基 因功能沉默的生物学效应，即在人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１中 ＴＫＴ基因的生物学功能与该细胞的恶性增殖有关。见图３。 ３．５ ３．０ ¨－一，… ……－ 舍２－ 耋２． ／—— 、一１． ．．．．１ ．／－ ． 壹Ｉ Ｏ｜Ｉ，啦 ． ０ ０ｄ ｌｄ ２ｄ ３ｄ 图３ ＴＫＴ基因３靶点干扰后的生长曲线 ２．３ ＴＫＴ基因转染４８小时后的干扰效率ＲＴｑＰＣＲ检测表 明，转染后４８小时，ＴＫＴ的ＲＮＡｉ现象显著，该基因相对表 达量显著下降，不到阴性对照的一半（以空白对照组为参照， ＧＡＰＤＨ基因为内参，进行／ｘ ＡＣＴ法分析），见图４，提示 ＲＮＡｉ现象显著，该基因出现表达后沉默。 因的表达在ＤＥＮ诱发大鼠肝癌形成过程的表达量不断增加， 在第１６周达到峰值，推测该基因的异常表达可能与肝癌的发 生发展有着密切的联系。不同中医治法方药的干预后，发现 健脾益气法对ＴＫＴ基因在肝癌中的表达具有明显的下调作用。 由此我们推测ＴＫＴ基因可能是健脾益气法防治肝癌的一个分 子靶点，为进一步研究健脾理气治法的作用机理，从贴近临 床实际出发，我们采用ＲＮＡｉ等技术以人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细 胞株开展工作，以期观察ＴＫＴ被沉默后与人类肝癌细胞增殖 的关系。 ＲＮＡｉ实验是一种高效、特异的基因沉默手段，目前已成 为研究基因功能的强有力的实验方法 。本实验根据ｓｉＲＮＡ 的设计原则，利用在线软件设计针对ＴＫＴ基因的３个ｓｉＲＮＡ， 分别对ＳＭＭＣ．７７２１细胞进行转染，结果证实在３个靶序列中 以“ＣＣＧ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＧＡ ＡＧＡ ＡＡＧ Ａ”靶序列的效果较好， 可用于后续生物学功能实验。应用ＭＴＦ法，对ＴＫＴ基因干扰 后ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞的生长增殖进行检测，结果显示： ＴＫＴ基因沉默后细胞增殖的能力被削弱，在转染４８小时后抑 制的效率已明显高于阴性对照组（Ｐ＜０．０５），证明该基因的 表达在细胞生长增殖方面起重要作用。 已有的研究发现ＴＫＴ与Ｗｅｒｎｉｃｋｅ Ｋｏｒｓａｋ综合征、阿尔兹 海默症、糖尿病以及癌症等多种疾病有关 “Ｊ。也有研究者 通过采用ＴＫＴ拮抗剂或硫胺素类似物抑制癌症细胞ＴＫＴ的活 性，发现其增殖受到抑制 。在编码ＴＫＴ的３个基因中， 目前多数研究认为ＴＫＴＬ．１基因与癌症关系更加密切 ， 而对于ＴＫＴ基因研究较少。我们的研究率先发现健脾益气治 法能够下调ＴＫＴ基因的表达，且沉默ＴＫＴ基因表达之后能够 抑制ＳＳＭＣ－７７２１细胞增殖。因此，ＴＫＴ基因可能是健脾益气 治法防治肝癌的靶点之一。而对于健脾益气治法调节ＴＫＴ基 因表达的具体机制仍有待于进一步研究。 参考文献 ［１］ＧＵＡＮ ＤＯＮＧ—ＹＵＡＮ，ＦＡＮＧ ＺＨＡＯ－ＱＩＮ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＴＣＭ Ｔｒｅａｔ— ｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｆｉｍａ￣Ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．￣ｕｍａｌ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０００；２０（３）：２２３－２２６． ［２］方肇勤，管冬元，梁尚华，等．不同中医治法对ＤＥＮ诱发大鼠 肝癌作用的比较研究［Ｊ］． 中医杂志。２００２，４３（７）：５４２一 ５４４． ［３］盛学仕，方肇勤，管冬元，等 ＤＥＮ诱发大鼠肝癌过程中肝组织 ・３５８・ 中西医结合肝病杂志２０１３年第２３卷第６期 ＴＨＯＭＡＳ ＡＡ，ＤＥＭＥＥＳＥ Ｊ，ＬＥＨＵＥＲＯＵ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｎｏｎ－ｃｈａｒｇｅｄ ［１Ｏ］ 基因表达谱的演变［Ｊ］．中国中医基础医学杂志，２００５，１１ （１０）：７３７—７４６． ｔｈｉａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｓ ａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ．［Ｊ］Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２００８，１８：５０９—５１２． ［４］阚卫兵，方肇勤，管冬元，等．二乙基亚硝胺所诱导大鼠肝癌表 达上调的基因［Ｊ］．世界华人消化杂志，２００５，１３（２Ｏ）：２４２０ —［１１］ＴＨＯＭＡＳ ＡＡ，ＬＥＨＵＥＲＯＵ Ｙ，ＤＥＭＥＥＳＥ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｍｉａｎｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ２４２６． ［５］ＺＨＯＵ ＨＪ，ＴＳＡＩ ＳＹ，ＴＳＡＩ ＭＪ．ＲＮＡｉ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｓｔｕｄ－ ｙｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌ Ｒｅ－ ｃｅｐｔ Ｓｉｇｎａｌ，２００３，１：ｅ ００８． ［Ｊ］．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２００８，１８：２２０６—２２１０． 『１２］ＬＥＨＵＥＲＯＵ Ｙ，ＧＵＮＡＷＡＲＤＡＮＡ Ｉ，ＴＨＯＭＡＳ ＡＡ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏ— ｄｒｕｇｔｈｉａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｓａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ【Ｊ］． Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２００８，１８：５０５—５０８． ［６］ＮＩＸＯＮ ＰＦ，ＤＡＣＺＭＡＲＥＫ ＭＪ，ＴＡＴＥ Ｊ，ｅｔ ａｌ Ａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ Ｔｒａｎ— ｓｋｅｔｏｌａｓｅ Ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ Ｐａｔｔｅｒｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｗｅｍｉｃｋｅ－Ｋｏｒｓａｋ ｏｆｆ ［１３］ＺＨＡＮＧ Ｓ，ＹＡＮＧ Ｊｎ，ＧＵＯ ＣＫ，ｅｔ ８Ｌ Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆＴＫＴＬ１ ｂｙ ＲＮＡｉ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２００７，２５３（１）：１０８—１１４． Ｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９８４，１４：２７８—２８１． ［７］ＨＥＲＯＵＸ Ｍ，ＲＡＯ ＶＬＲ，ＬＡＶＯＩＥ Ｊ，ｅｔ ａｌ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｉａｍｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｉａｍｉｎｅ・－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ￣ｄｉｓ・－ ［１４］ＬＡＮＧＢＥＩＮ Ｓ，ＺＥＲＩＬＬＩ Ｍ，ＨＡＵＳＥＮ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎ— ｓｋｅｔｏｌａｓｅ ＴＫＴＬ１ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｃｏｌｏｎ ａｎｄ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ： ｅａｓｅ．Ｍｅｔａｂ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ，１９９６，１１：８１—８８． ［８］ＨＡＭＭＥＳ ＨＰ，ＤＵＸＬ，ＥＤＥＬＳＴＥＩＮ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｂｅｎｆｏｔｉｍｉａｎｅ ｂｌｏｃｋｓ ｔｈｒｅｅ ｍａｊｏｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ ｄａｍａｇｅａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ— Ｗａｒｂｕｒｇ ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｉｎｔｅｒｐｒｅｔｅｄ［Ｊ］．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２００６， ９４：５７８—５８５． ｔａｌ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００３，９：２９４—２９９． ［９］ＢＯＲＯＳ ＬＧ，ＰＵＩＧＪＡＮＥＲ Ｊ，ＣＡＳＣＡＮＴＥ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｏｘｙｔｈｉａｍｉｎｅ ａｎｄ ｄｅｈｙｄｍｅｐｉａｎｄｍｓｔｅｒｏｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｎｏｎｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｆｉｂｏｓｅ ａｎｄ ［１５］吴二斌，李莉华，郭子健，等．转酮酶在肝癌中的表达及临床意 义［Ｊ］．肿瘤，２０１０，３０（６）：５１９—５２３． （收稿日期：２０１３—１１一Ｏ８编辑：胡肃平） ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９７，５７：４２４２—４２４８． ＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞●＜＞● （上接第３５４页） 白蒺藜、防风祛风止痒，凌霄花去血中伏火，乌梢蛇祛风通 来烯胺、苯巴比妥、光疗法和考来烯胺合用、甲氨喋呤等 。 。 皮肤瘙痒症中医文献称之为“风瘙痒”、“风痒”、“血风 一络，全方共奏益肝熄风止痒之效。而其中乌梢蛇及凌霄花， 蛇一花祛肌肤皮肉间之风，通皮腠脉络之郁，使外达内疏， 疮”和“痒风”等。《诸病源候论》：“风瘙痒者，是体虚受 风，风入腠理与血气相搏而俱往来在于皮肤之间，邪气不能 营卫和，肌肤养，痒去症消。临床观察显示，益肝止痒汤能 够减轻患者瘙痒症状及瘙痒程度，能够改善肝功能，降低血 清５－ＨＴ，１３－ＥＰ水平，疗效较显著，无明显不良反应，是治疗 肝胆源性皮肤瘙痒症的有效方药。 在治疗过程中，嘱其少食辛辣肥厚之品，戒酒，避免熬 夜，多饮水，减少热水浴次数及减低水温，勿用刺激性大的 肥皂及沐浴用品。 参考文献 ［１］梁扩寰．肝脏病学［Ｍ］．第２版，北京：人民卫生出版社， ２００６：１０１—１０５． 冲击为痛，故但瘙痒也”。《灵枢・刺节真邪篇》说：“邪气 之中人也……，其入深，搏于皮肤之间，其气外发，腠里开， 毫毛摇，气往来行，则为痒”。提示痒的发生是邪气与卫气相 搏，在分肉皮肤之间，影响卫气的正常运行，即邪气与卫气 胶结，往来窜行，而产生痒感。根据我们对顽固性肝胆源性 皮肤瘙痒症的长期临床观察，认为其病因病机为外感湿热疫 毒之邪，或嗜酒肥甘，或脾胃运化失常，湿浊郁而化热，蕴 结肝胆，或情志不遂，肝气郁结，气滞血瘀，久病致使肝阴 血津液不足，或素体阴血亏虚，肝失濡养以致疏泄不及或太 过，肌肤筋脉失养，或血虚生风而致痒。久病肝肾阴虚，水 ［２３］吴志华．皮肤性病学［Ｍ］．第４版，广东：广东科技出版社， １９９９：２０６． 不涵木，或因气郁化火，阴液被耗，以致阴不敛阳，肝风内 动而发痒，总辨证为肝虚生风。治疗上我们依据“风盛则 痒”、“诸痒多虚”等理论为指导，遵循前人“治风先治血， 血行风自灭”之旨，以养血、润燥养阴、凉血、活血、祛风 ［３］夏隆庆，赵春霞．瘙痒的发生机制、分型和治疗［Ｊ］．临床皮 肤科杂志，２００３，３２（１１）：６８７—６８９． ［４］丁媛．瘙痒的发生机制、相关疾病和治疗［Ｊ］．中国麻风皮肤 病杂志，２００６，２２（６）：４９２—４９５． ［５］ＪＯＮＥＳ ＥＡ，ＢＥＲＧＡＳＡ ＮＶ．胆汁淤积性瘙痒的原因［Ｊ］．现代消 化病及内镜杂志，１９９７，２（２）：１４３—１４４． 为主，佐以清热利湿，自拟益肝止痒汤，方中太子参补益脾 肺，益气生津为君药，白术健脾益气，白芍、炙甘草酸甘益 肝阴，鸡血藤、当归活血补血，共为君药；生地凉血养肝阴， 知母清热生津，枸杞子补肝肾阴，丹参、郁金、丹皮活血凉 血，熟大黄、蒲公英、茵陈清热利湿退黄，地肤子、蝉衣、 ［６］容健材，魏玮．胆汁郁积性瘙痒症的治疗．临床肝胆病杂志， １９９６，１２（１）：４７—４８． （收稿日期：２０１３—０７—０５编辑：黄育华）
