・专题综述・ 北方园艺￣ｏｌｏ（３）：２００～２０２ 反向ＰＣＲ分离侧翼序列技术研究进展 王 静 （内蒙占大学生命科学学院生物Ｉ程ｔ１ 心，内蒙 自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，内蒙 呼和浩特０１００２１） 摘 要：反向ＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ，ＩＰＣＲ）是第一个依赖于ＰＣＲ反应扩增旁侧序列的实验技术。 ＩＰＣＲ可以在一个反应过程中，同时扩增已知序列两端的旁侧序列，省时简便，结合Ｉ Ｒ—ＰＣＲ。 ＲＡＣＥ，ＳＭＡＲＴ等技术，应用范围日益广泛；但ＩＰＣＲ也存在一些缺点，酶切、自连过程受到很多 不确定因素的影响。现总结２Ｏ ａ来利用该技术克隆旁侧序列的研究成果，并提出优化的反应体 系，以期对此项技术有更加系统的认识。 关键词：１ＰＣＲ；克隆；旁侧序列 中图分类号：Ｑ ９４３．２文献标识码：Ａ文章编号：１００１ ０００９（２０１０）０３－－０２００—０３ 分子生物学研究过程巾，阐明病毒、转座子的整合 机理，寻找已知基因的启动子，分离基因蒯控区，分析转 肇 生物基ｒ大ｆ组ｒ｛ｌ外源基 的插入位点，以及发现捅人 突变导致的新基 等研究都有赖于旁侧亭列克隆技术 的发展Ｌ１。因此．对侧 序列克隆方法进行研究具有重 要的理论与现实意义。 ｌ嚣 记校醛酶Ａ －－ －２ 、 ｔ ｊ 在聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术发明前．筛选蟮因组 文库是分离侧翼序列的唯一方法．然而．这种方法过程 繁琐、效率低下。１９８５年，美斟ＰＥ—Ｃｅｔｕｓ公司的Ｍｕ１１ｉｓ －驰 ‘ 等发明了ＰＣＲ技术 ，使体外扩增ＤＮＡ序列成为现 实。（）ｃｈｍａｎ 等发明了反向ＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ，ＩＰＣＲ） Ｃ＇－－－－－－－一 技术，这是依赖ＰＣＲ反应首次成功克隆已知序列旁侧序 列的报道。随后，应川ＩＰＣＲ克隆旁侧序列的报道越来 越多，方法也日趋成熟。现总结ＩＰＣＲ的研究现状、发展 ｓＰ １ 己知序列： 束扣序列：匕＝二二二二］ 趋势和主要应用领域，以期使人们对此项技术有更加系 统的认识。 图ｌ ＩＰＣＲ原理图 ｌ反向ＰＣＲ技术的原理 反向ＰＣＲ（ｉｍ ｅｒｓｅ ＰＣＲ，简称ＩＰＣＲ）是克隆已知序 列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列 中无切点的性内切酶消化基因组Ｉ）ＮＡ．后酶切片段 ２反向ＰＣＲ技术的发展 ２．１经典的ＩＰＣＲ技术 绎典的ＩＰＣＲ过程包括：选择已知序列巾不存在酶 自身环化．以环化的ＤＮＡ作为模板，用－ｘ￣与已知序列 两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列（如 图１所示）。该扩增产物是线性的ＤＮＡ片段，大小取决 于上述性内切酶在已知基闲侧翼ＤＮＡ序列内部的 酶切位点分布情况。用不同的性内切酶消化，可以 得到大小不同的模板ＤＮＡ，再通过反向ＰＣＲ获得未知 片段 。 作者简介：王静（１９８４一），女，在读硕士，主要研究方向为植物分子 生物学及基因工程。Ｄｍａｉｌ：ｗａｎ￣ｉｎｇ．ｉｍｕ＠ｇｍａｉｌ．ＣＯＩＩ１。 收稿日期：２ Ｄ（］９—１１－－２０ ２００ 切位点的酶切基因组ＤＮＡ，以已知序列设计的探针进行 ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，确定含有已知序列的酶切片段，酶切片段 白连接成环，特异性引物与已知序列的两末端结合，对 夹在中间的未知序列区域进行扩增ｌ ｊ。１９８８年 ＯｃｈｍａｎＥ 等第一次利用ＩＰＣＲ技术成功克隆旁侧序列。 几乎同时，Ｔｒｉｇｌｉａ 等，克隆旁侧序列试验中使用该方法 也获得成功。 ２．２改进的ＩＰＣＲ技术 ２．２．１对ＩＰＣＲ技术过程的改进环化后的闭合环状 ＤＮＡ在ＰＣＲ变性反应中可能由于变性不彻底，使弓ｌ物 北方园艺２０１０（３）：２００～２０２ ・专题综述・ 不能完全退火，ＰＣＲ扩增效率下降，Ｓｉｌｖｅｒ和 ＲＦＬＰ、ＲＡＣＥ、ＳＭＡＲＴ等技术结合形成新的试验体系， ＫｅｅｒｉｋａｔｔｅＥ纠在分离ＢＡＬＢ／ｅ鼠病毒整合位点旁侧序列 为满足不同试验提供了技术支持。ＩＰＣＲ与ＲＦＬＰ技术 中，改进了经典ＩＰＣＲ技术。选择在已知序列内具有单 结合可定位外源基因插入位点，最早ＫｎａｐｐＬ蚓等将该技 一酶切位点的酶，将自连后的环状ＤＮＡ再切成线状，显 术应用于番茄转座子ＤＳ咿 元件整合方式的研究中。 著提高了ＩＰＣＲ的扩增效率。若已知序列内没有合适的 Ｉｊｕ Ｗ Ｈ［１ 等首次应用以ＩＰＣＲ为基础的ＲＦＬＰ（ｉＦＩ ） 酶切位点，加热使环状ＤＮＡ产生缺口，也可达到提高扩 技术，确定结肠细胞、肿瘤细胞中一些低变异水平 增效率的目的。ＭｉｒｊａｍＥ 等采用改进的ＩＰＣＲ技术，在 （ＭＦ￣１０ ）位点。Ｒｏｓｓｅｔｔｉ Ｌ Ｃ【ｌ６Ｊ运用ＳＭＡＲＴ技术得 克隆农杆菌介导的转基因烟草Ｔ－ＤＮＡ插入位点旁侧序 到硬骨鱼ｄｓ－ｃＤＮＡ后，结合ＩＰＣＲ克隆出了肾上腺皮脂 列试验中，扩增出目的条带，并判断了转入植物内的Ｔ— 激素前体基因全长，比传统的ＲＡＣＥ方法更快捷有效。 ＤＮＡ拷贝数。结果表明，基因组ＤＮＡ经酶切环化后， ＩＰＣＲ技术应用范围日益广泛，可用于获得染色体步移 再切成线状反向扩增，对特异性条带的产生必不可少。 的末端特异性探针 ］、从总ＲＮＡ中克隆未知ｃＤＮＡ序 若已知序列较长，无合适的性内切酶切割基因组 列、研究病毒序列、转基因及转座子的整合位点区域序 ＤＮＡ，一般选择在已知序列中具有单一酶切位点的酶， 列 。 ，医疗诊断 等，是一种有潜力的旁侧序列克 将其切成２部分，再单独建立自连、ＰＣＲ体系，扩增一端 隆方法。但反向ＩＰＣＲ反应的酶切、自连接、ＰＣＲ过程都 的未知序列（原理如图２所示）。Ｖｉｎｃｅｎｔ［剐使用这种方 受到很多不确定因素的影响，优化的体系对试验成功尤 法成功克隆转座子Ｔｎ ５（５ ８１０ ｂｐ）插入序列的旁侧序列。 为重要。 Ｈｕａｎｇ Ｇ＿ｇ 等在克隆转座子元件Ｔｎ５插入序列旁侧序 列的试验中，通过巢式ＰＣＲ比较两轮扩增产物的有无和 祜 大小，替代了ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测目的片段的步骤，简化 了ＩＰＣＲ反应。甲酰胺、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）等可在不 影响Ｔａｑ酶活力的情况下降低非特异性扩增。李竹 红 。。等在利用巢式ＰＣＲ扩增哺乳动物基因组含量极微 的靶序列实验中，加入５ 甲酰胺，使ＩＰＣＲ体系的灵敏 性和特异性显著提高，克隆出了２个ＫＢ（人口腔癌上皮 细胞）细胞中Ｔｃｌ（线虫转座子，其２个反转重复末端旁 一 两侧各含４００ ｂｐ的线虫基因组ＤＮＡ）转座子左侧末端 的旁侧序列，该法重复性较好，耗时短，可用于克隆哺乳 动物基因组中其它已知序列的旁侧序列。若研究材料 序列复杂，对基因组ＤＮＡ应用ＩＰＣＲ不能得到好的结 果，以ｍＲＮＡ或ｃＤＮＡ为模板进行反应，可提高试验成 功率。王莹等口 成功克隆出人宫颈癌单克隆抗体重链 图２改进的ＩＰＣＲ原理图 可变区基因。克隆表达基因的旁侧序列，也可采用此 法，陆合等 扩增出黑根霉Ｒ３０６的△６一脂肪酸脱饱和酶 ３、反向ＰＣＲ反应体系的优化 基因的全序列。 ３．１基因组的提取 ２．２．２ ＩＰＣＲ技术与其它分子试验技术结合应用 完整基因组ＤＮＡ是ＩＰＣＲ成功的基础，在提取过 ＩＰＣＲ克隆旁侧序列技术日趋成熟，但在实际应用中，有 程中应尽量避免对ＤＮＡ的损伤，保证基因组完整性，得 效扩增的旁侧序列较短，这导致ＩＰＣＲ过程是一个缓慢、 到高质量的基因组ＤＮＡＥ 。保证纯度，将杂蛋白含量 重复性的工作。Ｂｅｎｋｅｌ Ｂ Ｆ，Ｙｉｎｇ ｐ” 首先将ＬＲ（１ｏｎｇ 降到最低，防止杂质成分影响后续酶切及连接反应。 ｒａｎｇｅ）ＰＣＲ和ＩＰＣＲ结合，扩增出鸡内生前病毒的侧翼 ３．２酶切反应 序列，最长的片段约６ ｋｂ。ＬＲ—ＰＣＲ在理想状态下可扩 要选用已知序列中不存在酶切位点或只具有单一 增的ＤＮＡ序列长达４Ｏ ｋｂ。洪宇植＿１ 进一步改进技术， 酶切位点的酶，选用酶切效率高，特异性好，能产生粘性 利用２５￣３０ ｎｔ的序。列特异性长引物，特异性的扩增出 末端的常用酶。在试验中用过量的性内切酶，大的 长达１６ ｋｂ的序列，引物的高Ｔｍ值还可克服试验中假 酶切反应体系和长时间处理对后续试验极为重要。也 阳性高的不足。王德培Ｌ１ 等利用３５ ｎｔ的长引物，成功 可选择使用不同的性酶分别进行酶切，建立酶切片 克隆雅致枝霉△＝６一脂肪酸脱氢酶基因上游４ ｋｂ序列，经 段库，进行ＰＣＲ，提供平行对照，增加试验准确性。 分析知该段序列为潜在启动子。将ＩＰＣＲ技术与 ３．３连接反应 ２０１ 专题综述 北方园艺２０１０（３）：２００～２０２ 线状ＤＮＡ在低浓度下有利于自身环化连接。在酶 ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ ａｄｉａｃｅｎｔ ｔｏ ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｒｏｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｆｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， 切片段自连接反应中，若ＤＮＡ浓度高或反应体积小，则 １９８９，６３：１９２４—１９２８． 可能生成多种串联多聚体，这是反应中扩增出多个产物 ［７］Ｍｉｒｉａｍ Ｐ Ｄ，Ｂｅｎ Ｍ Ｍ，Ｄｅｋｋｅｒ，ｅｔ ａ１．Ａ ｑｕｉｃｋ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｔｈｅ Ｔ ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ａｔ ａｎ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ—－ 的一个原因，所以，试验应采用大体积低浓度的连接体 ｔｉｏｎ，ｕｓｉｎｇ ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９１，１７：１５１—１５３． 系，酶解片段浓度低于３ ｐｔｇ／ｍＬ，对自身环化有利。将 Ｌ８］Ｖｉｎｃｅｎｔ ＪＪ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｗ Ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ（１ＰＣＲ） 环化的ＤＮＡ模板再切成线状，有利于ＰＣＲ反应的扩 ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｌａｎｋｉｎｇ Ｔｎ５ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ［Ｊ３． 增，此方法要求已知序列中有合适的酶切位点，不具通 Ｊｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９，３５：１６３—１６６． 用性。采用９４￣Ｃ加热１０ ｍｉｎ，使之产生缺口，可达到同 ［９］Ｈｕａｎｇ Ｇ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｂｉｒｃｈ Ｒ Ｇ．Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｔｎ５ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， 样效果。 ２０００，３１：１４９—１５３． ３．４ Ｐ（ 反应过程 ［１ｏ］李竹红，刘德培，梁植权．改进的反向ＰＣＲ技术克隆转移基因的旁 试验中，可选用几个连续浓度梯度作为模板，摸索 侧序列＿Ｊ］．生物化学与生物物理进展，１９９９，２６（６）：６００—６０２． ＰＣＲ反应的最佳模板浓度。采用巢式引物可降低ＰＣＲ Ｅｌ１］王莹，李旭，陈葳．以反向ＰＣＲ扩增抗人宫颈癌单克隆抗体重链可 反应过程中非特异条带的扩增。由于模板较复杂，采用 变区基因［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志，２００２，１８（５）：４８９ ４９９． ［１２］陆合，朱钰，黄尤田．反向ＰＣＲ克隆黑根霉Ｒ３０６Ａ６一脂肪酸脱饱和酶 热启动ＰＣＲ和降落ＰＣＲ，以提高反应灵敏性，使目的产 基因＿Ｊ］．微生物学杂志，２００８，２８（１）：２４—２７． 物得到最大限度扩增。若扩增片段较长，引物一般要设 ［１３］Ｂｅｎｋｅｌ Ｂ Ｆ，Ｙｉｎｇ Ｆ Ｌｏｎｇ ｒａｎｇｅ—ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ（ＬＲ—ＩＰＣＲ）：ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ 计２５￣３５ ｂｐ，高的Ｔｍ值，可以减少非特异扩增产生的 ｔｈｅ ｕｓｅｆｕｌ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＢｉｏｍｏＩｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ 假阳性片段。 ｉｎｇ，１９９６，１３：１２３—１２７． ＩＰＣＲ技术的不断成熟，被越来越多地应用于生物 ［１４］洪宇檀，肖亚中，房伟，等．长距离反向ＰＣＲ技术高效扩增已知ＤＮＡ 片段的侧翼序列［Ｊ］，激光生物学报，２００６，１５（２）：４６—４９． 研究各领域。ＩＰＣＲ技术与其它分子生物学试验技术结 ［１５］王德培，孙伟，李明春，等．利用长引物嵌套式反向ＰＣＲ方法克隆雅 合使用，使其应用前景越来越广阔。 致枝霉△６脂肪酸脱氢酶基因上游序列［ｊ］．生物工程学报，２００６，２２（４）： 参考文献 ５８１—５８６． ［１］韩志勇，王新其。沈革志．反向ＰＣＲ克隆转基因水稻的外源基因旁 ［１６］Ｋｎａｐｐ Ｓ，Ｌａｒｏｎｄｅｔｌｅ Ｙ，Ｒｏｓｓｂｅｒｇ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｍａｔｏ ｌｉｎｅｓ ｃｏｎ— 侧序列口ｌ上海农业学报，２００１，１７（２）：２７—３２． ｔａｍｉｎｇ ＩＮ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｒａｎｓｐｏ— Ｅ２］洪登峰，万丽丽，杨光圣．侧翼序列克隆方法评价［Ｊ］．分子植物育种， ｓｏｎ ｔａｇｇｉｇｎｌＪ］．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９９４．２４３：６６６—６７３． ２００６，４（２），２８０—２８８． Ｌ１７］Ｌｉｕ Ｗ Ｈ，Ｋａｕｒ Ｍ，Ｗａｎｇ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ—Ｂａｓｅｄ ＲＦＬＰ Ｓｃａｎｎｉｎｇ ［３］Ｏｃｈｍａｎ Ｈ，Ｇｅｒｂｅｒ Ａ Ｓ，Ｈａｎｌ Ｄ Ｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｖｅｒｓｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｌｏｗ－Ｌｅｖｅｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒｓ［Ｊ］． ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。１９８８，１２０：６２１—６２３． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，６４（４）：２５４４—２５５ｌＪ Ｅ４］Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ Ｗ分子克隆［Ｍ］．北京：科学ｍ版社，２００２： ［１８］Ｈｉｓａｔｏ Ｋ，Ｙｕｋｉｏ Ｆ，Ｙｏｉｃｈｉ ｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｆｕｌｌ—ｅＬｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｆ Ｔｅｌｅｏｓｔ ６７１ ６７２． Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ—Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｐｒｅｃｕｒｍｒ ｂｙ ｈｎｐｒｏｖｅｄ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ［５］Ｔｒｉｇｌｉａ Ｔ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｍ Ｇ，Ｋｅｍｐ Ｄ Ｊ Ａ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａ— Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，７０（８）：１９８３—１９８６． ｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｌｉｅ ｏｕｔｓｉｄｅ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｋｎｏｗｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ［Ｊ］． ［１９］Ｌｉｌｉａｎａ Ｃ Ｒ，Ｃｌａｕｄｉａ Ｐ Ｒ，Ｉｒｅｎｅ Ｂ Ｉ ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８８，１６：８１８６． Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｈｏｔｓｐｏｔ ｂｙ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，５１： ［６］Ｓｉｌｖｅｒ Ｊ，Ｋｅｅｒｉｋａｔｅ Ｎｏｖｅｌ ｕｓｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ 】］５４—１】５８． Ｒｅｓｅｍ＇ｅｈ ＰＩ．０ ｅｓｓ ｏｆ ＩＰＣＲ ｏｎ Ｃｌｏｎｅｉｎｇ Ｈａｎｋｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ （Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｅｒｂａｇｅ ａｎｄ Ｅｎｄｅｍｉｃ Ｃｒｏｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｉ ｉｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ ０１００２１） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩＰＣＲ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｗｈｉｃｈ ｒｅｌｉｅｄ ｏｎ ＰＣｔＬ Ｕｓｉｎｇ ｏｎｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＩＰＣＲ ｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｕｌｄ ｃｌｏｎｅ ｔｗｏ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｅｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｋｎｏｗｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ＬＤ—ＰＣＲ，ＲＡＣＥ ａｎｄ ＳＭＡＲＴ，ｉｔ ｉｓ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｎ ＩＰＣＲ ｐｒｏｃｅｓｓ，ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｓｏｍｅ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｔｈｅ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｕｎ— ｋｎｏｗｎ ｒｅａｓｏｎｓ ｗｈｉｃｈ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｔｈｉｓ ｒｅｐｏｒｌ：ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｔｈｅ ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＰＣＲ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｓｔ ｔｗｏ：ｄｅｃａｄｅｓ，ａｎｄ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｇｉ‘ｖｅ ｓｏｍｅ ｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＩＰＣＲ；ｃｌｏｎｅ；ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ２０２
