抗氧化剂的测定
摘要：综述了抗氧化剂抑制脂质氧化、清除自由基、抑制自由基对底物的氧化降解以及还原能力4类测定抗氧化活性的方法，并讨论了评价或表征测定结果的方法和参数以及对测定方法的要求。
关键词：抗氧化剂，抗氛化活性，测定方法。
测量脂质氧化的方法很多，以过氧化值、共扼二烯、TBARS法和气相色谱法最为常用。各种方法都有优缺点，实际测定中将各种方法结合使用。
1.ABTS法
ABTS法最初是 Marklund根据含有蛋白质的血红素过氧化物酶能使无色的ABTS[2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid ) d iammoniumsalt,2,2-连氮-(3-乙基苯并唾哇琳-6-磺酸)二按盐]变成蓝绿色的ABTS·十，用于测定组织样品中血红蛋白的含量。后来这个方法被Miller等人加以改进，用于测定生物样品的抗氧化活性，然后广泛应用于食品和天然水溶性酚类物质抗氧化活性的测定.
ABTS法广泛用于评价抗氧化剂清除自由基的能力。此法快速简单.可用于常规测定。但对于同一物质，测得的TEAC值往往不同，例如，在不同的研究中，栋精的TEAC值分别为3.1和6.4。这不仅与具体的测试方法有关，即使同一方法，TEAC值也有可能不同，例如，用同样的方法，栋精浓度为1.5和 1.0mol/L时的TEAC分别为 5.6和6.4。ABTS·十在与氢原子供体的反应中选择性差是此法又一个不足，它可与任何羟基化的芳香族化合物反应，这与它们实际抗氧化能力无关，TEAC值也包括对抗氧化不起作用的羟基。
2. DMPD +法
Fogliano等人提出的清除自由基的方法与ABTS法类似:在酸性条件下，DMPD (N, N-dimethyl-pphenylenediamine)可被ABAP,Fe C13,CU C12,H202氧化，生成稳定的DMPD·+ ，它在505nm处有最大吸收峰。根据加人抗氧化剂后吸光度的变化可测得样品清除自由基的能力。Fogliano等人用FeC13与DMPD反应测定葡萄酒的抗氧化活性。DMPD只溶于水，不能用于疏水性抗氧化剂的测定。
3. DPPH 法
DPPH法是1950年代提出的，最初用于发现食物中的供氢体，后来广泛用于定量测定生物试样、酚类物质和食品的抗氧化能力。DPPH·( 2,2 ' -diphenyl-l-picrylhydrazyl, 2,2一二苯代苦味酞基苯脐)是一种稳定的自由基，其乙醇溶液显紫色，在515 nm处有最大吸收。当有供氢能力的抗氧化剂存在时(如酚类),DPPH·溶液的颜色变浅，吸光度值变小。根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。
DPPH法又可分为动力学法和静力学法2种。动力学法测的是添加完含有供氢能力的样品后DPPH·减弱的速率，表征的是被测物的反应性，即反应的快慢，一般用DPPH·减弱的起始速率表示,静力学法测的是被测样品清除DPPH·的量，或DPPH·与某一供氢体反应的化学计量关系或复杂混合物中活性一OH的量，常以I几。表示〔gal。与ABTS法类似，被测物清除DPPH·的产物也能与DPPH·作
用，影响测定结果。Sanchez-Moreno等人把上述2种方法结合在一起，以抗氧化效率AE (antioxidant efficiency)表示，AE用参数1/E几0-t5。计算(is。是达到50%变化时需要的时间)。
ABTS·+和DPPH·是测定抗氧化活性使用最广的2种人工生成的自由基，但是它们对抗氧化剂的响应以及它们的操作也有几个重要的不同:
(1)DPPH·不需制备可直接得到，而ABTS·+必须由酶或化学反应生成。
(2)ABTS十可溶于水，也可溶于有机溶剂，所以既可测量水溶性化合物也可测量脂溶性化合物。而DPPH·只能溶于有机溶剂，特别是乙醇，不溶于水，在评价水溶性抗氧化剂的作用时，这是一个很大的局限。
(3) 在与供氢体的反应上，DPPH·比ABTS·+的选择性强。例如，DPPH·不能与只含有一个-OH的芳香酸反应，也不能与B-环上没有-OH的类黄酮反应。而ABTS·+可与任何经基化的芳香族化合物反应。
4. Fremy 自由基和 galvinoxyl 还原法
该法是根据稳定的Fremy自由基(potassium nitrosodisulphonate，五硫化二钾) 溶于水，合成的过氧自由基galvinoxyl [2 , 6- di-tert -
butyl-a-(3 ,5-di-tertbutyl-4-oxo-25-cyclohexadien-1-ylidene)-p-tolyloxy ]
溶于乙醇，它们能与供氢体反应，分别用于测定茶叶中的水溶性和脂溶性抗氧化剂的活性。自由基浓度用电子自旋共振(ESR)仪测定，根据自由基浓度的变化可知抗氧化剂的活性。Galvinoxyl和Fremy自由基选择性强，只能与供氢能力强的供氢体反应;灵敏度高，可在混浊的或颜色深的溶液中进行。
5. ORAC法
ORAC (oxygen radical absorbance capacity,氧自由基吸收能力)法是近年来由Cao等人在Glazer。研究的基础上发展起来的，原理如下:天然蛋白质-藻红蛋白((3-phycoerythrin,-PE)在540nm光波激发下可发射565nm的荧光。在有自由基或氧化剂时，-PE的荧光逐渐减弱;当有抗氧化剂存在时，-PE的荧光减弱被抑制。自由基或氧化剂可用AAPH(产生过氧自由基)、H202-CU2+ (主要产生HO· )和Cu2+ 。使用AAPH时，可测量所有公认的抗氧化剂，如抗坏血酸。-生育酚、-胡萝卜素。使用Cu2+-H2O2时，可测量甘露醇、葡萄糖、尿酸以及过渡金属赘合剂这类物质，不用于测定抗坏血酸、-生育酚。测定结果以Trolox标准抗氧化剂)当量表示。此法是一种新的、独特的评价各种物质抗氧化活性的方法。
6. TRAP法
Wayner等人的TRAP( total radical trapping antioxidant parameter，总自由基清除抗氧化能力)法是过去10年中测量血浆或血清总抗氧化能力最广的方法。该法中的过氧自由基由AAPH产生，在向血浆中添加完AAPH后，通过测量反应过程中消耗的氧检测底物的氧化状况。在诱导期内，氧化被血浆中的抗氧化剂抑制。结果以血浆的诱导期与标准抗氧化剂Trolox的诱导期的比值表示。而Ghiselli等人报道的TRAP法基本上是Glazer法的复制。Glazer于1990年发表的TRAP法用AAPH产生过氧自由基或用Cu2+-抗坏血酸产生HO·,氧化底物B-或R-PE 藻红蛋白)。Glazer假定在过氧自由基或HO·存在时，PE荧光的减弱与时间呈线性关系。由试样保护PE防止过氧自由基或HO·氧化的诱导期与Trolox诱导期的比值定量给出试样的抗氧化力。然而，PE荧光淬灭的速度与过氧自由基或HO不是线性关系，而且诱导期一般很难测定。
7.DCFH-DA法
Valkonen和Kuusi报道的DCFH-DA(dichorofluorescin-diacetane，二氧荧光素二乙酸醋)法也是测定总的自由基清除能力。AAPH产生的过氧自由基氧化DCFH-DA，生成DCF( dichlorofluorescein，二氯荧光黄)。DCF有很强的荧光(Ex480 nm, Fm526nm)，在504 nm也有吸收，因此可用荧光法或分光光度法检测。
在此法中，DCF的荧光的形成或吸光度的出现包括4个阶段:第一延滞期(the first lag phase)是由于样品中的抗氧化剂形成的，它们被过氧自由基消耗完后反应进行到第一传播阶(the first propagation phase);
由于在第一传播阶段添加的内标抗氧化剂Trolox中断此传播阶段，致使第二延滞期开始，相应的反应随Trolox的消耗进人第二传播阶段。由第一延滞期与第二延滞期的比值可得出样品的抗氧化能力。
8. KI法
这是一个自动分析法，也是一种测定清除过氧自由基活性的方法。该法以PV法的原理为基础，用AAPH产生的过氧自由基取代脂质过氧化物，将KI氧化生成碘分子。抗氧化剂抑制过氧自由基引起的氧化，使碘释放的速率降低。氧化生成的碘的量可通过自动电位滴定仪用硫代硫酸钠滴定得出。此法简单，可用于测定各种植物提取物和类黄酮的抗氧化活性。
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