维普资讯 http://www.cqvip.com 华北农学报２００２，１７（２）：１３７～１４０ Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃｕｈｕｒａｅ Ｂｏｒｅａｌｉ—Ｓｉｎｉｃａ 旋毛虫基因重组抗原快速ＥＬＩＳＡ 诊断试剂盒的研究 陈春花 ，李喜仙２，阎玉河３，邓瑞广３ （１．郑州牧业工程高等专科学校，河南郑州４５０００８；２．河南省新乡市新华区卫生防疫站，河南新乡４５３０００ ３．河南省农业科学院生物技术研究所，河南郑州４５０００２） 摘要：用旋毛虫基因重组抗原（ ＲＡ）建立了诊断猪旋毛虫病的快速ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒。用 ＴＳＲＡ和旋毛虫肌幼虫排泄 分泌抗原（ＥＳ）分别对１２份人工感染旋毛虫病猪血清进行快速 ＥＬＩＳＡ检测，阳性率为１００％。在猪旋毛虫病发病区随机采集１０３份血清和肉样，分别用ＴＳＲＡ 和ＥＳ作抗原对血清进行快速ＥＬＩＳＡ检测，结果显示，它们与肌肉消化法的诊断符合率分别为 ９５．１２％和９６．３％。研究证明，用ＴＳＲＡ组装的诊断试剂盒具有良好的灵敏性、特异性和重复 性。 关键词：猪旋毛虫病；重组抗原；ＥＬＩＳＡ试剂盒 中图分类号：￥８５４．４ ３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００—７０９１（２００２）０２—０１３７—０４ 旋毛虫病是人畜共患寄生虫病，给生猪发展、肉食经营、外贸出口和人体健康造成巨大 威胁。因此，国内外许多学者对此病的生前诊断进行了大量研究，由于旋毛虫肌幼虫排泄一 分泌抗原（ＥＳ）在旋毛虫病的诊断和免疫方面表现出了良好的性能，因此用ＥＳ抗原建立的旋 毛虫病常规ＥＬＩＳＡ诊断方法具有较好的特异性。但是，ＥＳ抗原的制备程序繁琐、生产周期 长和每批制备的质量不均，因此不仅影响了它的稳定性，而且也使对它的研究和应用受到限 制。现代分子生物学技术尤其是重组ＤＮＡ技术的发展和应用，使大规模制备质量均匀、性 能良好的旋毛虫病检测和免疫抗原成为可能，为彻底控制旋毛虫病的流行与蔓延带来了曙 光。近几年来，国内外有学者【１，２ｊ对编码ＥＳ抗原蛋白的某些结构基因进行了克隆和序列分 析，并取得了一些进展。但是，真正作为生物试剂用于旋毛虫病的诊断或免疫的基因重组抗 原（ ＲＡ）尚未见报道。我们将编码旋毛虫ＥＳ抗原的两个结构基因进行了分子克隆，并在 大肠杆菌、酵母细胞和动物细胞（ＣＯ ７）中进行了高效表达【 ，引，研制成功了用于诊断旋毛 虫病的ＴＳＲＡ。作者报道了用ＴＳＲＡ建立起来的快速诊断猪旋毛虫病的ＥＬＩＳＡ方法。 １材料和方法 １．１材料 １．１．１ ＴＳＲＡ的制备按文献［５］和［６］报道的方法进行制备和纯化。 １．１．２检测试剂的制备主要有１，２，３，４号试液，４～８℃保存备用。 收稿日期：２００１—１２—０２ 作者简介：陈春花（１９６０一），女，副教授，主要从事畜禽传染病和寄生虫病的教学和科研工作。 维普资讯 http://www.cqvip.com １３８ 华北农学报 １７卷 １．１．３快速反应板的包被取４０孔聚苯乙烯微量反应板，用包被液稀释已测定好工作效价 的ＴＳＲＡ，每孔１００ Ｌ，经过孵育、封闭、保护、烘干、质检等工序，最后保存于密封的塑 料袋内，注明制备日期、批号和数量等，置４～８℃保存备用。 １．１．４参考阴、阳性血清系采自本室旋毛虫感染猪和非疫区健康猪血清，其吸收值分别 为０．８～１．００和０．０５－０．０８。 １．１．５样品来源人工感染旋毛虫病猪为本室人工感染的实验猪，旋毛虫病猪血清采自猪 旋毛虫病高发疫区；健康猪血清来自于河南省农科院畜牧兽医研究所养猪场。 １．２方法 ＴＳＲＡ快速ＥＬＩＳＡ诊断方法按下述操作步骤进行： 在受检猪耳静脉采血２滴，滴于１ ｃｒｎ×２ ｃｒｎ的滤纸片上，将其浸泡于０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．４ ＰＢＳ液（含０．０５％吐温一２０）１ ｍＬ，３７℃２ ｈ或４℃过夜，备用。阴、阳性血清作１：２００ 稀释。 每孔加被测检样品２滴（约１００ Ｌ），并设阴、阳性血清对照，室温（２５℃）静置２ｒａｉｎ。 甩掉孔中血样，每：ｆＬ／Ｊｎ １号试液１滴（约５０ Ｌ），室温静置２ ｍｉｎ。 甩干孔中试液，每：ｆＬ／Ｊｎ ２号试液１滴，立即用蒸馏水或自来水反复洗涤各孔５次，拍干 残液。 每孔先加３号试液１滴，再加４号试液１滴，混匀，室温静置２～５ ｍｉｎ，观察结果。 结果判定：在白色背景下，蓝色为阳性，吸收值≥０．３，无色为阴性，吸收值≤０．０８。 ２结果与分析 ２．１抗原包被最适浓度 ＴＳＲＡ用包被液作０．５，１，３，５￣ｇ／ｍＬ稀释后包被，分别用标准猪旋毛虫病血清测 定，当吸收值（４５０ ｎｍ）为０．８时，确定抗原最适包被浓度为１￣ｇ／ｍＬ。 ２．２ ＴＳＲＡ和ＥＳ抗原敏感性 将两种抗原以同样浓度包被，然后用标准血清进行倍比稀释测定。结果表明，ＴＳＲＡ的 敏感性高于ＥＳ抗原１～２个滴度。 ２．３ ＴＳＲＡ和ＥＳ抗原特异性 用ＴＳＲＡ和ＥＳ抗原分别对１２份人工感染旋毛虫病的猪血清检测，结果于感染７ ｄ后全 部检出抗体，阳性检出率为１００％。在对１０３头疫区自然感染猪检测时，两种抗原的诊断符 合率分别为９５．１２％和９６．３％（与肌肉消化法对比）。而对健康猪血清全部呈阴性反应。此 外，与猪囊虫病、猪弓形虫病和猪蛔虫病血清均无交叉反应，证明其特异性良好。 ２．４抗原包被板稳定性和保存期试验 对４个不同批号和同一批号内的抗原包被板分别进行多次测定，并将其置于２～８℃保 存。试验表明，批内与批问的稳定性无明显差异（Ｐ＜０．０５）。包被板置于２～８℃条件下， 有效期达１年以上。 维普资讯 http://www.cqvip.com ２期 陈春花等：旋毛虫基因重组抗原快速ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒的研究 ３ 讨论 旋毛虫病是严重危害人畜健康的寄生虫病，近年来由于生猪流动和大量未经检验的猪肉 流人市场，造成本病流行蔓延。因此，加强对旋毛虫病的快速诊断和病猪肉的卫生监督至关 重要。国外已将ＥＬＩＳＡ法作为猪旋毛虫病宰前的常规检查方法，国内也有将ＥＳ抗原和 ＴＳＲＡ用于检测猪旋毛虫病的报道【６．７］，但将ＴＳＲＡ组装成诊断试剂盒用于猪旋毛虫病的诊 断尚未见报道。因此，我们在国内首次用ＴＳＲＡ建立了猪旋毛虫病快速ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒， 它对控制人畜旋毛虫病在我国的流行具有十分重要的意义。 用ＴＳＲＡ建立的旋毛虫病快速ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒具有以下优点：（１）灵敏，每克隔肌含 ０．０５－－０．１条肌幼虫，便可在全血或血清中检出抗体；（２）特异，用本试剂盒检验时，不与正 常猪血清、猪囊虫病、猪弓形虫病和猪蛔虫病等血清发生交叉反应；（３）简便，只要１滴血， 即可用试剂盒进行检测；（４）快速，整个检测过程只需５～１０ ｍｉｎ，便于现场检疫；（５）容易判 定，蓝色为阳性，无色为阴性；（６）保存期长，２～８℃保存，有效期１年。 我们原来用ＥＳ抗原建立的常规ＥＬＩＳＡ诊断旋毛虫病的方法，是一种灵敏、特异的诊断 方法，可用于人畜旋毛虫病的临床诊断和进行流行病学调查。但由于它需要较长时间和繁琐 的操作过程，不宜应用于野外和现场检疫。而用ＴＳＲＡ研制组装的ＥＬＩＳＡ快速诊断试剂盒， 不仅具有更好的敏感性、特异性和重复性，而且所用的基因重组抗原质量均匀，成本低廉， 因此是目前较理想的检测人畜旋毛虫病的方法。 参考文献： ［１ Ｊ Ｓｕ Ｘ，Ｐｒｅｓｔｗｏｏｄ Ａ Ｋ，ＭｃＧｒａｗ Ｒ Ａ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｇ ａｎｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ［Ｊ Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｅｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，１９９１，４５：３３１—３３６． ［２］阎玉河，许威光，陈１０（１）：１３—１７． 辉，等．旋毛虫肌幼虫ＥＳ抗原的基因克隆及高效表达［Ｊ］．生物工程学报，１９９４， ［３］阎玉河，童光志，卢景良．旋毛虫肌幼虫ＥＳ抗原特异性蛋白２个结构基因的分子克隆及其高效表达 ［Ｊ］．中国兽医学报，１９９７，１７（６）：５８１—５８８． ［４］袁惠君，阎玉河，张改平，等．旋毛虫肌幼虫ＥＳ抗原基因ＴＳＰＧＩＩ在真核细胞中的表达［Ｊ］．西南农业大 学学报，１９９９，２１（３）：２６６—２６９． ［５］阎玉河，陈辉，许威光，等．旋毛虫重组抗原蛋白的纯化［Ｊ］．生物技术，１９９５，５（４）：２０—２２． ［６］阎玉河，陈春花，陈（增）：１７０—１７４． 辉，等．用基因重组抗原检测猪旋毛虫病的综合评价［Ｊ］．华北农学报，１９９８，１３ ［７］许威光，袁文甫，王家祥，等．旋毛虫肌幼虫排泄一分泌抗原诊断猪旋毛虫病的研究与应用［Ｊ］．华北农学 报，１９８９，４（４）：１３３—１３９． 维普资讯 http://www.cqvip.com １４０ 华北农学报 １７卷 Ｓｔｕｄｙ ｏｎ １１１１ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌｏｓｉｓ ＣＨＥＮ Ｃｈｕｎ—ｈｕａ ，ＬＩ Ｘｉ—ｘｉａｎ２，ＹＡＮ Ｙｕ—ｈｅ ，ＤＥＮＧ Ｒｕｉ．ｇｕａｎｇ３ （１．Ｚｈｅｎｇｚｋ）ｕ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｎｇｉｎ ｎｇ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｈｅｎａｎ ４５０００８，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓａｎｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｓｔａｔｉｎｏ，Ｘｉｎｈｕａ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｈｅｎａｎ ４５３０００，Ｃｈｉｎａ； ３．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｎａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｎｅｃｅｓ，Ｚｈｅｎｇｚ￣ｕ Ｈｅｎａｎ ４５０００２，Ｃｌａｉｍ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｔｒｉｃｈｉｎｏｓｉｓ ＷａＳ ｓｅｔ ｕｐ．Ｔｗｏ ａｎｔｉｇｅｎｓ，ｇｅｎｅ ｒｅ— ｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ（ＴＳＲＡ）ａｎｄ ＥＳ ａｎｔｉｇｅｎ，ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ＥＬＩＳＡ ｔｏ ａｓｓａｙ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｓｅ ｏｆ １２ ｐｉｇｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｗｉｔｈ Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ，ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｓｅ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｅｒｅ １００％．Ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅａｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ １０３ ｐｉｇｓ ｉｎ ａｎ ｅｎｄｅｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｓｉｍｕｌｔｎａｅｏｕｓｌｙ ｃｏＬＬｃｅｔｄｅ ａｎｄ ｄｅｔｃｅｔｄｅ ｗｉｔｈ ＴＳＲＡ ａｎｄ ＥＳ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ａ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｅｓｔ ｏｆ ｄｉ． ｇｅｓｔｉｖｅ ｔｃｅｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｒａｔｓｅ ｗｅｒｅ ９５．１２％ｎａｄ ９６．３％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｔ ｉｓ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｋｉｔ ｉｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓｗｉｎｅ ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌｓｏｉｓ；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ；ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ
