细胞生物学实验
实验三：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合
摘要
细胞融合(cell fusion)是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。
诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。
关键词
细胞融合；人工诱导；PEG
前言
人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。
细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘
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蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。
一． 目的要求
掌握细胞融合原理以及应用PEG 诱导细胞融合的方法。
二． 实验原理
两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。
细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合。
诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。
1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最
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后形成融合细胞。
2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。
3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。
所有的细胞融合方法都有其各自的优缺点，我们在本次实验中采用PEG诱导细胞融合的方法。
三． 实验材料
1．材料： 鸡血红细胞
2．器材和仪器：显微镜、离心机、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片
3．试剂： Alsever 液(pH7.4)、0.85％生理盐水、GKN 液、50％PEG
四． 实验步骤
1. 取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4℃下保存）。
2. 取上步中所得悬液1ml+4ml 0.85％的NaCl溶液，进以下两次离心处理。
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1) 1200r/min离心5min。（去上清液再加入至5ml的0.85%NaCl溶液）
2) 1000-1200r/min离心5min。
3. 将上步最后一次的沉降血球（去上清液后，约0.1-0.2ml），加入GKN液至1-2ml，使之成10%的细胞悬液。
4. 取上述10%的血球悬液1ml，加入3ml GKN液，使每毫升含血球15000万个，即15×107个/ml。
5. 取步骤4中所得悬液1ml+0.5ml 50%的PEG液，混匀滴片，再常温下2-3min后即可镜下观察。
五． 注意事项
1．影响细胞融合的因素很多，其中对PEG要求更严格。实验时最好选择分子量在1500～6000（视细胞种类不同来定，也可参考文献）；PEG 的浓度以50%为好。
2. 细胞融合对温度很敏感，过高过低的温度均不利于融合。实验最佳温度应控制在37℃～39℃范围内。
3. PH 也是影响细胞融合成功与否的关键因素之一。所配的试剂溶液PH 值应控制在7.0～7.2。
4.观察的时候要注意显微镜的操作，要注意辨别融合细胞与重叠的鸡血红细胞。
六． 实验结果
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在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起。
图1：鸡血红细胞融合现象光镜观察（10×40）
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图2：鸡血红细胞融合现象光镜观察（10×40）
七． 分析讨论
聚乙二醇分子能改变各类细胞的生物膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，使细胞发生融合，形成融合细胞。本次实验用聚乙二醇处理鸡红血细胞并制片利用显微镜观察。
由实验结果可得，鸡血红细胞两个或者更多出现不同程度的相互融合，但总体来说融合率还是不错的。经分析主要是以下原因：
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由于PEG与鸡血红细胞悬浊液接触时间适宜， PEG与鸡血红细胞充分接触，从而融合率比较高。因为在吹气泡的时候，PEG与鸡血细胞悬浊液混合均匀，以至于达到了比较高的细胞融合率。
八． 实验心得
经过本次实验，我懂得了细胞融合的原理和方法，并成功的完成了实验，虽然在实验过程中遇到了些困难，比如考虑到加入PEG后细胞可能会快速凝聚成团的问题，但还是被我和同组成员一一克服，相信这次实验对我以后的学习会有很大的帮助。
参考文献
《分子细胞生物学》第三版，高教出版社，韩贻仁主编
李素文主编. 细胞生物学实验指导. 高等教育出版社 施普林格出版社. 2001年
D. L.斯佩克特、R. D.戈德曼、L. A.莱因万德 著. 黄培堂等译. 细胞实验指南.科学出版社. 2001年
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