第２６卷第２期 Ｖ０ｌ＿２６ Ｎｏ．２ 吕梁高等专科学校学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｖｌｉａｎｇ Ｈｉｇｈｅｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ２０１０年６月 Ｊｕｎ．２０１０ 荧光染料探针与牛血清白蛋白作用机理的研究 张改清 ，席小莉 （１．吕梁学院化学化工系，山西离石０３３０００；２．山西大学分子科学研究所，山西太原０３０００６） 摘 要：用荧光光谱法和ｕＶ光谱法，研究染料荧光素、铬黑Ｔ、结晶紫（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ）与牛血清白蛋白（ＢＳＡ） 的作用，可以给出它们在不同结合数下的生成常数，求出它们的能量转移效率、给体一受体之间的距离，进而得知一 些小分子染料与蛋白质结合后所引起染料或蛋白质光谱特性的变化．因此，这些小分子染料可作为蛋白质的探针， 从分子水平的角度研究蛋白质与小分子相互作用的机理，从而为生命科学研究以及药物研究提供有价值的信息． 关键词：荧光染料；牛血清白蛋白；给体与受体 中图分类号：Ｏ６ｔ１．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８—７８３４（２０１０）０２—００３０—０６ 配体同生物大分子的作用是研究生命现象和药物作用机理的一个基本问题．荧光探针法是研究上述问 题简单易行的方法．一些染料小分子可与蛋白质结合，引起其光谱呈现出能量转移特征，即发生荧光的加强 或淬灭，而测定生物分子与某些基团（如蛋白质的芳香氨基酸到配体）之间的距离，因此常被称为“光谱 尺”¨Ｊ．杨频等曾用此法研究了染料与多种蛋白质的作用机理 ；本文则采用ｕＶ光谱法、荧光光谱法，研究 了染料荧光素、铬黑Ｔ、结晶紫（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ）等与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的作用．研究结果表明，在ｐＨ＝７．４ 的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液中它们与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）生成不同的缔合物．且应用杨频等曾导出的荧光加强 效应应用于给体一受体作用的理式 Ｊ，求出它们在不同结合数下的生成常数，进而又研究了它们的能 量转移效应、给体一受体之间的距离． １实验部分 １．１ 主要仪器和试剂 ＬＳ一５０Ｂ（ＰＥ公司）荧光光谱仪，ＨＰ８４５３ＵＶ—Ｖｉｓ紫外吸收光谱仪（ＨＰ公司），Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ微量可调取液 器（上海金林生化仪器厂），Ｂｅｃｋｍａｎ￣一５０酸度计（美国贝克曼公司），实验中所有的玻璃仪器以及吸收池、 荧光池均使用１ ｍｏＬ／Ｌ的ＨＮＯ，浸泡后用蒸馏水冲洗干净． 牛血清白蛋白（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）（Ａ．Ｒ．，Ｓｉｇｍａ公司）；Ｔｒｉｓ（三羟基氨基甲烷），盐酸，氯化钠 等均为分析纯试剂，荧光素（Ａ．Ｒ．，北京经科宏达生物技术有限公司），铬黑Ｔ（Ａ．Ｒ．，北京经科宏达生物技 术有限公司），结晶紫（Ａ．Ｒ．，天津市方得科技有限公司），实验用水均为三次蒸馏水． １．２溶液的配制 Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲液的配制：在分析天平上准确称取０．６０５ ７ ｇＴｒｉｓ，０．１７５ ５ ｇＮａＣ１于小烧杯中，用约８０ ｍｌ 三蒸水溶解，再用盐酸调溶液ｐＨ值（用Ｂｅｃｋｍａｎ￣一５０酸度计测量）至７．３８（约７．４左右），再定容到１００ ｍｌ 容量瓶中，放冰箱中备用． 牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的配制：在分析天平上准确称取０．０６７ ｇ牛血清白蛋白，用ｐＨ＝７．４的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１ 缓冲液容于小烧杯中，待完全溶解后，定容到１０ ｍｌ容量瓶中，其浓度为１．０×１０ Ｉ４ ｍｏｌ／Ｌ的溶液（相对分子 质量以６６ ７００计），４℃冰箱保存． 收稿日期：２０１０－０１－０７ 基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ．２０９７１０８１）资助项目． 作者简介：张改清（１９７６一），女，山西柳林人，硕士研究生，讲师，研究方向为生物无机化学 ３０ 染料荧光素，铬黑Ｔ，结晶紫（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ）用三蒸水配制为１×１０Ｉ４ ｍｏｌ／Ｌ的溶液，配置后放冰箱中备 用． １．３实验方法 １．３．１紫外光谱测定 紫外光谱使用ＨＰ８４５３ＵＶ—Ｖｉｓ（ＨＰ公司）紫外吸收光谱仪，在室温条件下，以 ｓ—ＨＣＩ溶剂为参比，分 别取浓度为１×１０ ｍｏｌ／Ｌ的染料荧光素，铬黑Ｔ，结晶紫（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ）各５００ Ｌ及１．５ ｍｌＴｒｉｓ—ＨＣＩ于１ ｃｍ干燥的吸收池中，用微量可调取液器，逐次滴加１０ ｔｘＬ１．０×１０－４ ｍｏｌ／Ｌ的ＢＳＡ（最后加入滴定剂的累加 体积以吸收强度不再变化为止），每次滴定中保持反应时间间隔３ ｍｉｎ，测吸收光谱．记录各自的最大吸收峰 变化情况． １．３．２荧光光谱测定 （１）使用ＬＳ一５０Ｂ（ＰＥ公司）荧光光谱仪测定荧光光谱，确定它们的扫描参数分别为：选荧光素的激发 波长为４４０ ｎｍ，激发狭缝为２．５ ｎｍ，发射狭缝为２．５ ｎｍ．选铬黑Ｔ的激发波长为３３９ ｎｍ，激发狭缝为８ ｎｍ， 发射狭缝为６ ｎｍ．选结晶紫的激发波长为３０３ ｎｍ，激发狭缝为１０ ｎｍ，发射狭缝为５ ｎｍ．光谱滴定在室温条 件下，分别移取２０ Ｌ１．０×１０－４ ｍｏｌ／Ｌ的染料荧光素，铬黑Ｔ，结晶紫（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ）及２ ｍｌＴｒｉｓ—ＨＣｌｌ ｍｌ于 干燥的荧光池中，用微量可调取液器，逐次滴加１０ ｔｘＬ１．０×１０－４ ｍｏｌ／ＬＢＳＡ（最后加入滴定剂的累加体积以 荧光强度不再变化为止而定），每次滴定中保持反应时间间隔３ ｍｉｎ，扫描其荧光发射谱，观察ＢＳＡ对染料发 生的荧光加强或猝灭。记录每次向染料溶液中加人ＢＳＡ后得到荧光强度Ｆｎ值（第一个点为Ｆ ；最高点为 Ｆｂ）． （２）再分别移取空白Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲液２ ｍＬ于干燥的荧光池中，用微量可调取液器，逐次滴加１０ Ｌ１．０ ×１０ ｍｏｌ／ＬＢＳＡ（最后加入滴定剂的累加体积与（１）中一样），每次滴定中保持时间间隔３ ｍｉｎ，其它参数和 （１）中一样，扫描其荧光发射谱，记录每次向空白Ｔｒｉｓ—ＨＣ１溶液中加入ＢＳＡ后得到的荧光强度ＦＤｎ值． （３）测定牛血清白蛋白与３种染料分别为１：１（摩尔比）时缔合物的荧光发射光谱和染料的吸收光谱． ２结果和讨论 ２．１ 紫外可见吸收光谱 测定结果如图１（ａ）、１（ｂ）、１（ｃ）所示： 由１（ａ）图可见：当向荧光素溶液中加入牛血清白蛋白（ＢＳＡ）时， 随ＢＳＡ溶液浓度的增加，ＢＳＡ使荧光素产生了明显的减色效应 Ｊ，且 随ＢＳＡ溶液浓度的增加，减色效应减弱． 由１（ｂ）图可见：当向铬黑Ｔ溶液中加人牛血清白蛋白（ＢＳＡ）时， 随ＢＳＡ溶液浓度的增加，ＢＳＡ使铬黑Ｔ产生了明显的增色效应，最大 图１（ａ）ＢＳＡ滴加荧光素的可见光谱 吸收峰位未见明显移动，仍在２７８ ａｍ处． Ｃ黄光素＝２．５×１０一 ｍｏｌ／Ｌ；／Ｘ１至６依序 ＇由１（ｃ）图可见：当向结晶紫（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ）溶液中加入牛血清白 为ＣＢｓＡ（１０ ｍｏｌ／Ｌ）＝０、０．４９８、０．９９０、 蛋白（ＢＳＡ）时，随ＢＳＡ溶液浓度的增加，ＢＳＡ使结晶紫产生了明显减 色效应 ，最大吸收峰位未见明显移动，仍在３０３ ｎｍ处． １．４７８、１．９６１的曲线；ｐＨ＝７．４ ／ｒｉｍ ／ｎｍ 图１（ｂ）ＢＳＡ滴加铬黑Ｔ的紫外光谱 Ｃ铬＿Ｔ＝２．５×１０一 ｍｏｔ／Ｌ；￣１至７依序为ＣＢｓＡ（１０一 ｍｏｌ／Ｌ） ＝图１（ｃ）ＢＳＡ滴加结晶紫的紫外光谱 Ｃ结－羹＝２．５ ｘ１０一 ｍｏｌ／Ｌ；￣１至７依序为Ｃ瞵Ａ（１０’ ｍｏｔ／Ｌ） ＝Ｏ ．４９８、ｏ．９９０、１．４７８、１．９６１、２．４３９、２．９１３的曲线；ｐＨ＝７．４ ０、０．４９８、０．９９０、１．４７８、１．９６１，２．４３９，２．９１３的曲线；ｐＨ＝７．４ ３１ ２．２牛血清白蛋白（ＢＳＡ）与染料在不同结合数下的生成常数 测定荧光光谱如图２（ａ）、２（ｂ）、２（ｃ）所示，当ＢＳＡ中加入染料时出现荧光加强效应．说明传能过程是主 要过程．按杨频等推导荧光加强效应应用于给体一受体作用的理式 ］： ＡＦ＝Ｆ—ＦＤ （１） Ｍｂ＝Ｍ （ＡＦ—ＦＡ）／（Ｆｂ—ＦＡ） （２） （３） （ＡＦ—ＦＡ）一。＝（Ｆｂ—Ｆ ）一 （１＋１／Ｋ （ｎＰ 一Ｍ ）） 皇 图２（ａ）ＢＳＡ滴加铬黑Ｔ的荧光光谱 ＝３３９ ｎｍ。Ｃ铬舯＝１．０×１０一 ｍｏｌ／Ｌ；｝￣１至５为 ，Ｃ （１０ ｍｏｌ／Ｌ）＝０、０．９８、ｉ．９４、２．８８、３．８１的曲线 ＝图２（ｂ） ＢＳＡ滴加结晶紫的荧光光谱 ３０３ ｎｌｎ，Ｃ 目肇：１．０×１０一 ｍｏｌ／Ｌ；｝ｊ，［１至５为 ＣＢＳＡ（１０ ｍｏｌ／Ｌ）＝０、０．８、９１．９４、２．８８、３．８１的曲线 其中Ｆ是在牛血清白蛋白（ＢＳＡ）溶液中加入染料后体系 的荧光强度；Ｆ。是自由牛血清的荧光强度；Ｆａ是自由染料的荧 光强度；Ｆ 是键合到牛血清白蛋白（ＢＳＡ）上的染料对荧光的贡 献． 为键合到牛血清上的染料浓度， 为染料总浓度，Ｐ 为牛 血清白蛋白（ＢＳＡ）的总浓度， 为生成常数，ｎ为牛血清白蛋白 （ＢＳＡ）（Ｐ）与染料（Ｍ）成键时的相互且等同的键合位置数． 一根据向染料溶液中逐次加入ＢＳＡ后得到荧光强度Ｆ 值（第 个点为ＦＡ；最高点为 ），然后逐点减去向空白Ｔｒｉｓ—ＨＣ１溶 图２（ｃ）ＢｓＡ滴加荧光 的荧光光谱 ０ ０ ｎ Ｌ；从 至 为 液中加入ＢＳＡ得到的荧光强度Ｆ。 ，由式（２）及染料浓度Ｍ ，可 求得不同Ｆ 值下的 ，求出加人不同量ＢｓＡ溶液后的Ｐ 值．按 式（３），以（ｎＰ 一Ｍｂ、一－作横轴变量、（△Ｆ—Ｆａ）－－－Ｏ／ ｉ ｉ 一 作纵轴变量、并 ｅｘ＝４４０ ，ｃ 设ｎ：２和 作图，如图３（ａ）、３（ｂ）、３（ｃ）所示，得到良好的直ｃ嘲（ ０ Ｌ）＝０，０．９８，１．９４，２．８８，３．８１的曲线 图３（ａ） 结晶紫与ＢＳＡ Ｉ ｎ＝２，ＩＩ ｎ＝４的双倒数图 ２．３能量给体一受体间距离的测定 最大激发波长荧光素选４４０ ｎｍ，铬黑Ｔ选３３９ ｎｍ，结晶紫选３０３ ｎｍ测定它们的荧光发射光谱，观察了 染料在加人ＢＳＡ时荧光强度变化，结果表明加入ＢＳＡ后出现荧光加强效应 ． 为了论证给体一受体间是否发生了能量转移，我们固定激发波长，测定了ＢＳＡ与三种染料分别为１：１ （摩尔比）时缔合物的荧光发射光谱和染料的吸收光谱，将测得的缔合物的荧光发射光谱和染料的吸收光谱 绘在同一图中如图４（ａ）、４（ｂ）、４（ｃ）所示两者间发生了重叠，说明给体一受体间发生了能量转移 』． ３２ ｎＰ．－Ｍ２ （×１０５Ｕｍｏ１） ｎＰ．一Ｍ （×｜￣Ｕｍｏ１） 图３（ｂ） 铬黑Ｔ与ＢＳＡ Ｉ ｎ＝２。Ｉ１ ｎ＝４的双倒数图 图４（ａ） （Ｉ）ＢＳＡ的荧光发射谱与（Ⅱ）荧光素 的吸收谱之间的光谱重叠 图４（ｂ） （Ｉ）ＢＳＡ的荧光发射谱与（Ⅱ）结晶紫 的吸收谱之间的光谱重叠 根据Ｆｏｒｓｔｅｒ型偶极一偶极无辐射能量转移机理 ，转移效 率Ｅ与给体一受体间距离ｒ及临界能量转移距离Ｒ。有关： Ｅ＝Ｒ０６／／（Ｒｎ。＋ｒ６） （４） 其中Ｒ０是能量转移效率为５０％时的临界距离： Ｒ０ ＝８．８×１０ （ ｎ～Ｊ４＞Ｄ） 墓 （５） 式中： 为偶极空间的取向因子，ｎ为介质的折射指数， 。 为给体的光量子产率，‘，为给体（牛血清白蛋白（ＢＳＡ））的荧光 发射光谱与受体（染料）的吸收光谱间的光谱重叠积分，可表示 为 ．，＝∑Ｆｖ（ ） （ ） 一 Ａｖ／∑ＦＤ（ｖ）ａｖ （６）图４（ｃ） （Ｉ）ＢｓＡ的荧光发射谱与（ＩＩ）铬黑Ｔ 的吸收谱之间的光谱重叠 其中：ＦＤ（ ）为荧光给体（牛血清白蛋白（ＢＳＡ））在波数 为ｔ，的荧光强度， （ｔ，）为受体（染料）在波数为 的摩尔消光系数，能量转移效率亦可由下式测定： Ｅ＝１一 （７） ３３ 其中： 和 分别为能量接受体存在和不存在时能量给予体的荧光发射强度，显然，只要得知 ， ， 。，和ｎ并通过实测光谱求出积分．，，就可算出 和ｒ． 由图４，结合式（６），把光谱重叠部分分割成极小的矩形面积求积分，分别算得ＢＳＡ与３种染料相互对 应的重叠积分Ｊ值如表１． 以色氨酸为标准物（ 。＝０．１４ ）、用相同的激发波长和仪器参数，用相对法测定牛血清白蛋白（ＢＳＡ） 中色氨酸的量子产率 。＝０．１１８，折射参数ｎ取水和有机物的平均值１．３３６，取向因子取给体一受体各向随 机分步的平均值Ｋ ＝２／３．以上各量代入式（５），分别得到牛血清白蛋白（ＢＳＡ）和３种染料相互间的能量转移 距离Ｒ。如表１．能量转移效率的测定，利用前面测定的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）与染料摩尔比为１：１的缔合物 的荧光强度，按式（７）算得能量转移效率Ｅ值如表１．于是，由 。和Ｅ、按式（４）分别得到ＢＳＡ与染料分子的距 离ｒ如表１． 表１ 三种染料与ＢＳＡ的生成常数、结合位置数、作用距离、能量转移效率和线性相关系数 ３ 结论 牛血清白蛋白有两个色氨酸残基，它们都可能与染料分子发生结合能量转移 ．从三种染料对牛血清 的荧光光谱来看，它们有着类似的作用，它们的生成常数均在ｌ０ 以上，据此可说明它们的结合较牢固．同时 得到线性相关系数Ｃ，由表１可看出ｎ＝２时Ｃ在０．９９８ ０—０．９９９ ４之间；ｎ＝４时Ｃ在０．９９８ ２—０．９９８ ７之 间．从生成常数大小来看：结晶紫的ＫＡ（２）和Ｋ Ｈ’大于荧光素的Ｋ ’和Ｋ （４’大于铬黑Ｔ的Ｋ （２ 和Ｋ ¨’； 但能量转移效率却是Ｅ荧光素＞Ｅ铬黑Ｔ＞Ｅ结晶紫．可见结合的稳定程度与能量转移并不成正比关系． 从表１数据可见结晶紫与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的给体一受体作用距离ｒ（Ａ）明显大于荧光素和铬黑Ｔ 与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的相应距离；而能量转移效率Ｅ前者明显小于后者，表明给体一受体作用距离的增 加，会大大降低能量转移效率．说明能量转移效率是和相互之间的距离成正比． 通过以上几个方面的分析得知：一些小分子染料与蛋白质结合 ，可引起染料或蛋白质光谱特性的变 化，因此可作为蛋白质的探针 ’加 ，从而可以从分子水平认识蛋白质与小分子相互作用的机理，为生命科学 研究以及药物研究提供有用的信息． 参考文献： ［１］Ｓｔｒｙｅｒ Ｌ，Ｈａｕｌａｎｄ Ｒ．Ｐ．Ｅｎｇｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ａ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｒｕｌｅｒ［Ｊ］．Ｐｒｏ１．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，１９６７，５８：７１９． ［２］ＹＡＮＧ Ｍａｎｍａｎ，ＹＡＮＧ Ｐｉｎ，ＸＩ Ｘｉａｏｌｉ．Ｂｏｎｄｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｙｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｋｅｘｕｅ Ｔｏｎｇｂａｏ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅ— 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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｄｙｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｅｒｉｏｃｈｒｏｍｅ Ｂｌａｃｋ Ｔ ａｎｄ Ｍｅｔｈｙｌ Ｖｉｏｌｅｔ ｗｉｔｈ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｕｍ，ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｎｕｍｂｅｒｓ ｈａｓ ａｌｓｏ ｂｅｅｎ ｏｂｔａｉｎｅｄ；Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｗｅ ｈａｖｅ ａ１ｓｏ ｇｏｔ ｔｈｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ－ ．ｒｉｎｇ ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｄｏｎｏｒ ａｎｄ ａｃｃｅｐｔｏｒ．Ｔｈｕｓ ｗｅ ｃａｎ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐｒｏ— ｔｅｉｎ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｐｒｏｖｉｄｅ ｕｓｅｆｕｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｙｅｓ；ＢＳＡ；ｄｏｎｏｒ ａｎｄ ａｃｃｅｐｔｏｒ 夸 ｊ －窜ｋ－９ Ｉｋ一 ｒ曹譬 ＝Ｉ 。 ｝夸 业夸 宣 。ｊ ｒ夸譬业＝Ｉｋ ９ ｒ窜ｋｒ夸譬 ｊｊ｝盥夸 夸 业 Ｉ；ｅｒ夸 坐坐坐 ；｝业ｊ ｊ 夸 簟夸 ｊ 业９；亭 （上接第２３页） 电位差计法测电动势和内电阻的实验优点是可以不从被测对象中取用电流而消耗其能量，测量结果稳 定可靠，结果相当精确．但电位差计法测内电阻需要一个校准的过程，步骤繁琐，且数据处理比较麻烦． 参考文献： ［１］冯国进．测量电源电动势的一种简易方法［Ｊ］．大学物理实验，２００３，１６（４）． ［２］杨述武．普通物理实验（直流电路部分）［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２０００． ［３］周清．关于运用探究式方法进行物理实验教学的探索［Ｊ］．大学物理实验，２００２，１５（１） 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