生物化学与分子生物学知识点总汇-研究生考试必备

1按侧链（R）基团的结构不同：脂肪族gly ala val lue ile芳香族：Phe,Trp,Tyr 杂环族:His,Pro 2按侧链（R）基团的极性性质不同：带正电荷（碱性氨基酸）带负电荷（酸性氨基酸）asp glu asn gln (1) 疏水氨基酸包括Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro,Phe和Trp(8)。(2) 极性氨基酸包括Gly,Ser, Thr, Asn, Gln, Cys和Tyr (7) 。(3) 荷电氨基酸包括Asp, Glu, Arg ，His和Lys(5)。4构型：原子在空间的相对分布或排列称为分子的构型。[ 原子在空间的相对分布或排列称为分子的构型。[ 当一种构型改变为另一种构型时必须有共价键的断裂[ 当一种构型改变为另一种构型时必须有共价键的断裂和重新形成。这种异构体在化学上可以分离，但不能通过简单的单键旋转相互转换]和重新形成。这种异构体在化学上可以分离，但不能通过简单的单键旋转相互转换]

5构象:是组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布。[是组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布。[一种构象转变为另一种构象不要求有共价键的断裂和重新形成，在化学上难于区分和分离的] 键的断裂和重新形成，在化学上难于区分和分离的] 6 优势构象与旋转异构体任何除Gly以外的氨基酸侧链中的组成基团都可以绕着其间的C-C单键旋转，从而产生各种不同的构象。在化学上有一个一般的原则，对二个四面体配位的碳原子，“交错构象”是能量上最有利的排布，在这种构象中，一个碳原子的取代基正好处于另一个碳原子的二个取代基之间。在这种构象中，一个碳原子的取代基正好处于另一个碳原子的二个取代基之间。侧链中的每一个这种一个碳原子的取代基正好处于另一个碳原子的二个取代基之间。侧链中的每一个这种C原子，都有三种交错构象，它们彼此以120°旋转相关。

7旋转异构体（rotamer）对已精确测定的蛋白质结构的分析显示，大多数氨基酸残基的侧链都有一种或少数几种交错构象作为优势构象最经常出现在天然蛋白质中，称为旋转异构体（rotamer）。rotamer）8肽键:一个氨基酸的羧基与下一个氨基酸的氨基经缩合反应形成的共价连接称为肽键。【一种酰胺键，稳定性较高,局部双键的性质，其键长仅1.33Å（，比一般的C-N单键（1.451.33Å（1Å（1Å=10-8 cm）=10-8 cm）单键（1.45Å）短。因此肽键不能旋转，具1.45Å）短。因此肽键不能旋转，具有反式（tr有反式（trαns）和顺式（ns）和顺式（cis）和顺式（cis）二种构型：肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组cis）二种构型：肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。】

9氨基酸残基Amino acid residue：肽链中的氨基酸在形成肽链时彼此缩合失去一分子水，已不是原来完整的氨基酸分子。

10脯氨酸由于其特殊结构，由它的氨端形成的顺式肽键与反式肽键比较,由于其特殊结构，由它的氨端形成的顺式肽键与反式肽键比较,能量降低为1:4。因此，脯氨酸反式肽1:4。因此，脯氨酸反式肽键在天然蛋白质中很少出现，有人对已测定的部分高分辨率蛋白质结构作过分析，发现其出现频率仅0.05%，大0.05%，大多位于结构或活性重要部位。

11肽单位（peptide unit）：肽链中的酰胺基称为肽单位。肽单位不能旋转。肽平面（ peptide plane）组成肽单位的4个原子和2个相邻的Cα原子共处一个平面，称为肽平面。肽平面可以旋转。有序连接的肽平面就是多肽链的主链。故从结构上看，肽平面和侧链基团是蛋白质分子的基本建筑模块。12多肽链的构象*肽单位在多肽链中被Cα原子上的二个共价单键Cα-C’（-C’（C’（C’为羰基中的C原子）和N-Cα连接，由于肽单位是不能旋转的刚性平面基团，因此肽单位绕着这二个单键的旋转就是蛋白质分子主链的仅有自由度。*肽单位绕单键N-Cα旋转形成的位置用φ角描述，绕单键Cα-C形成的位置用ψ角描述。因此，一个蛋白质分子的主链构象就可以用其所有组成氨基酸的一套(*这一定量表述方法是基于立质分子的主链构象就可以用其所有组成氨基酸的一套(φ, ψ) 角度值来定量表征。) 角度值来定量表征。体化学中常用的扭角（torsion angle）或双面角（dihedral angle）系统。

（1）扭角（双面角）扭角的定义及量值规定如下：由4个原子（或基团）组成的系统投影在与Ｂ－Ｃ键正交的平面上，A的平面上，A－Ｂ键投影与Ｃ－Ｄ键投影之间的夹角称为扭角。这角度也可视为A-B-C决定的平面与B-C-D决定的平面间的夹角，故也称为双面角。

(2) 多肽链的构象角在多肽链中，绕共价单键N-Cα形成的扭角称为φ角，绕单键Cα-C’形成的扭角称为-C’形成的扭角称为ψ角。一个氨基酸残基i的特定构象可由一对(的特定构象可由一对(φi,ψi)来规定，它们各包含的四原子体系如下i)来规定，它们各包含的四原子体系如下:来规定，它们各包含的四原子体系如下:φi (C’i (C’i-1, Ni, Cαi, C’【侧链的构象i, C’i) ψi (Ni, Cαi, C’i, C’i, Ni+1)其中，第二、三位原子间的共价键就是旋转的中心键。i, Ni+1)其中，第二、三位原子间的共价键就是旋转的中心键。也可以用它的构象角（ci也可以用它的构象角（ci）来规定，它的中心旋转键是侧链中的共价单键。所以，运用构象角可以将包括主链、ci）来规定，它的中心旋转键是侧链中的共价单键。所以，运用构象角可以将包括主链、侧链在内的整个蛋白质分子的特定构象定量地表征出来】

14拉氏构象图（Ramachandran）：印度学者Ramachandran及其同事根据原子的范德华半径确定了非键合原子之间的最小接触距离，并根据非键合原子之间的最小接触距离，确定哪些成对二面角所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并在φ（横坐标）对ψ（纵坐标）所作的φ-ψ图中标出，此图称为拉氏构象图。** *运用拉氏构象图进行研究发现，肽链的折叠具有相当大的局限性。*运用拉氏构象图进行研究发现，肽链的折叠具有相当大的局限性。*没有或基本没有空间障碍的多肽链的φ, ψ值被在一有限的范围*值被在一有限的范围*拉氏构象图一直广泛用于鉴定实验测定的和计算机模型建造的各种蛋白质结构的合理性。*理性。*大量实验测定的蛋白质结构显示的结果与拉氏构象图所示的结果基本一致。** 大量实验测定的蛋白质结构显示的结果与拉氏构象图所示的结果基本一致。** 15a-螺旋a-helix在a-螺旋中肽平面的键长和键角一定；肽键的原子排列呈反式构型；相邻的肽平面构成两面

1 

角； 角；

【1】 基本结构参数：a 基本结构参数：a 在天然蛋白质结构中发现的主要是a 在天然蛋白质结构中发现的主要是右手型在天然蛋白质结构中发现的主要是右手型α螺旋，在标准螺旋中，φ, ψ角度值分别为-57°和-47°，位于拉氏构象图第三象限的允许区中。b，位于拉氏构象图第三象限的允许区中。b每圈螺旋由3.6个氨基酸残基构成，每个氨基酸沿螺旋轴的长度为0.15nm，故一圈螺旋的螺距为0.54nm。c螺旋上第n个残基的C=0基与后面n+4残基的NH基形成氢键。d沿主链计数，一个氢键闭合的环包含13个原子，故α螺旋也称为3.613螺旋。e螺旋。e在实际蛋白质结构中，α螺旋的长度可有很大不同，从4.5个氨基酸到40多个氨基酸都有发现，平均长度大约是10个残基，相当于1.5nm长。f 长。f 除了螺旋两端的少数f 除了螺旋两端的少数NH和CO未形成氢键外，螺旋中的所有C=0基和NH基都相互形成氢键，构成α螺旋稳定的重要因素。这使得α螺旋具有极性，并常常出现在蛋白质分子的表面。g螺旋具有极性，并常常出现在蛋白质分子的表面。g螺旋的N, C, O原子与螺旋轴的距离分别为1.57，1.57，1.61，1.61，1.76Å，比它们的范氏半径仅大约1.76Å，比它们的范氏半径仅大约0.1Å，因此0.1Å，因此α螺旋中心没有空腔，具有原子密堆积结构，这是其稳定的一个重要因素 构，这是其稳定的一个重要因素

【2】. 螺旋偶极子*在α螺旋中，肽单位都沿着螺旋轴以同一方向排布，因此其间所有氢键都指向同一方向。由于一个肽单位的NH和CO基各自具有极性，使其产生偶极矩，基各自具有极性，使其产生偶极矩，这一肽单位偶极矩也沿螺旋轴排布。使其产生偶极矩，这一肽单位偶极矩也沿螺旋轴排布。这样产生的总这一肽单位偶极矩也沿螺旋轴排布。这样产生的总效应就是使一段α螺旋整体成为一个偶极子，在其氨端荷局部正电，螺旋整体成为一个偶极子，在其氨端荷局部正电，羧端荷局部负电。在其氨端荷局部正电，羧端荷局部负电。这一偶极矩的量级相当于羧端荷局部负电。这一偶极矩的量级相当于在螺旋的每一端产生0.5-0.7单位电荷，这些电荷有可能吸引荷电的配体。*单位电荷，这些电荷有可能吸引荷电的配体。*事实上，当配体含有荷负电的磷酸基时，常常发现它与螺旋的N端结合。但是，荷正电的配体很少发现它们与螺旋C端结合，这大概是因为除了偶极效应之外，结合尚需合适的立体化学因素。 极效应之外，结合尚需合适的立体化学因素。

【3.】两亲性螺旋 A在α螺旋中，氨基酸残基的侧链从螺旋骨架伸出，决定了螺旋的表面特性。B螺旋中，氨基酸残基的侧链从螺旋骨架伸出，决定了螺旋的表面特性。B许多α螺旋的一侧主要分布着亲水（荷电、极性）残基，在另一侧主要集中疏水残基，从而具有两亲性（amphipathicity）。amphipathicity）C这种两亲性螺旋常以其疏水面彼此聚合，也易于与其它疏水表面聚合，并可设计与两性介质结合。D在蛋白质中，α螺旋大多沿分子表面分布，其一侧面向溶剂，另一侧面向疏水内核，螺旋的两亲性正好适应这种要求。疏水残基与亲水残基按螺旋旋转周期规律地相间分布，是产生两亲性的基本原因可水残基与亲水残基按螺旋旋转周期规律地相间分布，是产生两亲性的基本原因【是产生两亲性的基本原因【一段α螺旋是否具有两亲性，用螺旋转轮（helicαl wheel）的方式来预测】

【4】倾向于形成α螺旋的氨基酸 *强烈倾向于形成α螺旋的氨基酸残基包括：Ala, Glu, Leu和Met；非常不利螺旋的氨基酸残基包括：Ala, Met；非常不利于α螺旋形成的残基有：Pro, Gly, Tyr和Ser。螺旋形成的残基有：Pro, Ser。*其中Pro残基的侧链与主链N原子形成共价键，使其丧失形成氢键的能力，并对α螺旋构象产生空间障碍。因此，除螺旋的第一圈外，α螺旋中凡有Pro出现的地方就会发生弯折。*弯折。*不能把所有出现弯折的情况均归因于Pro的出现 的出现

16. β层（β-sheet）β链（β-strand）**β层的基本单位是β链，它在多肽链中具有近乎全伸展的构象，可视为每圈具有2个氨基酸残基和每个残基有约0.35nm平移距离的特殊螺旋，位于拉氏构象图的第二象限中。【只有当一股β链与另一股β链间以主链氢键相联，组合在β层时，它们才能稳定。所以，在蛋白质结构中出现β链都是以β层方式存在，它们一般包含5-10个氨基酸。】

【1】平行和反平行β层 β链的组织方式与α螺旋有显著不同:α螺旋是由一条多肽链在序列上相近的连续区构成的，β层则是由序列上离得很远的（分子内）或不相关的（分子间）不同多肽链区域组合而成的。在β层中，来自不同位置的β链彼此靠近，在链间组成C=0与NH氢键，形成层状结构*β链呈锯齿状:链呈锯齿状:几条β链形成的β层并非是完全平面的，而是以Cα为支点上下折叠，相应的侧链的取向也随之上下交替。所以β层在早期被称为β折叠层。 *折叠层。 *在平行 *在平行β层（parallel 层（parallel β-sheet）中的所有-sheet）中的所有β链都具有同一走向，即从氨端到羧端；在反平行β层（antiparallel β-sheet）中的相邻二条-sheet）中的相邻二条β链具有相反的走向，一条从氨端到羧端，另一条则从羧端到氨端。反平行层更稳定 *反平行层更稳定 *β层可以由同一分子内同一肽链的不同区域或不同肽链的β链形成。 *链形成。 *混合型 *混合型β层:β链也可以组合成混合型β层，即一部分以平行方式排布，而另一部分以反平行方式排布，即一部分以平行方式排布，而另一部分以反平行方式排布，β层的组织有很强的对抗混合层形成的趋向

【2】扭转层:在已知的蛋白质结构中，所有平行、在已知的蛋白质结构中，所有平行、反平行和混合型β层中的β链都是沿其前进方向不断扭转的肽链（twisted strαnd），，从而使实际蛋白质结构中出现的β层都不是平直的层面，而是一种扭转层。【扭转β层链（twisted nd）

也有左右手两种方式，但在已知结构中发现的仅有单一型式，称为右手扭转。 】

17环肽链（loop）相对刚性的α螺旋和β层组合构成蛋白质的完整三维结构时，必须有环状肽链相连接。 【1】回折（reverse trun）结构的基本特征是使其所连接的肽链发生180°的急转弯。现在知道，球蛋白约三分之一残基是位于多肽链的急转弯区域中，它们使分子表面的肽链反向转折从而使蛋白质的球状结构得以形成。 β-转折（β-turn） 最常见的回折结构是。β-转折是由4个氨基酸残基 最常见的回折结构是β转折（β-turn，中译也称-turn，中译也称β-转角）（i到i+3）顺序连接的一段短肽链，它具有i+3）顺序连接的一段短肽链，它具有180°弯折的特殊构象。标准的β-转折的第4个残基（i+3个残基（i+3）i+3）NH与第

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一个残基（i一个残基（i）的C=O间有氢键形成，称为4®1氢键。由于这一构象的柔性及蛋白质表面介质环境的复杂性，有时β-转折的4®1氢键不能形成，因此在β-转折的实际辨识中，第1个残基与第4个残基的Cα间的适当距离比有无氢键更为重要。【 存在三种类型的标准β-转折，称为I型，II型，II型，III型，III型；它们各自的对映体也存在，称为I’, II’和, II’和III’型。最常见的是III’型。最常见的是I型β-转折，其在蛋白质中的出现频率比II型高2-3倍】 倍】 γ-转折 由三个氨基酸残基构成的转折也有发现，称为γ-转折（γ-turn）-turn） β发夹 通过一段短的环链将二条相邻的β链连接在一起的结构，称为β发夹或发夹（hairpins【β发发夹或发夹（hairpins）结构。hairpins）结构。夹经常出现在蛋白质结构中，常具有重要的功能性意义，如参与配体-。 夹经常出现在蛋白质结构中，常具有重要的功能性意义，如参与配体-受体结合位置以及酶活性中心的形成】β凸起的基本结构特征是，在两个连续β型氢键之间的一个凸起区域，一股链上的二个残基对着另一股链上的一个残基。 个残基。 18疏水内核：随后大量蛋白质结构被阐明，显示出蛋白质结构具有一个共同的特征：分子内都有一个疏水内核，由紧密堆积的疏水侧链构成。将疏水侧链堆积进入分子内部，由紧密堆积的疏水侧链构成。将疏水侧链堆积进入分子内部，是蛋白质折叠的主要驱动力，将疏水侧链堆积进入分子内部，是蛋白质折叠的主要驱动力，是天然蛋白质稳定的是蛋白质折叠的主要驱动力，是天然蛋白质稳定的基本结构因素。 基本结构因素。 【1蛋白质分子内核中的疏水侧链是以高度协调的方式达到紧密的二级结构协调相嵌。2*蛋白质分子内核中的疏水侧链是以高度协调的方式达到紧密的二级结构协调相嵌。2*对一些蛋白质疏水内核2*对一些蛋白质疏水内核的堆积堆积的，它们的几何形貌必须达到空间互补，并与分子内部密度，估算所得到的平均值是0.75，表明尽0.75，表明尽管蛋白质的整体结构各不相同，但它们的疏水内核的堆积密度与大多数密堆积晶体一样高。*3疏水内核还是推动以二级结构为基础的蛋白质分子骨架形成的重要因素。4动以二级结构为基础的蛋白质分子骨架形成的重要因素。4由于疏水侧链的内埋，必然带动其主链也随之进入分子内部。5子内部。5主链是高度极性的，它们每个肽单位都带有一个氢键给体NH和一个氢键受体CO。在内核的疏水环境CO。在内核的疏水环境中，这些极性基团必须通过彼此形成氢键来彼此中和。这是蛋白质二级结构（主要是α螺旋和β层）形成的驱动因素。】 19疏水作用*疏水内核的形成是以疏水相互作用为基础的。*疏水内核的形成是以疏水相互作用为基础的。*所谓疏水作用（hydrophoβic interαction）是指ction）是指非极性基因在任何极性环境中强烈趋于彼此聚集的择优效应。*非极性基因在任何极性环境中强烈趋于彼此聚集的择优效应。*疏水作用在本质上是一种能量效应。疏水作用是一个从高能态趋于低能态的自动发生的过程。 一个从高能态趋于低能态的自动发生的过程。 第二章 蛋白质的结构 1.蛋白质的一级结构的含义：①组成蛋白质的多肽链数目.①组成蛋白质的多肽链数目.②多肽链的氨基酸顺序，③多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础 2.从蛋白质一级结构能得到的信息：①预测蛋白质的二级及三级结构②研究生物的进化关系（同宗比较）：比①预测蛋白质的二级及三级结构②研究生物的进化关系（同宗比较）较不同生物体内同种蛋白质一级结构，建立蛋白质分子进化树，其与物种的进化树相似③研究功能相似的蛋白质的亲缘关系（“同亲”比较）：建立家族 ：建立家族 相似性大于30％的为同源蛋白质，为同一家族 ％的为同源蛋白质，为同一家族 若相似性比较小，即不是同源蛋白质，④“远源”比较：通过功能相距甚远的蛋白质之间进行序列比较，可以发现一些蛋白质的新的模体或结构域，从而建立蛋白质的超级家族；并揭示一些蛋白质可能具有的新功能。 3.蛋白质的二级(Secondary)结构是指多肽链的主链局部在空间的排列或规则的几何走向。【它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。二级结构是蛋白质复杂空间构象的基础，故又称为构象单元。】 蛋白质二级结构的类型：⑴规则的二级结构：主要有a-螺旋、b-层、⑵部分规则的二级结构：β-转折、γ-转折 转折 β发夹、β凸起⑶蛋白质中的无规律卷曲：无规卷曲 凸起⑶蛋白质中的无规律卷曲：无规卷曲 4.影响α-螺旋结构形成的因素：侧链R-基团所带的电荷，如多聚赖氨酸，在中性和酸性条件下不能形成α-螺旋； R-基团的大小，太大影响α-螺旋的形成，如多聚异亮氨酸； 脯氨酸和羟脯氨酸，不能形成链内氢键，它只能出现在螺旋的第一圈中； 它只能出现在螺旋的第一圈中； 甘氨酸由于没有侧链的取代基团，所以它参与的肽键活动性更大，也影响了螺旋的稳定。 了螺旋的稳定。 5. b层的特点：①平行b层一般为大结构，少于5个b链很少，通常疏水的侧链排列在折叠片平面的两侧。②反平行b层可以少到只有两个b链组成，通常所有的疏水的侧链都排列在折叠片的一侧。③在纤维状蛋白通常所有的疏水的侧链都排列在折叠片的一侧。③在纤维状蛋白质中主要是在不同肽链之间形成的反平行b层；而在球状蛋白质中反平行b层和平行b层都存在，其b层既可在同一肽链间形成，也可在不同肽链间形成 既可在同一肽链间形成，也可在不同肽链间形成 6.二级结构的可变性：溶液pH改变侧链基团的电荷，影响二级结构的形成。温度：温度升高影响氢键的形成，影响蛋白质二级结构的形成；不同溶剂的影响：如弹性蛋白酶，在水溶液中有7％的α螺旋，但在十二烷基磺酸钠存在时，α螺旋约为35％。在极端的条件下，完全转变为无规卷曲形式。 下，完全转变为无规卷曲形式。 7.两可肽：蛋白质中可以形成两种不同二级结构形式（主要为α螺旋、β层）的肽段，叫两可肽。 层）的肽段，叫两可肽。 8.超二级结构：指相邻的二级结构元件相互聚集，形成有规律的二级结构的聚集体，也称为基序（motif）。 3 主要有αα，βαβ【两段平行的β链和作为连接链的α螺旋组成常见为Rossman折叠】和ββ三大种类型 三大种类型 M. Rossman等人研究中发现，蛋白质的多肽链在三维折叠中往往形成有规律的二级结构9.Rossman折叠：M. Rossman的聚集体。在球状蛋白质中，更常见的是两个βαβ聚集体连在一起，形成βαβαβ结构，称为Rossman折叠。 折叠。 超二级结构特征描述: 10.序列模式：是指蛋白质一段肽链上每一残基构象和其氨基酸序列的关系，描述的是蛋白质空间结构与氨基是指蛋白质一段肽链上每一残基构象和其氨基酸序列的关系，描述的是蛋白质空间结构与氨基酸序列的关系。【每一类型的超二级结构都有确定的序列模式】应用：可从蛋白质一级结构中预测哪一段肽链含有哪种类型的基序 链含有哪种类型的基序 疏水性分析：超二级结构中各残基对溶剂的相对亲水和疏水性的性质，是超二级结构的一个重要结构特征。 超二级结构中氢键模式的分析 主要研究连接肽之间的氢键的形成情况 主要研究连接肽之间的氢键的形成情况 应用：根据研究结果可以建立模型，进行结构预测等 进行结构预测等 11.结构域：多肽链在二级结构或超二级结构的基础上，形成三级结构的局部折叠区，它是相对的紧密球状实体。包括反平行α螺旋结构域（全α-结构）；平行或混合型β折叠片结构域（α，β结构）；反平行β折叠片结构域（全β-结构）和富含金属或二硫键结构域四种类型 结构）和富含金属或二硫键结构域四种类型 功能域：蛋白质分子中能存在的功能单位。【功能域可以是一个结构域，也可以是多个结构域组成。前者如肌红蛋白；后者如酵母的己糖激酶，其功能域为两个结构域组成，在两者之间组成活性部位。】 **对于较小的球状蛋白质和亚基，因只有一个结构域，故结构域和三级结结构域与三级结构或蛋白质的关系构是一个意思。**对于较大的球状蛋白质，因含有多个结构域，三级结构是多个结构域组成的。**对于含有多个结构域的分子或亚基，多数分子外形偏长，结构域之间有一个裂沟或密度较小的区域，如己糖激酶 12.蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指由二级结构的元件构建成的总三维构象。包括一级结构中相距远的是指由二级结构的元件构建成的总三维构象。包括一级结构中相距远的肽段之间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间的相互关系。[维系力主要是非共价键，其中尤其是疏水相互作用在蛋白质三级结构中起着重要作用。此外，某些蛋白质在三级结构中还有二硫键的参与。] 13.蛋白质的四级结构(Quaternary Structure) ：由数条具有三级结构的多肽链（亚基）彼此之间相互连接而成的聚合体结构，就是蛋白质的四级结构。四级结构往往是对称的。 四级缔合在结构和功能上的优越性：①增强结构稳定性②提高遗传经济性和效率③使催化基团汇集在一起④具有协同效应和别构效应 协同效应和别构效应 [四级结构的驱动力主要为疏水相互作用。] 14.作为蛋白质四级结构组分的多肽链，通常称为亚基（ Subunit ）亚基特点： 1) 亚基借疏水键、氢键、盐键或二硫键缔合。 键或二硫键缔合。 2) 亚基单独存在时无生物学活性。 亚基单独存在时无生物学活性。 3) 组成寡聚蛋白的亚基可相同也可不同。 组成寡聚蛋白的亚基可相同也可不同。 15.亚基相互作用的方式：⑴亚基缔合的专一性由相互作用的表面上的极性基团之间的氢键和离子键提供。驱⑴亚基缔合的专一性由相互作用的表面上的极性基团之间的氢键和离子键提供。驱动力仍然是疏水相互作用。⑵亚基或原体的缔合有相同亚基或原体和不同亚基或原体之间的缔合 ①相同亚基或原体缔合又分为同种缔合和异种缔合：同种缔合较简单：相互作用的表面相同，多为闭合的二聚体，异种缔合复杂：相互作用的表面不相同，多为一种开放末端结构，其可以无限聚合，形成线形和螺旋形大聚集体；也有闭合环状的结构。②不相同亚基或原体缔合复杂： 形大聚集体；也有闭合环状的结构。②不相同亚基或原体缔合复杂： 15单体蛋白：仅由一个亚基组成的蛋白质。由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白。 .原体：对称的寡聚蛋白分子可视为由两个或多个不对称的相同结构成分组成，这种相同结构成分称为原体。 第二节 蛋白质折叠 蛋白质从伸展的多肽链形成其特定的立体结构的过程叫折叠（folding）维持其特定的立体结构的作用力主要为：氢键、疏水作用、范德华力、离子键和配位键 为：氢键、疏水作用、范德华力、离子键和配位键 16.蛋白质的变性：某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的天然钩象状态，某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的天然钩象状态，引起蛋白质理化性质改变并导致能够破坏蛋白质的天然钩象状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。变性的标志是失去生物活性； 是失去生物活性； 变性的实质是共价键不变，次级键破坏。变性因素:化学因素：强酸和强碱，尿素，胍 化学因素：强酸和强碱，尿素，胍 物理因素：紫外线，加热，剧烈振荡，超声波，X-射线 射线 变性蛋白的特性：溶解度降低，结晶能力丧失，易被消化，等电点有所提高等应用：做豆腐，重金属盐的急救；制备酶制剂时防止变性 做豆腐，重金属盐的急救；制备酶制剂时防止变性 变性与沉淀的关系：变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。 伴随着不可逆沉淀。 蛋白质的一级结构决定其高级结构。换言之，蛋白质的三维立体结构完全取决于其氨基酸的序列。蛋白质的天然立体结构一般是自由能最低的状态 天然立体结构一般是自由能最低的状态 4 二硫桥对肽链的正确折叠并不是必要的，但它可以稳定蛋白质的折叠肽结构。 对肽链的正确折叠并不是必要的，但它可以稳定蛋白质的折叠肽结构。 大多数蛋白质在空间结构时无二硫键的原因：多数蛋白质在细胞内相对缺氧的环境中，此环境条件下巯基倾向于还原态，只有分泌蛋白质才可能处于氧含量较高的条件，故分泌蛋白质中二硫键较多。 蛋白质的三维结构是多肽链上各个单键旋转自由度受到各种的结果。 蛋白质的三维结构是多肽链上各个单键旋转自由度受到各种的结果。 17. 研究蛋白质折叠的方法： 蛋白质折叠的动力学**蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最底的构象，而是一种累积选择，就是每此搜索把正确折叠的那部分结构保留下来，因此，把正确折叠的那部分结构保留下来，因此，蛋白质折叠实质上是保留局部正确折叠的中间体。**研究折叠中间体的方法：如快速动力学法（停留法、温度跃迁法），脉冲标记NMR，脉冲H-D交换等**蛋白质折叠经过熔球态的中间体阶段，熔球态是只具有二级结构，但无三级结构的一种状态，熔球态形成的驱动力主要是疏水相互作用。 球状蛋白质折叠的步骤：①由完整的伸展态快速、可逆地形成局部二级结构，此为成核过程；②通过折叠核的协同聚集形成初始的结构域由这些结构域装配成熔球态④对结构域的构象进行调整⑤形成完整三级结构的蛋白质单体或天然蛋白质 的蛋白质单体或天然蛋白质 18.体内蛋白质折叠有异构酶和伴侣蛋白参加； 体内蛋白质折叠有异构酶和伴侣蛋白参加； 异构酶有两种：二硫键异构酶：能快速催化二硫键的重组，导致快速形成正确的二硫键；能快速催化二硫键的重组，导致快速形成正确的二硫键；肽基脯氨酸异构酶：导致快速形成正确的二硫键；肽基脯氨酸异构酶：催化脯氨酸的氨基参与形成的肽键由反式转变为顺式； 催化脯氨酸的氨基参与形成的肽键由反式转变为顺式； 是通过抑制新生肽链的不恰当聚集并排除与其他蛋白质不合理的结合，协助蛋白质正确折叠的19.分子伴侣：是通过抑制新生肽链的不恰当聚集并排除与其他蛋白质不合理的结合，协助蛋白质正确折叠的蛋白质。包括与核糖体结合的分子伴侣 有触发因子（TF），新生链结合物(NAC)和不与核糖体结合的分子伴侣：热激蛋白70（hsp70)家族 家族 热激蛋白40（hsp40)家族 家族 Hsp70的辅助分子－－GrpE 热激蛋白60（hsp60)家族其功能有：①封闭折叠蛋白的暴露的疏水区段②创建一个隔离的环境，蛋白质可互不干扰地在此折叠③促进折叠和去聚合④遇到应激时，使已经折叠的蛋白质去折叠 促进折叠和去聚合④遇到应激时，使已经折叠的蛋白质去折叠 第三章 蛋白质的结构与功能 肌红蛋白的组成：它由一条多肽链和一个辅基血红素组成。除去血红素的脱辅基肌红蛋白称为珠蛋白。其由153个氨基酸残基组成。 个氨基酸残基组成。 血红素的两种存在形式： 亚铁Fe2+——（亚铁）血红素——（亚铁）肌红蛋白Fe2+——（亚铁）血红素——（亚铁）肌红蛋白 ——（亚铁）血红素——（亚铁）肌红蛋白 高铁Fe3+——高铁血红素——高铁肌红蛋白。只有亚铁肌红蛋白才能与氧结合。Fe3+——高铁血红素——高铁肌红蛋白。只有亚铁肌红蛋白才能与氧结合。 ——高铁血红素——高铁肌红蛋白。只有亚铁肌红蛋白才能与氧结合。 O2与肌红蛋白的结合：O2与肌红蛋白中的铁以配位键结合，Fe-O与肌红蛋白中的铁以配位键结合，Fe-O键与卟啉环平面呈60度角。肌蛋白中，血红素Fe原子的第六配价键可以与不同的分子结合：无氧存在时，与水结合，生成去氧肌红蛋白；有氧存在时，能够与氧结合形成氧合肌红蛋白。 够与氧结合形成氧合肌红蛋白。 血红蛋白的主要功能：在血液中结合并转运氧气 ：在血液中结合并转运氧气 血红蛋白组成：4个多肽亚基，两个是a亚基（141AA，两个是b亚基（146AA亚基（141AA）141AA）亚基（146AA）146AA） ； 4个血红素基，每个亚基结合一个;个血红素基，每个亚基结合一个;每个a亚基和b亚基 亚基 在三级结构上与肌红蛋白（153AA在三级结构上与肌红蛋白（153AA）极为相似。153AA）极为相似。 ）极为相似。 血红蛋白中，血红素Fe原子的第六配价键可以与不同的分子结合：有氧存在时，能够与氧结合形成氧合血红蛋白(HbO2)。(HbO2)。无氧存在时，与水结合，生成去氧血红蛋白(Hb)存在时，与水结合，生成去氧血红蛋白(Hb)；(Hb)； 变构现象：许多蛋白质在表现其功能时，构象会发生一定的改变，这种现象，叫变构现象。如血红蛋白。 去氧血红蛋白中亚基间盐键：8个盐键有6个处于不同亚基间。6个处于不同亚基间。6个中4个涉及C-末端或C-末端或N-末端残基：N-末端残基：a链两个和b链两个。另两个连接两a链的Asp126和Arg141残基。此外，每条b链的AspFG1和HisHC3间有盐键 间有盐键 Bohr效应：pH对血红蛋白的亲和力的影响称为Bohr效应。 效应。 H+、CO2促进氧的释放 Bohr效应的生理意义：当血液流经组织特别是流经代谢迅速的肌肉时，由于这里的pH较低，CO2较低，CO2浓度较高，因 5 此有利于血红蛋白释放氧，使组织能比单纯的p(O2)降低获得更多的氧，而氧的释放又促进血红蛋白与p(O2)降低获得更多的氧，而氧的释放又促进血红蛋白与H+和H+和CO2的结合，起着缓冲血液的作用。而血液流经肺部时，情况正好相反。 的结合，起着缓冲血液的作用。而血液流经肺部时，情况正好相反。 H+促进氧的释放的原因：H+与H+与α链的N-末端的游离的氨基及N-末端的游离的氨基及β链的C-末端的C-末端的His的咪唑基结合，使这些基团质子化，利于盐键的形成，因而有利于血红蛋白T态的形成，促进氧的释放。 CO2与血红蛋白结合：在R态时，各亚基的N-端的N-端的α氨基都是游离的，CO2氨基都是游离的，CO2可以与4个亚基N－末端的α氨基结合，释放的质子可贡献于Bohr，形成的氨基甲酸还可形成额外的盐键，有助于稳定Bohr，形成的氨基甲酸还可形成额外的盐键，有助于稳定T态，促进氧的释放。 态，促进氧的释放。 BPG降低Hb对氧的亲和力

BPG的结合部位：四个亚基缔合形成的空穴。带负电荷的BPG与β－链的带正电荷的侧链基团结合，将两个β链通过离子键交链在一起。BPG与两个β链之间的这些离子键有助于稳定血红蛋白T态的构象，促进氧的释放。脱BPG的血红蛋白对氧的亲和力很大。 的血红蛋白对氧的亲和力很大。

分子病：由于基因突变导致蛋白质一级结构改变而产生的遗传病。如镰刀性贫血病。 由于基因突变导致蛋白质一级结构改变而产生的遗传病。如镰刀性贫血病。

SH2结构域结构：大约有100氨基酸残基组成，结构相当保守；讫今研究过的SH2结构域都有一个大的反平行的β片层中心，两侧α-螺旋及一些后续结构。 SH2结构域：90年代初，人们发现在与磷酸化受体酪氨酸激酶结合的信号转导蛋白中大部分含有SH2结构域。进一步研究发现，分离的SH2结构域本身也能与磷酸化的受体酪氨酸结合，且这种结合是有特异性的，不同SH2结构域与不同的含有磷酸化酪氨酸（pTyr）残基的区域结合，对丝pTyr）残基的区域结合，对丝/）残基的区域结合，对丝/苏氨酸残基几乎没有亲和力。

可将含SH2 的蛋白粗分为两类：一类为具有酶活性且酶活性对下游的信号转导是必不可少的；二类为无酶活性的信号转导蛋白。

SH2结构域的配基可归为二类I类配基序列为酪氨酸-类配基序列为酪氨酸-亲水-亲水-亲水-亲水-疏水；II疏水；II类为酪氨酸-类为酪氨酸-疏水-X-疏水-X-疏水。-X-疏水。

SH2的功能 膜定位功能：接近底物 膜定位功能：接近底物 酪氨酸磷酸化激活：信号传递 酪氨酸磷酸化激活：信号传递 酪氨酸磷酸化激活：信号传递 变构激活：活性增加 变构激活：活性增加 变构激活：活性增加 含SH2结构域的蛋白质功能参与了磷脂代谢、 参与了磷脂代谢、 氨基酸磷酸化和去磷酸化、GTP氨基酸磷酸化和去磷酸化、GTP酶激活、基因表达、蛋白质迁移和细胞骨架构建等 和细胞骨架构建等

目前已知的几个SH3结构域在形成的三维空间结构上有较大的外观差异，但是它们的基本骨架结构（拓扑结构）是很相似的，基本折叠包括两个垂直的β片层，其中由一些保守氨基酸经折叠构成的疏水区域成为结合配基的“口袋”。 “口袋”。

SH3配基的共同特点是结合位点内为一些富含脯氨酸的残基（共约10个氨基酸），核心部分为PXXP（PXXP（X为除半胱氨酸之外的任一氨基酸）。

PH结构域在信号转导中不仅介导蛋白与蛋白之间的作用，而且介导蛋白与脂质之间的结合以帮助蛋白在质膜的定位，含有PH结构域的蛋白既在信号转导中起作用也在细胞骨架形成中起作用 结构域的蛋白既在信号转导中起作用也在细胞骨架形成中起作用 PH配基磷酸肌醇类为第一类配基，PKC磷酸肌醇类为第一类配基，PKC为第二类配基，G为第二类配基，G蛋白的βr亚基为第三类配基 亚基为第三类配基

第四章 糖蛋白

1.糖复合物(glycoconjugate)：单糖、寡糖或多糖链在酶的催化下与蛋白质或脂类等非糖物质的特定部位共价结合形成的化合物，叫糖复合物。糖复合物种类：糖蛋白、蛋白聚糖、脂多糖、糖脂等。 糖蛋白、蛋白聚糖、脂多糖、糖脂等。 2.糖基化作用（glycosylation) ：单糖、寡糖或多糖链在酶的催化下与蛋白质或脂类等非糖物质的特定部位共价结合形成糖复合物的过程，叫糖基化作用 价结合形成糖复合物的过程，叫糖基化作用 3.糖蛋白（Glycoproteins）的概念:自然界中分布最广的一类糖复合物，几乎所有的细胞都能合成糖蛋白，由短链寡糖与蛋白质共价相连而成。 短链寡糖与蛋白质共价相连而成。

N-糖肽键：糖的半缩醛羟基与肽链上的Asn的酰胺基团上的氨基形成N-糖肽键。核心五糖区：变化少N-糖肽键。核心五糖区：变化少.N-糖肽键。核心五糖区：变化少.N-糖链的.N-糖链的外围链：在核心五糖区以外的非还原端，发生多种变化 外围链：在核心五糖区以外的非还原端，发生多种变化

根据N-糖链的外围链的不同，N-糖链又分为三类：复杂型：根据连接的糖链的分支数又分为五类 根据连接的糖链的分支数又分为五类 高甘露糖 高甘露糖

型 杂合型 杂合型 杂合型

N-糖链糖基化位点与肽链氨基酸序列 与N-糖链相连的肽链氨基酸序列特征为：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr(X残基是Pro外的氨基酸）上述序列只是一个潜在的N-糖基化位点，N-糖基化位点，是否糖基化还要看肽链的空间结构，糖基化位点，是否糖基化还要看肽链的空间结构，一般上述序列多处于是否糖基化还要看肽链的空间结构，一般上述序列多处于β－转角处时（在蛋白－转角处时（在蛋白质分子表面），才可以糖基化 ，才可以糖基化 序列中的X为极性氨基酸残基时，糖链常为复杂型N－糖链；如X为非极性氨基酸残基时，糖链常为高甘露

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糖型N－糖链. －糖链.

O-糖肽键：糖链上的半缩醛羟基与肽链上的Thr, Ser, HyPro, HyLys的羟基形成O-糖肽键；O-糖肽键； 糖肽键；

O-糖链糖基化位点与肽链氨基酸序列 特征结构序列不清；糖基化位点多在蛋白质分子表面；位点附近常出现 特征结构序列不清；糖基化位点多在蛋白质分子表面；位点附近常出现Pro；Pro；Ser/Thr比较集中存在 比较集中存在 O-GlcNAc糖基化蛋白

该类蛋白有三个显著特点：糖基化位点上只连接1个GlcNAc糖基 糖基 糖基化处于一种动态平衡中 糖基化处于一种动态平衡中 糖基化处于一种动态平衡中 仅存于细胞核和细胞质内 细胞质内

与O-GalNAc连接糖链相连的氨基酸序列有;-T-X-X-X-,其中有1个X为Thr；-X-P-X-X-X-，其中有1个X为Thr； -X-X-T-X－，其中有1个X为碱性氨基酸；-S-X-X-X-，其中有1个X为Ser 。 糖链的微观不均一性（糖型）（glycoform)：生物体内出现的具有相同肽链和不同糖链结构的同种糖蛋白的现象。 糖链的微观不均一性（糖型）可表现为多种形式：在同一糖基化位点连接不同糖链；有的糖基化位点是非保守的在同一糖基化位点连接不同糖链；有的糖基化位点是非保守的位点；有多个糖基化位点，但不是每一个糖基化位点都在任何情况下都被糖基化 位点；有多个糖基化位点，但不是每一个糖基化位点都在任何情况下都被糖基化 糖链合成的基本特点：糖基供体：合成糖链的单糖的活化形式有两种。磷酸长萜醇形式：长萜醇（dolichol,Dol)是聚异戊二烯的衍生物，一侧的羟基通过磷酸基与糖基相连，核苷酸形式：如GDP-Man,UDP-GlcNAc 糖基接受体:Asn侧链的酰胺基；Ser/Thr侧链的酰胺基；Ser/Thr的羟基；鞘氨醇或脂酰甘油的羟基 的羟基；鞘氨醇或脂酰甘油的羟基 糖基转移酶：是糖链合成的中心环节，其对糖基供体和受体都有高度的专一性；是糖链合成的中心环节，其对糖基供体和受体都有高度的专一性；一条糖链的合成需要一组糖基转其对糖基供体和受体都有高度的专一性；一条糖链的合成需要一组糖基转移酶按一定次序先后发挥作用来完成；不同种属的生物，同一生物的不同组织，同一组织或细胞的不同发育阶段，不同的生理和病理状态下其糖基转移酶的表达差异很大，因而导致糖型的出现。如运铁蛋白，正常人糖链中90％90％以上是二天线N－糖链，而肝癌病人二天线N-糖链比例明显下降，N-糖链比例明显下降，三天线糖链和核心岩藻糖链比例明显增加。糖链比例明显下降，三天线糖链和核心岩藻糖链比例明显增加。一三天线糖链和核心岩藻糖链比例明显增加。一个基因对应一个糖苷键 个基因对应一个糖苷键

N－糖链的合成N-糖链的合成与肽链的合成同时进行N-糖链的合成与肽链的合成同时进行,糖链的合成与肽链的合成同时进行,合成部位是粗面内质网和高尔基体； 合成部位是粗面内质网和高尔基体； N-糖链的合成的抑制剂是衣霉素N-糖链的合成的抑制剂是衣霉素N-糖链的生物合成步骤合成以酯键相连的寡糖前体（N-糖链的生物合成步骤合成以酯键相连的寡糖前体（G糖链的生物合成步骤合成以酯键相连的寡糖前体（G－寡糖）将前体转移到正在增长着的肽链上除去前体的某些糖单位在剩余的寡糖核心上再加入另外的糖分子 在增长着的肽链上除去前体的某些糖单位在剩余的寡糖核心上再加入另外的糖分子 长醇焦磷酸寡糖的合成：首先细胞内合成长醇（又叫多萜醇），长醇是由异戊二烯单元组成，其与CTP反应，并以磷酸长醇的形式整合到内质网膜上（13。两分子的GlcNAc结合到磷酸长醇上（1。5分子的Man甘露糖结合以磷酸长醇的形式整合到内质网膜上（13）13）结合到磷酸长醇上（1）上（2。寡糖链翻转到内质网内腔（3。甘露糖与另一分子磷酸长醇结合（4，并翻转到内质网内腔（5。4个上（2）。寡糖链翻转到内质网内腔（3）。甘露糖与另一分子磷酸长醇结合（4），并翻转到内质网内腔（5）甘露糖继续结合到寡糖链上（6。葡萄糖与另一分子磷酸长醇结合（7，并翻转到内质网内腔（8。3个葡萄糖甘露糖继续结合到寡糖链上（6）。葡萄糖与另一分子磷酸长醇结合（7），并翻转到内质网内腔（8）继续结合到寡糖链上（9。长醇焦磷酸上的寡糖链转移到天冬酰胺上。（10）继续结合到寡糖链上（9）10）

糖蛋白在内质网和高尔基体中，在糖基转移酶和糖苷水解酶的共同作用下，加工为成熟的糖蛋白。 O－糖链的合成O-糖链的合成在肽链合成之后合成；O-糖链的合成在肽链合成之后合成；O-糖链的合成在肽链合成之后合成；O-糖链结构简单，但缺乏明显的规律性，其中O-糖链结构简单，但缺乏明显的规律性，其中O-GalNAc糖链研究多，场所因细胞和组织而异无共同的前体，在肽链的特定位点糖基按次序逐个连接形成；合成的调节复杂。O-GalNAc糖链的合成： 糖链的合成：

溶酶体酶的糖基化粗面内质网上合成并进行N-糖链的糖基化修饰；顺式高尔基体中进行甘露糖的磷酸化，形成N-糖链的糖基化修饰；顺式高尔基体中进行甘露糖的磷酸化，形成Man-6-P，被反式高尔基体中的Man-6-P，被反式高尔基体中的Man-6-P受体识别，使其与其它酶分开，并得以浓缩；以出芽的方式转运到溶酶体。 体。

糖链的降解糖。蛋白中的糖链在溶酶体中进行降解。一般由不同的糖苷水解酶从非还原端逐个将糖基水解下来。糖肽键则由专一的糖苷水解酶水解。O-糖肽键则由专一的糖苷水解酶水解。O-糖链的水解：O-糖链的水解：一般情况是糖链和肽链的降解同时进行，糖链的水解：一般情况是糖链和肽链的降解同时进行，但当糖链含唾液酸一般情况是糖链和肽链的降解同时进行，但当糖链含唾液酸多时，糖链则先水解。 多时，糖链则先水解。

G-寡糖(G-oligosaccharide)：在合成N-糖链时，首先在粗面内质网中合成多萜醇焦磷酸十四糖这一共同前体，N-糖链时，首先在粗面内质网中合成多萜醇焦磷酸十四糖这一共同前体，这个共同前体叫G-寡糖。G-寡糖。 伴翻译（co-translation):N-糖链合成是和蛋白质肽链的合成同时进行，所以被称为伴翻译。N-糖链合成是和蛋白质肽链的合成同时进行，所以被称为伴翻译。 糖链合成是和蛋白质肽链的合成同时进行，所以被称为伴翻译。 糖链的生物学功能参与新生肽链的折叠和缔合,参与新生肽链的折叠和缔合,如N-糖链前体N-糖链前体G寡糖中Glc与肽链的折叠密切相关；参与糖蛋白的转运（分拣和分泌）：如溶酶体酶如果缺乏Man-6-P不能转运到溶酶体。保护糖蛋白：如血浆老蛋白的清除。某些糖链是维持糖蛋白活性所必需；如用衣霉素处理溶酶体β－葡萄糖苷酶，不表现催化活性；参与细胞（分子）间的相互作用：受体－配体结合、精卵识别和结合、细胞粘着、病原体侵袭等。 间的相互作用：受体－配体结合、精卵识别和结合、细胞粘着、病原体侵袭等。 分子识别(molecular recognition)：指生物分子的选择性相互作用，例如抗原与抗体之间、酶与底物或抑制剂之间、激素与受体之间的专一性结合。 之间、激素与受体之间的专一性结合。

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细胞识别(cellular recognition) ：是细胞表面分子的相互识别。 胞表面分子的相互识别。

受体(receptor)：指位于细胞膜上、细胞质或细胞核中能与来自胞外的生物活性分子（信号分子）专一结合并将：指位于细胞膜上、细胞质或细胞核中能与来自胞外的生物活性分子（信号分子）专一结合并将其带来的信息传递给效应器（离子通道、酶），从而引起相应生物学效应的生物大分子。 ，从而引起相应生物学效应的生物大分子。 配体(ligand)：被受体识别并结合的生物活性分子称为配体。 被受体识别并结合的生物活性分子称为配体。 细胞粘着(cell adhesion)：多细胞生物中细胞有相互识别而聚集成细胞群的能力。 多细胞生物中细胞有相互识别而聚集成细胞群的能力。 细胞粘着的原因：在细胞之间充满着糖蛋白（胶原蛋白、纤连蛋白、层连蛋白）、蛋白聚糖、透明质酸等组成的胞外基质，它们形成一个连续的立体网络结构，细胞就交织或浸泡在其中，细胞与细胞、细胞与胞外基质之间的连接是通过细胞膜上的膜内蛋白如整联蛋白、钙粘着蛋白、连接是通过细胞膜上的膜内蛋白如整联蛋白、钙粘着蛋白、血管地址素选择蛋白钙粘着蛋白、血管地址素选择蛋白（以上蛋白质称为粘着分子或粘血管地址素选择蛋白（以上蛋白质称为粘着分子或粘着蛋白）等分子而完成的，这些粘蛋白大多是含N-糖链的糖蛋白。N-糖链的糖蛋白。 糖链的糖蛋白。 糖蛋白的种类

根据糖蛋白的分布与功能不同：粘液糖蛋白：如消化道分泌的粘液蛋白：如颌下腺粘蛋白、胃粘液蛋白。血清糖蛋白：激素蛋白，如促黄体激素；运铁蛋白； 蛋白：激素蛋白，如促黄体激素；运铁蛋白； 参与凝血和纤溶的凝血酶原、纤溶酶原；免疫球蛋白和补体结构糖蛋白：作为胞外基质的结构蛋白如胶原蛋白、层粘蛋白、纤连蛋白；膜糖蛋白：血型抗原、组织相容性抗原、移植抗原、病毒和激素的膜受体。 移植抗原、病毒和激素的膜受体。

糖蛋白的生物功能酶活性：不同酶表现形式不同。 酶活性：不同酶表现形式不同。 激素活性 激素活性 激素活性 免疫应答、炎症反应、肿瘤转移（凝集素） 免疫应答、炎症反应、肿瘤转移（凝集素） 免疫应答、炎症反应、肿瘤转移（凝集素） 血 血型物质 型物质 细胞粘着、精卵识别、物质运输 细胞粘着、精卵识别、物质运输 细胞粘着、精卵识别、物质运输 离子转运 离子转运 离子转运 血液凝固 血液凝固 血液凝固 结构支持 结构支持 结构支持 润滑作用 润滑作用 润滑作用 凝集原（agglutinogen):从红细胞膜中提取的血型抗原称为凝集原。 从红细胞膜中提取的血型抗原称为凝集原。 外源凝聚素（凝集素或植物凝集素）是一类非抗体的蛋白质或糖蛋白，它能与糖类专一地非共价结合，并具有凝集细胞和沉淀聚糖和复合糖的作用。 集细胞和沉淀聚糖和复合糖的作用。

凝集素的功能：根瘤菌对宿主的选择性：植物产生凝集素。微生物对宿主的感染：细菌产生凝集素。动物凝集素产生的炎症反应、免疫应答，肿瘤转移等。植物凝集素对动物红细胞的凝集作用，作为有丝原，促进动物细胞培养的转化。通过与糖结合参与体内细胞与细胞、胞培养的转化。通过与糖结合参与体内细胞与细胞、细胞与分子以及分子与分子的粘着，通过与糖结合参与体内细胞与细胞、细胞与分子以及分子与分子的粘着，进而产生一系列生物学细胞与分子以及分子与分子的粘着，进而产生一系列生物学效应如免疫应答，炎症反应，肿瘤转移等。 效应如免疫应答，炎症反应，肿瘤转移等。 蛋白质分离提纯一般分为四个阶段：第一阶段（前处理）：选材、抽提溶剂、破碎方法，离心分离，取上清液。第二阶段（粗分级）：根据溶解度差异，采用适当的沉淀法，初步的分离提纯。第三阶段（细分级）：柱层析法，采用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳或蔗糖密度梯度，等电聚焦法进一步提纯。也可采用结晶法对蛋白质进一步提纯。第四阶段（质量、纯度鉴定）：有SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦法、超离心沉降法 聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦法、超离心沉降法

酶的比活力：是指每毫克酶蛋白所含有的酶活力单位数，它是酶制剂纯度的一个指标。比活力＝活力单位/mg蛋白＝总活力单位数/总蛋白mg 活力单位 总活力＝活力单位/ml酶液×总体积（ml）

酶活力单位：酶活力单位（U):酶活力单位（U):在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。U):在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。IU在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。IU（酶活IU（酶活力的国际单位）：在最适反应条件下，每分钟催化生成一微摩尔产物所需要的酶量为一个酶活力单位。kat：在最适反应条件下，每分钟催化生成一微摩尔产物所需要的酶量为一个酶活力单位。kat（酶活kat（酶活力的国际单位）：在一定条件下1秒钟转化1摩尔底物所需的酶量。1kat=6*107U 摩尔底物所需的酶量。1kat=6*107U 如SOD:在一定条件下。 SOD:在一定条件下lmL反应液中抑制连苯三酚自氧化速度的50％的酶量为一个酶活力单位（50％的酶量为一个酶活力单位（U％的酶量为一个酶活力单位（U）

§ 酶的含量可以用酶活力单位来表示：即每克酶制剂或每毫升酶制剂有多少酶单位来表示 (U/g即每克酶制剂或每毫升酶制剂有多少酶单位来表示 (U/g或U/ml）U/ml） § 纯化倍数：指提纯后与提纯前酶比活力的比值。 指提纯后与提纯前酶比活力的比值。 纯化倍数＝每次比活力/纯化倍数＝每次比活力/第一次比活力 第一次比活力 § 酶的收率：指纯化过程中酶活性的收率。回收率= 指纯化过程中酶活性的收率。回收率= 每次总活力= 每次总活力/每次总活力/第一次总活力 第一次总活力 基因表达1. 操纵子是原核基因表达的一种重要的组织形式，1. 操纵子是原核基因表达的一种重要的组织形式，操纵子中被的编码蛋白质的基因可称操纵子是原核基因表达的一种重要的组织形式，操纵子中被的编码蛋白质的基因可称为结构基因，能被为结构基因，能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列称为启动子，可以分为两种序列称为启动子，可以分为两种: 可以分为两种: 核心启动: 核心启动子元件和上游启动子元件。能被蛋白特异性结合的一段DNA序列称为操纵区。编码能与操纵序列结合的蛋白的基因称为基因。给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列称为终止子（terminator序列称为终止子（terminator，terminator，T） 2. 阻遏蛋白(repressive protein)：与操纵区结合后能减弱或阻止其的基因转录，其介导的方式为负(negative regulation)(negative regulation)；(negative regulation)； 激活蛋白(activating protein)：与操纵区结合后能增强或起动其的基因转录，所介导的方式为正(positive regulation)。(positive regulation)。

效应物：某些特定的物质能与蛋白结合，使蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响，这些特定物质可称为效应物（effector。有两种：诱导剂(inducer)这些特定物质可称为效应物（effector）effector）。有两种：诱导剂(inducer)和阻遏剂(inducer)和阻遏剂 和阻遏剂 3终止子至少可以分为两类：一类是不依赖ρ因子（蛋白性终止因子）的终止子和依赖ρ因子（蛋白性终止因子）

8 

的终止子 的终止子

4. 顺式作用：在结构基因的附近，只能对同一条DNA链上的基因表达起作用，这种作用在遗传学实验上称为顺式作用（cis-action， 为顺式作用（cis-action）cis-action）

能对不在一条DNA链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为反式作用（trans-action），基因就属于trans-action）反式作用元件（trans-acting element，其编码产生的蛋白称为反式因子 反式作用元件（trans-acting element）trans-acting element），其编码产生的蛋白称为反式因子 5. 5. 乳糖操纵子的表达 .6. .6. 阻遏蛋白的负

当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵子处于阻遏状态。此ｉ基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。R以四聚体形式与操纵子ｏ结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动。R的结合，阻止了基因的转录起动。R的阻遏作用不是绝对的，R的阻遏作用不是绝对的，R与ｏ偶尔解离，使细胞中还有极低水平的b－半乳糖苷酶及透过酶的生成。 当有乳糖存在时，乳糖受b －半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与R结合，使R构象变化，R四聚体解聚成单体，失去与ｏ的亲和力，与ｏ解离，基因转录开放，使b －半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵子的诱导作用。 7. 一些化学合成的乳糖类似物，不受7. 一些化学合成的乳糖类似物，不受b －半乳糖苷酶的催化分解，却也能与R特异性结合使R构象变化，诱导

操纵子的开放。例如异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiog-alactoside，(isopropylthiog-alactoside，IPTG)就是很强的诱导剂；不被细IPTG)就是很强的诱导剂；不被细lac操纵子的开放。例如异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiog-alactoside菌代谢而十分稳定。X-gal菌代谢而十分稳定。X-gal（X-gal（5-溴5-溴-4-氯-4-氯-3-吲哚-3-吲哚-吲哚-β-半乳糖苷）也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被b －半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作b －半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG－半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。 子生物学和基因工程的工作中。 8. CAP的正：细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产生能量时，cAMP8. 含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产生能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。细菌中有一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP(cAMP receptor protein)，当CRP(cAMP receptor protein)，当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的，当cAMP浓度升高时，CRP度升高时，CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为CAP(CRP-cAMP activated protein)，能以二聚protein)，能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。 序列结合。 在lac操纵子的启动子Plac上游端有一段序列与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异结合，称为CAP结合位点（CAP binding site）。CAP与这段序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。相反，当有CAP binding site）

葡萄糖可供分解利用时，cAMP葡萄糖可供分解利用时，cAMP浓度降低，CRP浓度降低，CRP不能被活化，lac操纵子的结构基因表达下降 操纵子的结构基因表达下降

由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵子转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。 去充分利用乳糖。

CAP结合位点就是一种起正性作用的操纵子，CAP则是对转录起正性作用的蛋白──激活蛋白，编码CRP的基因也是一个基因，不过它并不在lac操纵子的附近，CAP操纵子的附近，CAP可以对几个操纵子都起作用 可以对几个操纵子都起作用 9. 9. 色氨酸操纵子的表达 色氨酸操纵子的表达 ：

10. 衰减子作用

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原核基因表达转录水平的基本方式：

1通过特殊的代谢物基因的活性 通过特殊的代谢物基因的活性 ⑴ 可诱导调节方式。负：阻遏蛋白的调节 可诱导调节方式。负：阻遏蛋白的调节 正调节：激活蛋白的调节 正调节：激活蛋白的调节 正调节：激活蛋白的调节 ⑵ 可阻遏调节方式2.通过衰减方式进行调节；2.通过衰减方式进行调节；3.通过衰减方式进行调节；3.通过异化抑制作用进行调节；3.通过异化抑制作用进行调节；4.通过异化抑制作用进行调节；4.应急调节4.应急调节 应急调节 11. 真核基因表达的特点：①真核基因表达的环节更多②真核基因的转录与染色质的结构变化相关③3. ①真核基因表达的环节更多②真核基因的转录与染色质的结构变化相关③3. 真核生物基因组的非编码序列的存在与基因表达密切相关④真核基因表达以正为主

12. 真核基因的顺式元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列。其中主要是起正作用的顺式作用元件，包括启动子(promoter)、增强子(enhancer)；近年又发现起负作用的元件──沉默子

13. 增强子是一种能够提高转录效率的顺式元件。增强子的作用有以下特点：①增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离起作用，通常可距离1-4kb、个别情况下离开所的基因1-4kb、个别情况下离开所的基因30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。②增强子的作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。而将启动子倒置就不能起作用。③增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现活性④必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用 ④必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用

14. 沉默子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。 15. 以反式作用影响转录的因子可统称为5. 以反式作用影响转录的因子可统称为反式作用因子

16.翻译后的加工过程包括：1.除去起始的甲硫氨酸残基或随后几个残基；1.除去起始的甲硫氨酸残基或随后几个残基；2.除去起始的甲硫氨酸残基或随后几个残基；2.切除分泌蛋白或膜蛋白2.切除分泌蛋白或膜蛋白 切除分泌蛋白或膜蛋白 －末端的 －末端的信号肽；3.形成分子内的二硫键以固定折叠构象；4.肽链断裂或切除部分肽段；5.末端或内部某些氨基酸的修饰，3.形成分子内的二硫键以固定折叠构象；4.肽链断裂或切除部分肽段；5.末端或内部某些氨基酸的修饰，如甲基化、乙酯化、磷酸化等；6.，脂类分子（脂蛋白）或配基（复合蛋白），这种后加工过如甲基化、乙酯化、磷酸化等；6.加上糖基（糖蛋白）6.加上糖基（糖蛋白）程在基因表达的上起重要作用 程在基因表达的上起重要作用 1．“乳糖操纵子”的基本组成 1．1 结构基因群

操纵子中被的编码蛋白质的基因称为结构基因(structural gene, SG)操纵子中被的编码蛋白质的基因称为结构基因(structural gene, SG)。一个操纵子中含有(structural gene, SG)。一个操纵子中含有2个以上的结构基因，多的可达十几个，各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。 结构基因，多的可达十几个，各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。

乳糖操纵子含有 乳糖操纵子含有Z、Y和A共3个结构基因。Z个结构基因。Z基因长3510bp，编码含3510bp，编码含1170个氨基酸、分子量为135,000的多肽，以四聚体形式组成有活性的β-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)（也称异乳糖），(allolactose)（也称异乳糖），再分解为半乳糖和葡萄糖；Y再分解为半乳糖和葡萄糖；Y基因长780bp，编码有780bp，编码有260个氨基酸、分子量为30,000的半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；A中的乳糖进入细菌；A基因长825bp，编码825bp，编码275氨基酸、分子量为32,000的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。Z半乳糖的乙酰化。Z基因5＇侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点（ribosome binding site，ribosome binding site，RBS）特征的RBS）特征的Shan-Dagano(SD)序列，因而当乳糖操纵元开放时，核糖体能结合在转录产生的Shan-Dagano(SD)序列，因而当乳糖操纵元开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA上。由于Z、Y和A 3个基因头尾相接，上一个基因的翻译终止码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子（polycistron）mRNA移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上脱落下来而继续沿mRNApolycistron）

移动合成下一个基因编码的蛋白质，依次合成这个基因群所编码所有的蛋白质。 移动合成下一个基因编码的蛋白质，依次合成这个基因群所编码所有的蛋白质。 1．2 启动子

启动子(promoter启动子(promoter，(promoter，P)是指能被P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。操纵子至少有一个启动子，一般在第一个结构基因5＇侧上游，控制整个结构基因群的转录。 ＇侧上游，控制整个结构基因群的转录。

虽然不同的启动子序列有所不同，但比较已经研究过的上百种原核生物的启动子的序列，发现有一些共同的但比较已经研究过的上百种原核生物的启动子的序列，发现有一些共同的规律，它们一般长40-60bp，含40-60bp，含A-T碱基对较多，某些段落是很相似的，这些相似的保守性段落称为共有性序列(consensus sequences)。启动子一般可分为识别（R，recognition）、结合（B，binding）和起始（I，initiation）sequences)。recognition）binding）initiation）三个区段。转录起始第一个碱基（通常标记位置为+1三个区段。转录起始第一个碱基（通常标记位置为+1）最常见的是+1）最常见的是A；在-10bp；在-10bp附近有TATAAT一组共有序列，因为这段共有序列是Pribnow首先发现的，称为Pribnow盒（Pribnow 盒（Pribnow box）；在box）；在-35bp）；在-35bp处又有TTGACA一组共有序列。 列。

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不同的启动子序列不同，与不同的启动子序列不同，与RNA聚合酶的亲和力不同、启动转录的频率高低不同，聚合酶的亲和力不同、启动转录的频率高低不同，即不同的启动子起动基因启动转录的频率高低不同，即不同的启动子起动基因转录的强弱不同，例如：P转录的强弱不同，例如：PL、PR、PT7属强启动子，而Plac则是较弱的启动子。 则是较弱的启动子。 1．3 操纵基因

操纵基因（operator操纵基因（operator）是指能被蛋白特异性结合的一段operator）是指能被蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当蛋白结合在操纵基因序列上，会影响其下游基因转录的强弱。 叠，当蛋白结合在操纵基因序列上，会影响其下游基因转录的强弱。

乳糖操纵子的操纵基因（O乳糖操纵子的操纵基因（O）序列位于启动子（P）序列位于启动子（P）与被的基因之间，部分序列与启动子序列重叠。仔细分析这这操纵子序列，可见这段双链DNA具有回文（palindrome具有回文（palindrome）样的对称性一级结构，能形成十字形的茎环palindrome）样的对称性一级结构，能形成十字形的茎环（stem loop）构造。不少操纵子都具有类似的对称性序列，可能与特定蛋白质的结合相关。stem loop）构造。不少操纵子都具有类似的对称性序列，可能与特定蛋白质的结合相关。 ）构造。不少操纵子都具有类似的对称性序列，可能与特定蛋白质的结合相关。 1．4 基因

基因（regulatory gene基因（regulatory gene）是编码能与操纵序列结合的蛋白的基因。与操纵子结合后能减弱或阻止regulatory gene）是编码能与操纵序列结合的蛋白的基因。与操纵子结合后能减弱或阻止其基因转录的蛋白称为阻遏蛋白（repressive protein），其介导的方式称为负性（其基因转录的蛋白称为阻遏蛋白（repressive protein），其介导的方式称为负性（negative ），其介导的方式称为负性（negative regulation）protein）regulation）；与操纵子结合后能增强或起动其基因转录的蛋白称为激活蛋白（与操纵子结合后能增强或起动其基因转录的蛋白称为激活蛋白（activating protein），所介导的方式称为正性（positive regulation所介导的方式称为正性（positive regulation）。positive regulation）。 ）。

某些特定的物质能与蛋白结合，使蛋白的空间构像发生变化，某些特定的物质能与蛋白结合，使蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响，使蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响，这些从而改变其对基因转录的影响，这些特定物质称为效应物（effector特定物质称为效应物（effector），其中凡能引起诱导发生的分子称为诱导剂（effector），其中凡能引起诱导发生的分子称为诱导剂（inducer），其中凡能引起诱导发生的分子称为诱导剂（inducer），能导致阻遏发生的inducer），能导致阻遏发生的分子称为阻遏剂或辅助阻遏剂（corepressor分子称为阻遏剂或辅助阻遏剂（corepressor）。corepressor）。 ）。

乳糖操纵子中，基因Rlac位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的蛋白R，在环境没有乳糖存在的情况下，R，在环境没有乳糖存在的情况下，R形成分子量为152,000的活性四聚体，能特异性与操纵基因的活性四聚体，能特异性与操纵基因O紧密结合，从而阻止利用乳糖的酶类基因的转录，所以从而阻止利用乳糖的酶类基因的转录，所以R是乳糖操纵子的阻遏蛋白；当环境中有足够的乳糖时，乳糖受β-半乳糖苷酶作用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵基因特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。在这过程中乳糖（实际起作用的是别乳糖，也称异乳糖）就是诱导剂，与R结合，起到去阻遏作用（derepression结合，起到去阻遏作用（derepression），诱导了利用乳糖的酶类基因的转录。derepression），诱导了利用乳糖的酶类基因的转录。 ），诱导了利用乳糖的酶类基因的转录。

许多蛋白都是变构蛋白（allosteric protein许多蛋白都是变构蛋白（allosteric protein），通过与上述类似的方式与效应物结合改变空间构像，allosteric protein），通过与上述类似的方式与效应物结合改变空间构像，从而改变活性，起到调节基因转录表达的作用。 从而改变活性，起到调节基因转录表达的作用。 1．5 终止子

终止子（terminator终止子（terminator，terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵子中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。 最后一个基因的后面有一个终止子。

终止子按其作用是否需要蛋白因子的协助至少可以分为两类：一类是不依赖ρ因子（蛋白性终止因子）的终止子，这类终止子在序列上有一些共通的特点，即有一段富含GC的反向重复序列（inverted repeat sequence），sequence）其后跟随一段富含AT的序列（见图7-6），因而转录生成的7-6），因而转录生成的mRNA的序列中能形成发夹式结构，后继一连串U，正是RNA聚合酶转录生成的这段mRNA的结构阻止RNA聚合酶继续沿DNA移动、并使聚合酶从DNA链上脱落下来，终止转录。另一类是依赖ρ因子的终止子，即其终止转录的作用需要ρ因子的协同，或至少是受ρ因子的影响。 响。

不同的终止子的作用也有强弱之分，有的终止子几乎能完全停止转录；有的则只是部分终止转录，一部分RNA聚合酶能越过这类终止序列继续沿DNA移动并转录。如果一串结构基因群中间有这种弱终止子的存在，则前后转录产物的量会有所不同，这也是终止子调节基因群中不同基因表达产物比例的一种方式。有的蛋白因子能作这也是终止子调节基因群中不同基因表达产物比例的一种方式。有的蛋白因子能作用于终止序列，减弱或取消终止子的作用，称为抗终止作用（antitermination用于终止序列，减弱或取消终止子的作用，称为抗终止作用（antitermination），这种蛋白因子就称为抗终止antitermination），这种蛋白因子就称为抗终止因子（antiterminator因子（antiterminator）。antiterminator）。 ）。

以上5种元件是每一个操纵子必定含有的。其中启动子、操纵子位于紧邻结构基因群的上游，终止子在结构基因群之后，它们都在结构基因的附近，构基因群之后，它们都在结构基因的附近，只能对同一条它们都在结构基因的附近，只能对同一条DNA链上的基因表达起作用，这种作用在遗传学实链上的基因表达起作用，这种作用在遗传学实验上称为顺式作用（cis-actionelement）。调验上称为顺式作用（cis-action），启动子、操纵子和终止子就属于顺式作用元件（cis-action），启动子、操纵子和终止子就属于顺式作用元件（cis-acting ），启动子、操纵子和终止子就属于顺式作用元件（cis-acting element）。基因可以在结构基因群附近、也可以远离结构基因，控基因可以在结构基因群附近、也可以远离结构基因，它是通过其基因产物──蛋白来发挥作用的，也可以远离结构基因，它是通过其基因产物──蛋白来发挥作用的，因而调它是通过其基因产物──蛋白来发挥作用的，因而基因不仅能对同一条DNA链上的结构基因起表达作用，而且能对不在一条DNA链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为反式作用（trans-actionelement），其编遗传学实验上称为反式作用（trans-action），基因就属于反式作用元件（trans-action），基因就属于反式作用元件（trans-acting ），基因就属于反式作用元件（trans-acting element），其编码产生的蛋白称为反式因子（trans-acting factor码产生的蛋白称为反式因子（trans-acting factor）。由此也可窥测到基因表达机理的关键在蛋trans-acting factor）。由此也可窥测到基因表达机理的关键在蛋白质与核酸的相互作用上。 白质与核酸的相互作用上。

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2．乳糖操纵子的表达 ．乳糖操纵子的表达 2．1 阻遏蛋白的负性1 阻遏蛋白的负性 阻遏蛋白的负性

当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵子处于阻遏状态。此R基因在其自身的启动子PR控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。R个分子的阻遏蛋白。R以四聚体形式与操纵子O结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动。R的结合，阻止了基因的转录起动。R的阻遏作用不是绝对的，R的阻遏作用不是绝对的，R与O偶尔解离，使细胞中还有极低水平的β－半乳糖苷酶及透过酶的生成。 －半乳糖苷酶及透过酶的生成。

当有乳糖存在时，乳糖受β－半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与R结合，使R构象变化，R构象变化，R四聚体解聚成单体，失去与O的亲和力，与O解离，基因转录开始，使β－半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵子的诱导作用。 操纵子的诱导作用。 2．2 CAP的正性 的正性

细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解释放能量时，cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解释放能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。细菌中有一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP（CRP（cAMP receptor protein），当cAMP receptor protein），当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的，当cAMP浓度升高时，CRP浓度升高时，CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为CAP（CAP（CRP-cAMP activated protein），能以二聚体的方式与CRP-cAMP activated protein），能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。 序列结合。

在lac操纵子的启动子Plac上游端有一段序列与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异结合，称为CAP结合位点（CAP binding site点（CAP binding site）。CAP binding site）。CAP）。CAP与这段序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。相反，当有葡萄糖可供分解利用时，cAMP当有葡萄糖可供分解利用时，cAMP浓度降低，CRP浓度降低，CRP不能被活化，lac不能被活化，lac操纵子的结构基因表达下降。 操纵子的结构基因表达下降。

lac

由于P是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵子转录开始，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这种机制，细菌优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。 才去充分利用乳糖。

不难看出，CAP不难看出，CAP结合位点就是一种起正性作用的操纵基因，CAP结合位点就是一种起正性作用的操纵基因，CAP则是对转录起正性作用的蛋白──激活蛋白，编码CRP的基因也是一个基因，不过它并不在lac操纵子的附近，CAP操纵子的附近，CAP可以对几个操纵子都起作用。 用。

分子生物学技术

1.核酸分子杂交 (nucleic acid ybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 之间形成杂化双链(heteroduplex) 。(heteroduplex) 。

2.Blotting即“印渍”指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质，并加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、DNA、RNA、和蛋白质的检测RNA、和蛋白质的检测 、和蛋白质的检测

印渍技术的类别及应用: DNA印迹技术 Southern blottingRNA印迹技术 Southern blottingRNA印迹技术 Northern blotting印迹技术 Northern blotting蛋白质印迹技术 Western 印迹技术 Western blotting 斑点印迹blotting 斑点印迹 Dot 斑点印迹 Dot blotting原位杂交 in 原位杂交 in situ hybridization DNA点阵 DNA array 点阵 DNA array DNA芯片技术 DNA chip 芯片技术 DNA chip

（1.）DNA印迹技术Southern blotting

又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。 如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 物分析等方面有重要价值。

将DNA标本用性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。 片段的位置和大小。

（2.）RNA印渍技术Northern blotting又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到纤维素膜上的方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。 同组织和细胞的同一基因的表达情况。

（3.）蛋白质印渍技术Western blotting又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检

测转移到纤维素膜上的特异性蛋白质。应用：测转移到纤维素膜上的特异性蛋白质。应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。 定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。

（4）斑点印迹 Dot blotting斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。 这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。 应用：1应用：1）混合样品DNA鉴定2）基因缺失检测3）基因表达分析 ）基因表达分析 （5）原位杂交 in situ hybridization即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当

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处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。 的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。

3.probe将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为“探针”然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。 探针长度一般以50~300bp为宜。 制备方法：1）利用DNA重组技术 2重组技术 2） 2）PCR扩增 3扩增 3）化学合成 3）化学合成 ）化学合成 探针的分类：

据制备方法及核酸性质不同，可分为：（1）基因组DNA探针（2探针（2）cDNA探针（3探针（3）RNA探针（4探针（4）寡核苷酸探针 ）寡核苷酸探针 合成寡核苷酸探针注意原则：1）长度（10-50 ）长度（10-50 bp); 2) G:C对含量40%-60%；40%-60%；3）探针内避免互补；4）探针内避免互补；4）避免同一碱基连续出现；5碱基连续出现；5）与非靶序列有70%以上同源性或连续70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。 个以上碱基序列相同，最好不用。 核酸探针的标记 同位素： 32P同位素： 32P、 32P、35S、35S、3H、3H、125I等标记探针非同位素：生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 等标记探针非同位素：生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。 后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。

一个理想的标记物：1）标记前后探针的基本结构、化学性质相同;2）标记前后探针的基本结构、化学性质相同;2）特异性强、本底低、重复性好；;2）特异性强、本底低、重复性好； ）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时；4）操作简单、节时；4）安全、无环境污染。 ）安全、无环境污染。

探针的标记方法:1）缺口平移法2）随机引物标记法3）末端标记法4）生物素光照标记法 A.缺口平移法的原理1将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的DNA polymerase I 的5`→5`→3`的聚合酶活性和3`的聚合酶活性和5` →5` →3`的外切酶活性相结合。3`的外切酶活性相结合。2 的外切酶活性相结合。2 首先用2 首先用DNAase I 在探针DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNA pol I的5`→5`→3`外切酶活性，切去带有3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 3的互补核苷酸补入缺口。 3这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，3`方向移动，DNA方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。 探针。 B.随机引物标记法原理用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`- OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。 补缺口，合成新的标记的探针片段。

C.末端标记法原理1）一种是在5`末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（5`末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP）去掉AP）去掉dsDNA 5`-磷酸，再用dsDNA 5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP转移加到DNA片段5`-OH上。2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的 3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP。ddUTP。D.生物素光照标记法光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的DNA探针。 探针。 4． 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR） PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，

特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA合成技术。PCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。 通过变性-延伸-延伸-复性的循环操作，

理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍，从而大大提高对其进行分析研究的速度。 倍，从而大大提高对其进行分析研究的速度。 原 理

1) 合成待扩增区域两端已知序列，与模板1) 合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度； 互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度； 2) 反应体系：2) 反应体系：DNA反应体系：DNA模板，dNTP模板，dNTP，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer 聚合酶，buffer 3) 反应程序：3) 反应程序： 反应程序： 变性 变性 ( 94~95oC) 变性 ( 94~95oC) 复性 复性 复性 延伸 延伸 延伸

( 37~55 oC) ( 70~72 oC ) 72 oC延伸10min 30-35cycles DNA扩增100万倍 万倍 PCR体系基本组成成分模板DNA 特异性引物DNA 特异性引物 特异性引物 耐热 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ 聚合酶 dNTPs Mg2+ 引物设计原则1）引物的特异性 ）引物的特异性 2）避开产物的二级结构区 ）避开产物的二级结构区 3）长度 ）长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为15~30bp，一般为20~27mer。20~27mer。 4）G+C含量 含量 一般为 一般为40%~60%。40%~60%。Tm=4（Tm=4（G+C）G+C）+2（+2（A+T）A+T）5）碱基础随机分布：3）碱基础随机分布：3′端不应超过3个连续的G或C 6）引物自身 6）引物自身 7）引物自身 7）引物之间 7）引物之间 8）引物之间 8）引物的 8）引物的3′端：不可以修饰 ′端：不可以修饰 9）引物的 9）引物的5′端：可以被修饰，包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛。 10包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛。 10）密码子的简并 10）密码子的简并 ）密码子的简并

PCR的主要用途（一）目的基因的克隆PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：11DNA与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA 获得已知目的基因片段；2利用特异性主要采用的方法有：mRNA 获得已知目的基因片段；2获得已知目的基因片段；引物以cDNA或基因组为模板，获得已知的目的基因；3cDNA文库或基因组文库中获得具有为模板，获得已知的目的基因；3利用简并引物从同源性的DNA片段；4片段；4利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。 文库或基因组文库中随机获得目的基因。

（二）基因的体外突变采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。 采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。

（三）DNA和RNA的微量分析由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量DNA和RNA的分析检测。 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 PCR特点及应用：优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速；（2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。应用：（1）基因组DNA分析；（2）遗传物质的鉴定；（3）遗传病的诊断。缺点：（1）需靶DNA序列的信息； 序列的信息； （2）产物短小，DNA产物短小，DNA复制不精确。 复制不精确。

几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）反向PCR（三）PCR（四）原位PCR（三）RAPD （三）RAPD PCR（四）原位PCR技术（五）实时PCR技术 技术

单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）

n 是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移

率不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。 中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。

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n 通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。 技术。

n 在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝

胶中电泳（中性胶），突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。 构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。

差异展示反转录PCR (differential display reverse transcriptase PCR ，DDRT-PCR) Liang P. (1992)建立此法，用来分离变异细胞中的特异Liang P. (1992)建立此法，用来分离变异细胞中的特异RNA，它可用来由少量RNA，它可用来由少量mRNA产生cDNA,以鉴别细胞cDNA,以鉴别细胞间的表达差异。 间的表达差异。

DDRT-PCR的关键是采用经修饰的寡聚dT引物用于反转录，即polyA+mRNA 在引物的polyA+mRNA 在引物的3`端的双核苷酸的差异3`端的双核苷酸的差异退火 退火 。

5．化学裂解法(Maxam-Gilbert法)

基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。 链的序列。

DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 顺序。

6．基因文库 (gene library) 是指一个包含了某一生物体全部 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 文库 (cDNA library) 筛选cDNA文库

一. 合成寡核苷酸探针； 由于密码子的兼并性我们无法确定一个肽链的cDNA序列，但我们可采取以下策略：1.但我们可采取以下策略：1.兼并寡核苷酸探针； 设计一组涵盖可编码一段给定氨基酸序列所有可能的DNA探针，一般使用最短长度(14~17 Nt) 一般使用最短长度(14~17 2.用每个氨基酸最常用的密码子合成单一的较长的2.用每个氨基酸最常用的密码子合成单一的较长的DNA探针(40~60Nt),探针(40~60Nt),不使用(40~60Nt),不使用CpG,因它出现得少。此探针虽不CpG,因它出现得少。此探针虽不会和cDNA完全配对，但在非严格条件下可杂交，并足以检出靶DNA。DNA。 二. 抗体探针：用标记的抗体探针和印有细菌裂解碎片的纤维膜杂交。关键是抗体的质量，用标记的抗体探针和印有细菌裂解碎片的纤维膜杂交。关键是抗体的质量，它必须能识别结合变关键是抗体的质量，它必须能识别结合变性蛋白(性蛋白(即能在Western印迹上产生强信号) 印迹上产生强信号) 三.扣除探针(subtracted cDNA probe)抑制扣除杂交(suppression subtraction hybridization ,DDH) Siebert P.等于P.等于1992年建立的，此法作为一种克隆差异表达基因转录的方法。先启动过量的驱动cDNA序列和2个标准的待测cDNA池快速反复结合，随着驱动-池快速反复结合，随着驱动-待测杂交反应，混合2个待测池 个待测池

7．克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆(functional cloning)（二）定位克隆(positional cloning)（三）功能性克隆(functional 定位克隆(positional 非定位候选基因克隆策略(position-independent candidate gene approaches)非定位候选基因克隆策略(position-independent candidate gene approaches)（四）定位候选基因克隆策略(position-independent candidate gene approaches)（四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches )

（一）功能性克隆定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。 应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。 克隆方式 ① 利用特异性抗体筛选表达型 ② 根据 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库； 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。 文库。 （二）定位克隆定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围最后克隆该基因。系统定位克隆工作 ① 遗传学分析(易位等)传学分析(确定致病基因染色体定位) 确定致病基因染色体定位) 交换分析、) 交换分析、连锁不平衡分析② 连锁不平衡分析② 分子生物学分析染色体异常(分子生物学分析染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆

（三）非定位候选基因克隆策略由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。 根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。 （四）定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。 列数据，鉴定出候选致病基因。

8．转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 发育成个体。

核转移(clone)。技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 即克隆(clone)基因剔除技术也称基因靶向(gene targeting)也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。 灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。

9．基因芯片(gene chip)DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip)

是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。 蛋白质芯片(protein chip)是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。 10．蛋白质之间相互作用研究的重要性蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。 谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。 常用蛋白质相互作用的研究技术酵母双杂交 酵母双杂交 各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） 各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） 各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 应分析

噬菌体显示系统筛选等等 噬菌体显示系统筛选等等 酵母双杂交系统的应用（一）分析已知蛋白之间的相互作用（二）对蛋白质功能域的分析（三）分析未知蛋白相互作用（四）绘制蛋白质相互作用系统图谱（五）在药物设计中的应用

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荧光共振能量转移（FRET）是比较分子间距离与分子直径的有效工具。FRET是比较分子间距离与分子直径的有效工具。FRET对距离和荧光基团的空间取向有高度敏感性，可以通过荧光能量转移效率的测量，观察生物分子间相互作用的改变情况，可以通过荧光能量转移效率的测量，观察生物分子间相互作用的改变情况，研究各种涉及分子间距离观察生物分子间相互作用的改变情况，研究各种涉及分子间距离变化的生物现象，在蛋白质FRET发生的基本条件是：供体D和受体A的距离必须达到一定的数量级（1~10 nm；受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱相重叠；的距离必须达到一定的数量级（1~10 nm）1~10 nm）供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似平行。 供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似平行。

噬菌体展示酵母双杂交适合于鉴别蛋白之间的相互作用，但很多重要分子间相互作用是发生在蛋白质(如细胞表面受体)面受体)和和一种扩散性小分子(和和一种扩散性小分子(如配基)如配基)之间,之间,酵母双杂交显得为力，对这一类受体蛋白cDNA文库的筛选George Smith等发展了一种方法，用M13来表达噬菌体衣壳融合蛋白,来表达噬菌体衣壳融合蛋白,这种蛋白可以共价连接的方式附着在塑料盘子的底部。由于融合蛋白是在噬菌体的外侧表达的，是否能结合到塑料盘子上就可将噬菌体分开。 方法：(1)将随机的多肽(1)将随机的多肽DNA弹夹(random 弹夹(random peptide (random peptide DNA peptide DNA cassette)插入到基因cassette)插入到基因III的编码序列中，使在噬菌体颗粒的表面出现各种不同的蛋白质和多肽，此即是通常所说的多肽文库。(2)粒的表面出现各种不同的蛋白质和多肽，此即是通常所说的多肽文库。(2)然后通过免疫吸附或亲和层析分离出(2)然后通过免疫吸附或亲和层析分离出特定的目标噬菌体。(3)特定的目标噬菌体。(3)扩增阳性噬菌体。(3)扩增阳性噬菌体。(4)扩增阳性噬菌体。(4)用(4)用ELISAs 进行分析鉴定。ELISAs 进行分析鉴定。 进行分析鉴定。 11．报道基因(Reporter genes)通过检测mRNA转录本的水平或蛋白质的水平来了解基因的表达情况总是不方便的。如通过检测大量的缺失和点突变及转染细胞来鉴别基因的顺序就更不方便。利用报道基因可较容易地达如通过检测大量的缺失和点突变及转染细胞来鉴别基因的顺序就更不方便。利用报道基因可较容易地达到此目的。报道基因能用来鉴定细胞，组织或顺式元件的短暂作用，或它对外来刺激(如激素)如激素)的反应。 的反应。 报道基因的条件：1.报道告基因编码的蛋白活性不能和靶细胞中已存在的某种蛋白相似。如报道基因编码一种酶，1.报道告基因编码的蛋白活性不能和靶细胞中已存在的某种蛋白相似。

它可通过底物修饰的方法来测定。那么靶细胞中必须没有这种底物修饰活性。 2.所编码的酶的活性测定应快速， 2.所编码的酶的活性测定应快速，简便，灵敏，特异，且重复性好。 简便，灵敏，特异，且重复性好。

3. 报道蛋白的功能不会干扰细胞的正常活性，如信号转递，代谢速率等。3. 报道蛋白的功能不会干扰细胞的正常活性，如信号转递，代谢速率等。 报道蛋白的功能不会干扰细胞的正常活性，如信号转递，代谢速率等。 (一)体外报道基因分析的方法

(1)氯霉素乙酰转移酶 (CAT)此是细菌的酶，它催化乙酰基从乙酰辅酶A上转移到氯霉素上，使氯霉素被乙酰化而失活，籍此来保护细菌。而失活，籍此来保护细菌。几乎所有的真核细胞中都没有相似的酶的活性。籍此来保护细菌。几乎所有的真核细胞中都没有相似的酶的活性。从转染细胞的提取物中用几乎所有的真核细胞中都没有相似的酶的活性。从转染细胞的提取物中用14C标记的氯霉素温育转染细胞的提取物和薄层层析可以很容易地分析CAT的活性。 的活性。 但本法用同位素价格昂贵， 但本法用同位素价格昂贵，CAT但本法用同位素价格昂贵，CAT的稳定性也不理想。 定性也不理想。

(2) 荧光素酶(Luciferase, 基因来自荧火虫(Photinus pyralia), Luc的底物是荧光素，催化反应需luc)luc基因来自荧火虫(ATP，ATP，Mg2+。用一种特殊的设计的发光计可量度荧光素经Mg2+。用一种特殊的设计的发光计可量度荧光素经ATP－依赖性ATP－依赖性Luc催化发出的荧光。还有另一种luc基因来自海肾(sea pansy),这两种荧光素酶的底物特异性是完全不同的。可用来和荧火虫的因来自海肾(sea pansy),这两种荧光素酶的底物特异性是完全不同的。可用来和荧火虫的luc基因重组，用来检测DNA转染效率。

(3)b-葡糖醛酸酶 (b-glucuronidase,GUS)GUS是一种细菌的酶，在植物和哺乳动物细胞中都可用作报道基因，但因大多数植物缺乏内源性葡糖醛酸酶，故更适合用GUS。它不会影响高等植物的生长发育。GUS。它不会影响高等植物的生长发育。

GUS的优点之一是有多种分析方法：①用X－gluc为底物对表达GUS或性的细胞和组织进行组织化学染色。②用4－MUG(4-甲基荧光素－MUG(4-甲基荧光素－ 甲基荧光素－ b－D－半乳糖苷)－半乳糖苷)作底物进行GUS荧光分析，此法较灵敏。③以金刚烷基1,2-二氧杂环1,2-二氧杂环芳香基葡糖醛酸为底物可进行GUS化学发光分析。 化学发光分析。

(4)分泌型碱性磷酸酶(SEAP)SEAP编码人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)编码人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的一个截短的形式，(PLAP)的一个截短的形式，它缺乏锚顺序，因此可从被的一个截短的形式，它缺乏锚顺序，因此可从被转染的细胞中分泌出来，故可用少量的培养液进行分析。培养液中检测到的SEAP的活性水平和细胞内SEAPmRNA及其蛋白质的浓度变化成正比。 SEPA及其蛋白质的浓度变化成正比。 SEPA具有极大的热稳定性和对磷酸酶抑制剂(L-具有极大的热稳定性和对磷酸酶抑制剂(L-同型精氨酸(L-同型精氨酸)同型精氨酸)有抗性，因此可用65℃预处理样品或加抑制剂共温育来除去内源性碱性磷酸酶活性。65℃预处理样品或加抑制剂共温育来除去内源性碱性磷酸酶活性。 ℃预处理样品或加抑制剂共温育来除去内源性碱性磷酸酶活性。 SEAP的检测：①以对硝基苯磷酸为底物进行比色分析；此法快速,①以对硝基苯磷酸为底物进行比色分析；此法快速,简便,简便,价廉,价廉,但灵敏度差，动力学线性范围窄；②以D-荧光素D-荧光素-O-荧光素-O-磷酸盐的水解为基础的-O-磷酸盐的水解为基础的SEAP两步分析法可提高灵敏度；③用化学发光的碱性磷酸酶低物(两步分析法可提高灵敏度；③用化学发光的碱性磷酸酶低物(如1,2-二氧杂环丁烷，1,2-二氧杂环丁烷，CSPD)二氧杂环丁烷，CSPD)进行分析最灵敏。CSPD)进行分析最灵敏。CSPD进行分析最灵敏。CSPD的去磷酸化产生一种持续的“ 增长”型荧光，可持续60分钟之久，易于用发光计或闪烁计数仪检测。 钟之久，易于用发光计或闪烁计数仪检测。

SEAP的优点：①不需制备细胞裂解物；②通过反复收集同一培养细胞的培养液很容易进行基因表达的动力学研究；③被转染细胞在检测SEAP时不受影响，并保持完好，以备进一步研究用；④培养液中几乎没有由内源性碱性磷酸酶活性产生的背景⑤样品的收集和分析能在96孔微量滴定板上自动进行。 孔微量滴定板上自动进行。

(5)人类生长激素(hGH)hGH由垂体前叶的促生长细胞分泌，其表达范围的局限性适合作为大多数哺乳动物的报道基因，其优点同SEAP，但灵敏度低，并需用同位素，所以SEAP，但灵敏度低，并需用同位素，所以hGH的测定常作为内部对照，以校正转染效率。 的测定常作为内部对照，以校正转染效率。 (6) ß-半乳糖苷酶这种细菌酶的活性可在细胞提取物中用分光光度计来检测，也可用细胞组织化学的方法来量度。它可使X-gal裂解，产生兰色的产物，易于鉴别。可用邻硝基苯- 裂解，产生兰色的产物，易于鉴别。可用邻硝基苯- ß- ß-D半乳吡喃糖苷(ONPG)半乳吡喃糖苷(ONPG)进行比色分析；(ONPG)进行比色分析；也可用4－MUG(4-甲基荧光素应用有限。用发光的1,2-MUG(4-甲基荧光素- 甲基荧光素- --D-半乳糖苷)半乳糖苷)进行荧光分析,进行荧光分析,但这两种方法灵敏度低，b--D-半乳糖苷

二氧杂环丁烷为底物可增加灵敏度和扩大检测的线性范围。 二氧杂环丁烷为底物可增加灵敏度和扩大检测的线性范围。 (二)体内报道基因分析方法

(1)绿色荧光蛋白(GFP)有几种生物发光水母是由于能量转移到GFP上所至。来源于维多利亚水母(Aequorea Ca2+激活的光蛋白水母素(aequorin)激活的光蛋白水母素(aequorin)的能量后可在体内产生荧光。(aequorin)的能量后可在体内产生荧光。此过程不需要底物的能量后可在体内产生荧光。此过程不需要底物victoria)的GFP在接受了Ca2+激活的光蛋白水母素

或辅助因子,或辅助因子,而是通过两个蛋白之间的能量转移进行的。 GFP而是通过两个蛋白之间的能量转移进行的。 GFP发生荧光不需要水母中的其它基因产物，并无种属特异性。体内表达的GFP和纯化的GFP有相似的发光谱，可吸收兰光,有相似的发光谱，可吸收兰光,激发绿光，可用荧光显微镜，紫外光箱，荧光激活细胞分选仪(FACS)荧光激活细胞分选仪(FACS)来检测。(FACS)来检测。GFP来检测。GFP能监测转录变化的具体时间。(2)萤火虫荧光素酶(Luc) 应用可穿过质膜的可溶性荧光素酶底物－不带电荷的荧光素酯类。这种底物很溶易穿过酯双层膜，膜的可溶性荧光素酶底物－不带电荷的荧光素酯类。这种底物很溶易穿过酯双层膜，一旦进入细胞即被内源性的酯酶转变成萤火虫荧光素，成为Luc的底物。(3) ß-半乳糖苷酶：在活细胞中可用荧光素二- ：在活细胞中可用荧光素二- ß- ß-D半乳吡喃糖苷(FDG)进行。FDG在低渗条件下加入而进入活细胞内，被ß-半乳糖苷酶切割后因反应产物的疏水结构而被“ 困”(FDG)进行。

在细胞内。通过底物代谢物的荧光成分发出的荧光而被检测。 在细胞内。通过底物代谢物的荧光成分发出的荧光而被检测。 12．包载载体(entrapment vectors)1vectors)1报道基因被广泛用于分析克隆的调节元件，还可用于分析未知内源基因的

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表达模式。包载载体是含有报道基因的结构，它整合于基因组的随机位点，通过报道基因产生的表达模式，对附近的顺式调节元件作出反应。包载载体有3类，用于果蝇的P因子载体，植物的Ac-Ds因子和小鼠的转基因 因子和小鼠的转基因 13．定点突变(site-directed mutagenesis 运用运用cDNA技术在基因组的一个oror site-specific mutagenesis )预定位点产生点突变（point mutaion）。方法是逐步合成一条基因组核酸链，使其中特定位点上一个天然存在的预定位点产生点突变（point mutaion）碱基被另一碱基取代（如鸟嘌呤取代腺嘌呤），纯化后，经过体外复制使在互补链对应位点产生对应碱基置换。1.寡核苷酸引物诱导突变(1)正链的合成：(1)正链的合成：按体外重组技术，将突变的目的基因插入M13单链模板上。(2)单链模板上。(2)合成突(2)合成突变引物(3)变引物(3)制备异源双链：用(3)制备异源双链：用Kleanow酶，和T4连接酶在体外合成异源双链；(4)连接酶在体外合成异源双链；(4)富集异源双链；用(4)富集异源双链；用SI酶或蔗糖梯度离心去除开环产物(梯度离心去除开环产物(有很高的转化本底)有很高的转化本底)。(5)转化(5)转化E.coli进行扩增；(6)进行扩增；(6)筛选突变体：用标记探针和噬菌斑(6)筛选突变体：用标记探针和噬菌斑杂交2.Kunkel 定点诱变法由Kunkel,T.A.1985年建立(1)(RF)转化入年建立(1)将已插入目的(1)将已插入目的DNA的M13 (RF)转化入 E.coli(dut-ung-)进行复制,进行复制,子链中掺入了U；(2)与突变引物退火(2)与突变引物退火:与突变引物退火:取正链M13与突变引物退火;(3)与突变引物退火;(3)制备异源双链：用;(3)制备异源双链：用Kleanow酶，和T4连接酶在体外合成异源双链； 连接酶在体外合成异源双链； (4)将异源双链转化入野生型尿嘧啶糖苷酶(Ung)仅含突变DNA的模板可得到扩增。(4)将异源双链转化入野生型E.coli中，尿嘧啶糖苷酶(Ung)降解含(Ung)降解含U的模板，3.硫代磷酸诱变法已知有一些核酸内切(已知有一些核酸内切(BanII,HindII,PstI,NciI等)不能切割硫代磷酸DNA分子。此方法的步骤是：(1)pol合成新链。如骤是：(1)将突变的寡核苷酸引物与(1)将突变的寡核苷酸引物与M13重组体退火；(2)重组体退火；(2)在具有硫代磷酸的条件下，加入(2)在具有硫代磷酸的条件下，加入DNA 此产生的异源双链分子中，突变体链是硫代磷酸化的DNA;(3)经连接酶封口后DNA;(3)经连接酶封口后,经连接酶封口后,用NciI消化异源双链。那么被切割的将是非硫代磷酸化的亲本链。4.PCR诱变法以上方法的缺点是突变位点仅限于靶DNA的5’端，而我们也希望在中心部位进行诱变。欲达此目的可用望在中心部位进行诱变。欲达此目的可用PCR法。因PCR产生的单个错配碱基经扩增会掺入到模板序列中，最终产生的单个错配碱基经扩增会掺入到模板序列中，最终产生突变体的双链。后 Higuchi,R产生突变体的双链。后 Higuchi,R等又建立了重组PCR，此法可在PCR，此法可在 ，此法可在 DNA序列的任何部位产生突变位点。 序列的任何部位产生突变位点。 5.大引物诱变法重组PCR诱变法需4种引物，三轮扩增，步骤繁琐。于是后人又提出大引物诱变法。PCR种引物，三轮扩增，步骤繁琐。于是后人又提出大引物诱变法。PCR法的缺点是： (1)点是： (1)扩增的产物常需要连接到载体上，然后才能对突变的基因进行表达，研究。 (1)扩增的产物常需要连接到载体上，然后才能对突变的基因进行表达，研究。 (2)DNA扩增的产物常需要连接到载体上，然后才能对突变的基因进行表达，研究。 (2)DNA的保真度低，产物需要经测序。 物需要经测序。 录后加工： 在转录中新合成的RNA往往是较大的前体分子，需要经过进一步的加工修饰，才转变为具有生物学活性的、成熟的RNA分子，这一过程称为转录后加工。主要包括剪接、剪切和化学修饰。 如真核细胞mRNA的加工主要包括：（1）hnRNA被剪接（splicing），除去由内含子转录来的序列，将外显子的转录序列连接起来。（2）在3′末端连接上一段约有20～200个腺苷酸的多聚腺苷酸（poly A）的“尾巴”结构。不同mRNA的长度有很大差异。（3）在5′末端连接上一个“帽子”结构m7GpppmNp。（4）在内部少数腺苷酸的腺嘌呤6位氨基发生甲基化（m6A）。 对于大多数蛋白质来说多肽链翻译后还要进行下列不同方式的加工修饰才具有生理功能。 1.氨基端和羧基端的修饰：在原核生物中几乎所有蛋白质都是从N-甲酰蛋氨酸开始，真核生物从蛋氨酸开始。甲酰基经酶水介而除去，蛋氨酸或者氨基端的一些氨基酸残基常由氨肽酶催化而水介除去。包括除去信号肽序列。因此，成熟的蛋白质分子N-端没有甲酰基，或没有蛋氨酸。同时，某些蛋白质分子氨基端要进行乙酰化在羧基端也要进行修饰。 端也要进行修饰。 2.共价修饰：许多的蛋白质可以进行不同的类型化学基团的共价修饰，修饰后可以表现为激活状态，也可以表现为失活状态。主要有磷酸化，糖基化，羟基化，二硫键的形成和亚基的聚合等等 二、真核生物 二、真核生物 （一）核糖体RNA：基因拷贝数多，在几十到几千之间。基因成簇排列在一起，由RNA聚合酶I转录生成一个较长的前体，哺乳动物为45S。核仁是其转录、加工和装配成核糖体的场所。RNA酶III等核酸内切酶在加工中起重要作用。5SRNA基因也是成簇排列的，由RNA聚合酶III转录，经加工参与构成大亚基。核糖体RNA可被甲基化，主要在核苷2’羟基，比原核生物甲基化程度高。多数核糖体RNA没有内含子，有些有内含子但不转2’-O-甲基核录。（二）转运RNA：由RNA聚合酶III转录，加工与原核相似，但3’端的CCA都是后加的，还有2’-O-糖。 糖。 三、RNA的拼接（一）转运RNA的拼接：由酶催化，酶识别共同的二级结构，而不是序列。通常内含子插入到靠近反密码子处，与反密码子配对，取代反密码子环。第一步由内切酶切除插入序列，不需ATP；第二步由RNA连接酶连接，需要ATP。（二）四膜虫核糖体RNA的拼接：某些四膜虫26S核糖体RNA基因中有一个内含子，其拼接只需一价和二价阳离子及鸟苷酸或鸟苷存在即可自发进行。其实质是磷酸酯的转移反应，其拼接只需一价和二价阳离子及鸟苷酸或鸟苷存在即可自发进行。其实质是磷酸酯的转移反应，鸟苷酸起其实质是磷酸酯的转移反应，鸟苷酸起辅助因子的作用，提供游离3’羟基。（三）信使RNA：真核生物编码蛋白质的核基因的内含子属于第二类内含子，5’,2’-磷酸二酯键，构成套索结构。然后左端为GT，右端为AG。先在左端切开，产生的5’末端与3’端上游形成5’,2’-内含子右端切开，两个外显子连接起来。通过不同的拼接方式，可形成不同的信使RNA。 基因转录产生的mRNA分子中，由于核苷酸的缺失，插入或置换，基因转录物的序列不与基因编码序列互补，使翻译生成的蛋白质的氨基酸组成，不同于基因序列中的编码信息，使翻译生成的蛋白质的氨基酸组成，不同于基因序列中的编码信息，这种现象称为不同于基因序列中的编码信息，这种现象称为RNA编辑。RNA编辑同基因的选择剪接或可变剪接(alternative splicing)一样，使得一个基因序列有可能产生几种不同的蛋白质，这可能是生使得一个基因序列有可能产生几种不同的蛋白质，这可能是生物在长期进化过程中形成的、更经济有效地扩展原有遗传信息的机制。 物在长期进化过程中形成的、更经济有效地扩展原有遗传信息的机制。 将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，(post-transcriptional gene silencing, gene silencing, PTGS)silencing, PTGS)被称为RNA干扰导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene （RNAi）。一、RNAi的分子机制 的分子机制 16 通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。 个碱基突出。 siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物 在RNAi效应阶段，（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。 酶。 另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默 17