４８８耋煞蓬堂兰壁塑笙篁垫鲞笙兰塑叁璺塾尘坠！查鲤｛竺翼堕！竺！：塑：基壁：苎！垒！：兰塑竺肝豆状核变性基因诊断技术的研究进展杜益刚程楠胡纪源［关键词］肝豆状核变性；港阂诊断；技术进展ｄｏｉ：１０．３９６９６．ｉｓｓｎ。１０００－０３９９．２００９。０４。０６３肝豆状核蹙性又称Ｗｉｌｓｏｎ病（Ｗｉｌｓｏｎ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ，ｗｎ），是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病，发瘸率为１１３００００。１／１０００００。ＷＤ为嚣酶少数可以治疗的神经遗传瘸之一，患者如聚能在发病旱赣或症状前期鄣被确诊并褥鲻及时治疗，大多预鑫良好，反之。病情逐渐加燕甚至危及生钳‘１。虽然典型的ＷＤ患者根据特征性临床表现及窳验窜铜代谢梭查等不难诊断，但许多患者昂期症状复杂多样，极易被误诊为其他疾病［２１，铜代谢检查又存在假阴性或缓粥往结暴１３１，因茂，本癍的警袭诊断特别嫠症状蘸麓程产翁诊断较为困难。长期以来，国内外众多学者一直探索采用各种蕊因诊断技术对ＷＤ患者进行症状前期及产前诊黪删。现将已应用予ＷＤ的务种基因诊断技术综述如下。｛建ＦＬＰ怨下Ｆ瞒ＮＰ一家系连镪分耩这些方法的共同原理是将ＷＤ家系成员与先证者的ＤＮＡ遗传标记进行连锁分析，通过分析其基因型进行基闪诊断。在ＷＤ基因被克隆之前，Ｆｉｇｕｓ等栩于１９８９年即采用性片段长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）一家系连锬分耩方法对ＷＤ家系成员及先证者进行产前诊断和杂合子的检出。隧内炭志英、王丽娟等１６，７１则对位于ＷＤ基因内部及其侧翼区的Ｄ１３Ｓ３０１、Ｄ１３Ｓ３１６、Ｄ１３Ｓ１３３和Ｄ１３Ｓ３１４等短串联重复序列（ｓｈｏｒｔｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ。ＳＴＲ）进行连锬分榜，涯实了该方法的可行性。傻这些方法所用酶ＤＮＡ遗传标记麓ＷＤ基因距离较远。重组率蒜，置必须与同一家系的先证者进行比较，因此，不能对无ＷＤ家族史或家系中先证者融死亡的可疑ＷＤ患者进行诊断，在ＷＤ基因克隆艨已较少虚用。２００７年，Ｇｕｐｔａ等１８１选择了４个ＷＤ基因的单核苷酸多态往（ｓｉｎｇｌｅ—ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）位点对印度人ＷＤ家系进行榆测。在２８例家系成员中有２５例患者与上述４个ＳＮＰ位点的单倍体型有相关投，其阳性率接近９０％。这为ＷＤ的基因梭测提供了一条掰酶思路：雩＃为第３我分子遗传标记＋ＳＮＰ其有遗赞稳定、覆组率低等优点，如果将其与ＲＬＦＰ及其他方法结合起来，可大大提高ＷＤ基因诊断效率１９１。２ＰＣＲ—焉；ＳＣｐ分析聚会酶链爱瘟一荸链擒象多态毪（ｐｅｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ—ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＰＣＲ—ｓｓｃＤ分析技术最早由Ｏｒｉｔａ等１１０ｌ撤道．其原理是双链ＤＮＡ经变性后其两条互补单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率随其构象改变而发生成变，麸瑟呈现苓鲻静带型。ＳＳＣＰ鹩灵敏疫较离，在合适条捧爹最小爵以检出一个碱基的差异，故研带于单个碱蕊缺失、插入或鼹换的作者单位：２３００６１合肥安徽中医学院神经病学研究所附麟医院万方数据检测。１９９５年，Ｔｈｏｍａｓ等…ｌ首先采用该技术并结合ＤＮＡ测序方法对５８例欧溯裔ＷＤ患者各外显子避行检测，共发现了２５耪突变，其审２０种为薪酶突变。圜痰多家攀位陋吲用该方法瓣圜入ＷＤ基因突变进行研究并积累了丰富资料。ＰＣＲ—ＳＳＣＰ版然操作相对简单麒赘用较低，但凼于不能明确突变部位和性质，殿易出现假阳性或假阴性结果，嗣藏多用于突变的筛选，其最终络暴霰经ＤＮＡ浏孝袋证实。３ＰＣＲ一酶切和荧光ＰＣＲ技术由于点突变能使原有的酶切点消失或出现新的酶切位点，故可针对已知突变位点选用合适的性内切酶进行酶切分析。瓣蔽弗；％黄先采爨酶切法对Ｈｉｓｌ０６９Ｇｌｎ突变逡ｉ｝稔测，逶鹱了其在ＷＤ患者特别是癜状前期患者诊断中的价值。豳内马少春隅、毛柠【，—及作者｛１８等采用泼方法对ＷＤ患者分别进行点突变检测。虽然该方法简便快速且成本较低，但不能检测未知的突变位点，其临床应焉受翻了一定限铡。隧着荧光ＰＣＲ技本静毒褒，纛有学费１麓《用此技术进行ＷＤ基黼突变稳测，偿麓其缺点依然怒必能筛查已知突变位点且需要设计针对特异突变的探针。４燮性高效液相色谱（ＤＨＰＬＣ）分析∞氆纪粥年代寒爨理懿变燃辩效滚攘色谱（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．ＤＨＰＩ。Ｃ）分析技术基于以下原理：部分变性后的变异型和野生型ＰＣＲ产物分别形成同源双链和异源双链，由于二者志间双链熔解潞度（Ｔｍ）的差异使其在同定相中搏馨的对闯不同，形成不嗣的色谱蜂，扶｛ｉｉ；有效嚣分野生璎与突变登基因嘲。Ｖｒａｂｅｌｏｖａ等｛２ｌｌ斑震该技零结合ＲＬＦＰ翻ＤＮＡ测痔等技术对２２７例东欧人ＷＤ患者进行榆测，总共发现４０种突变和１８种多态，检｝ｆ｛率达８０．３％。国内杨静芳等２噪用ＤＨＰＬＣ对７４例串髑ＷＤ患者进行ｒ检测，共发现２２种突变和１１静多态，经ＤＮＡ溯穿证实其符合率秀１００％。馋洚一种赛逶蘩繁选ＤＮＡ穿硼变异的新技术，ＤＨＰＬＣ具有快速、敏感、准确且经济的特点，但该方法．与ＳＳＣＰ一样不能明确突变部位和性质，故适用于大样本筛查已知或未知突变。５◇ＮＡ溺序菝寒随着分子每物学技术的不断创新，ＤＮＡ测序藤朝着高速、高通量、自动化的方向发展。由于能明确突变的具体部位和性质，对Ｗ１）麓因进行ＤＮＡ序列分析是只前最准确、可靠的方法，是ＷＤ基嚣诊颤酶“金标蕊”。在瘟矮翦述务种技术送行ＷＤ基邃诊瞬时其结果亦需ＤＮＡ测搿来证实。Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ等ｌ毪蠢硝多管并行测序（ｍａｎｉｆｏｌｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技术在２４个瑞典人ＷＤ家系发现１６种突变，其中１０种为新的发现。吴志英等［２４１对６５个家系的８４例国人ＷＤ患者的所有２１个外显子进行测序。共检测到１８种突变和１７种多态，其中包括７种新突变和５种新多态，并认为我国ＷＤ基因突变是以少数几个热点突变和广泛存在的罕见突变为特征。但本方法对人员技术水平、设备要求高，难于在一般医院中推广应用；且ＷＤ基因全长约８０ｋｂ，各外显子突变形式多种多样，对所有外显子逐一进行测序分析花费高、周期长，一般患者难以承受。６ＤＮＡ微阵列技术近年来，伴随基因组计划出现和发展起来的ＤＮＡ微阵列技术以其固有的小型化、并行性和高通量等特点，在生物分子信息获取，特别是生物基因组的再测序、基因多态性的信息检测和基因表达监测等方面得到了快速的发展和应用１２５ｌ。由于ＤＮＡ微阵列技术与ＷＤ基因高度遗传异质性的特点相契合，是一种极具潜力的ＷＤ基因检测工具。２００３年，Ｂａｎｅｒ等㈣采用等位基因特异性封闭探针（ａｌｌｅｌｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｄｌｏｃｋｐｒｏｂｅｓ）结合ＤＮＡ微阵列技术对７５例欧美裔ＷＤ患者１３个基因突变及多态位点进行检测，经ＤＮＡ测，序结果证实其准确率达１００％。首次证实了该技术用于ＷＤ基因诊断的可行性。Ｈａｒｍｕｔ等开发了一种可以检测６０种ＷＤ基因突变的ＤＮＡ微阵列芯片，但仍不能包含一些少见的和新发现的突变唧。因此，该技术目前尚处于研究探索阶段，加之建立ＤＮＡ微阵列技术平台投入不菲，其面向临床应用尚需待以时日。参考文献［Ｊ］ＡｌａＡ，ＷａｌｋｅｒＡＰ，ＡｓｈｋａｎＫ，ｅｔａ１．Ｗｉｌｓｏｎ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ．Ｌａｎｃｅｔ，２００７，３６９：３９７—４０８．［２］胡纪源，吕达平，王共强，等．肝豆状核变性的临床误诊研究．中华医学杂志，２００１，８１（１１）：６４２—６４４．［３］Ｒｏｂｅ，ｓＥＡ。ＳｃｈｉｌｓｋｙＭＬ．ＡｐｒａｃｔｉｃｅｇｕｉｄｅｌｉｎｅｏｎＷｉｌｓｏｎ＇ｄｉｓ－ｅａｓｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００３，３７（６）：ｌ４７５一ｌ４９２．［４］ＦｅｒｅｎｃｉＰ．ＲｅｇｉｏｎａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＡ１聊ＢｇｅｎｅｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＷｉｌｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ：ｉｍｐａｃｔｏｎｇｅｎｅｔｉｃｔｅｓｔｉｎｇ．ＨｕｍＧｅｎｅｔ，２００６，１２０：１５１－１５９．【５ＪＦｉｇｕｓＡ，ｌａｍｐｉｓＲ。ＤｅｖｏｔｏＭ，ｅｔａ１．ＣａｒｒｉｅｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＷｉｌｓｏｎｄｉｓｅａｓｅｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙ—ｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｉｓ．ＪＭｅｄＧｅｎｅｔ，１９８９，２６（２）：７８－８２．［６］吴志英，王柠，慕容慎行，等．ＷＤ基因内部及其两侧翼的微卫星多态快速榆出Ｗｉｌｓｏｎ病基因携带者及症状前患者．中国神经精神疾病杂志，１９９６，２２（１）：６１—６３．［７］王丽娟，梁秀龄，刘焯霖，等．中国南方汉人Ｄ１３Ｓ３１６位点多态性及Ｗｉｌｓｏｎ病基因诊断的研究．中国神经精神疾病杂志，２０００，２６（２）：９０—９２．【８ＪＧｕｐｔａＡ，ＭａｕｌｉｋＭ，ＮａｓｉｐｕｒｉＰ’ｅｔａ１．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＷｉｌｓｏｎｄｉｓｅａｓｅｕｓｉｎｇｐｒｅｖａｌｅｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｓｉｎ—ｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｍａｒｋｅｌ＇，８．ＣｌｉｎＣｈｅｍ，２００７，５３（９）：ｌ６０ｌ—ｌ６０８．［９］ＨａｒｍｕｔＨ，ＳｃｈｍｉｄｔＪ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇｓｉｎｇｌｅ—ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒ－ｐｈｉｓｍｍａｒｋｅｒｓｉｎｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＷｉｌｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ，万方数据４８９２００７，５３（９）：１５６８—１５６９．［ｔｏ］ＯｒｉｔａＭ，ＳｕｚｕｋｉＹ，ＳｅｋｉｖａＴ，ｅｔａ１．Ｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｌｅｃ—ｔｉｏｎｏｆｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄＤＮＡｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｕｓｉｎｇｔｈｅｐｏｌｙ—ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９８９，５：８７４．［１１］ＴｈｏｍａｓＧＲ，ＦｏｒｂｅｓＪＲ，ＲｏｂｅｒｔｓＥＡ，ｅｔａ１．ＴｈｅＷｉｌｓｏｎｄｉｓｅａｓｅｇｅｎｅ：ｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｉｒｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ，１９９５，９：２１０－２１７．［１２］杨任民，范玉新，余龙，等．肝豆状核变性基因的一种新型错义。突变．中华医学杂志，１９９７，７７（５）：３４４—３４７．［１３］吴志英，慕容慎行，王柠，等．中国人肝豆状核变性基因第１４、１８和５号外显子突变及多态研究．临床神经病学杂志，１９９７，１０（５）：２５９—２６１．［１４］马少春，徐评议，梁秀龄，等．肝豆状核变性８号１４号外显子基因突变的检测．中山医科大学学报，１９９８，１９（１）：１４—１７，２６．［１５］ＭａｉｅｒＤＴ，ＦｅｒｅｎｃｉＰ，Ｐｏｌｌｉｃ，ｅｔａ１．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＨｉｓ１０６９ＧｌｕｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＷｉｌｓｏｎｄｉｓｅａｓｅｂｙｒａｐｉｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ．ＡｎｎＩｎｔｅｒＭｅｄ，１９９７，１２７（１）：７０—７２．［１６］马少春，徐评议。梁秀龄，等．肝豆状核变性８号外显子７７８密码子基因突变的酶切检测冲圆神经精神疾病杂志，１９９８，２４（６）：３３３－３３５．［１７］王柠，吴志英，林珉婷，等．应用性酶谱分析法快速检出Ｗｉｌｓｏｎ病基因突变热点．中华神经科杂志，１９９９，３２（５）：２８１—２８３．［１８］程楠，胡纪源，杨任民，等．ＰＣＲ一酶切法检测Ｗｉｌｓｏｎ病９３５密码子基因突变．中国优生与遗传杂志，２０００，８（３）：２４—２５．［１９］黄帆。梁秀龄。徐评议，等．用荧光定量ＰＣＲ对中国人肝豆状核变性进行早期诊断及携带者检测．中华医学遗传学杂志，２００１，１８（１）：１７－２０．［２０］ＷｅｉｒｉｃｈＧ，ＣａｂｒａｓＡＤ，ＳｅｒｒａＳ，ｅｔａ１．ＲａｐｉｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＷｉｌｓｏｎ＇ｓｄｉｓｅａｓｅｃａｒｒｉｅｒｓｂｙｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｈｉｇｈ——ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑ—－ｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．ＰｒｅｙＭｅｄ，２００２，３５（３）：２７８—２８４．［２１］ＶｒａｂｅｌｏｖａＳ，Ｌｅｔｏｃｈａ０，ＢｏｒｓｋｙＭ，ｅｔａ１．ＭｕｔａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＡＴＰ７Ｂｇｅｎｅａｎｄｇｅｎｏｔｙｐｅ／ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｉｎ２２７ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＷｉｌｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ．ＭｏｌＧｅｎＭｅｔａｂ，２００５，８６：２７７—２８５．［２２】杨静芳．梁秀龄，马守忠。等．７４例肝豆状核变件患者中ＡＴＰ７Ｂ基因七种新突变的发现．中华神经科杂志，２００６，３９（１０）：６７３—６７７．［２３］ＷａｌｄｃｎｓｔｒｏｍＥ，ＬａｇｅｒｋｖｉｓｔＡ，ＤａｈｌｍａｎＴ＇ｅｔａ１．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｄｅ－ｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＷｉｌｓｏｎｄｉｓｅａｓｅｂｙｍａｎｉｆｏｌｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９６，３７：．３０３—３０９．［２４］吴志英，王柠，林珉婷，等．Ｗｉｌｓｏｎ病基因全长外显子的突变检测和分析．中华神经科杂志，２００１，３４（３）：１５２—１５５．［２５］ＬｉｐｓｈｕｔｚＲ，ＦｏｄｏｒＳ，ＧｉｎｇｅｒａｓＴ，ｅｔａ１．Ｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｓｙｎｔｈｅｔｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｒｒａｙｓ．ＮａｔＧｅｎｅｔＳｕｐｐｌｅ，１９９９，２１：２０－２４．［２６］ＢａｎｅｒＪ，ＩｓａｋｓｓｏｎＡ，ＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍＥ，ｅｔａ１．Ｐａｒａｌｌｅｌｇｅｎｅａｎａｌ－ｙｓｉｓｗｉｔｈａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｄｌｏｃｋｐｒｏｂｅｓａｎｄｔａｇｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００３，３１（１７）：１０３－１０９．（２００８—１１－１９收稿２００９—０２－０４修回）
