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《现代食品科技》 Ｍｏｄｅｒｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｉ．２２ Ｎｏ．２（总８８） 文章篇号：１ ００７—２７６４（２００６）０２－００２８—００８ 自 中１３－１，３一葡聚糖的工艺研究 唐治玉，王淮，熊善柏 （华中农业大学食品科技学院，湖北武汉４３００７０） 摘要：本文通过正交试验，对自漆酶．碱法提取废啤酒酵母中ｐ－１，３一葡聚糖的最佳工艺进行了研究。结果表明其最佳工艺务件为： 啤酒酵母于５０￣Ｃ自溶６ｈ后，添加１００Ｕ／ｇ湿酵母木瓜蛋白酶，继续自溶１８ｈ后离心，沉淀用２％的ＮａＯＨ溶液分散，于８０￣Ｃ７Ｊ￣ 理３ｈ后离心，沉淀用蒸馏水清洗３～４次后进行真空冷冻干燥，粉碎得成品。成品得率１０．８０％，其中多糖含量８７．７０％、蛋白质含量 ０．４５％、水分含量６．７２％、灰分含量１．０５％，具有得率高、纯度高、蛋白质含量低的特点。 关键词：自溶．酶一碱法；酵母 ｌ，３一葡聚糖；提取 Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ０ｆ ｐ一１＇３一ｇｌｕｃａｎ ｆｒｏｍ Ｂｅｅｒ Ｙｅａｓｔ ｂｙ Ａｕｔｏｌｙｓｉｓ－Ｅｎｚｙｍｅ－Ａｌｋａｌｉ Ｍｅｔｈｏｄ Ｔａｎｇ Ｚｈｉ－ｙｕ，Ｗａｎｇ Ｈｕａｉ，Ｘｉｏｎｇ Ｓｈａｎ－ｂａｉ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ—ｌ Ｉ３一ｇｌｕｃａｎ ｆｒｏｍ ｂｅｅｒ ｙｅａｓｔ ｂｙ ａｕｔｏｌｙｓｉｓ－ｅｎｚｙｍｅ—ａｌｋａｌｉ ｍｅ￣ｏｄ Ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ａｆｔｅｒ ｂｅｅｒ ｙｅａｓｔ ａｕｔｏｌｙｚｉｎｇ ６ ｈｏｕｒｓ ａｔ ５０￣Ｃ，ｐａｐａｉｎ Ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｂｙ １００Ｕ ｐｅｒ ｇｒａｍ ｗｅｔ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ ａｕｔｏｌｙｚｉｎｇ １８ ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ￣ｅａｔｄ ｂｅｅｒ ｙｅａｓｔｅ Ｗａｓ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ． ｈｅ ｐｒｅｃｉＴｐｉｔａｔｅ Ｗａｓ ｓｃａｔｔｅｒｅｄ ｗｉｈ ２％ＮａＯＨ ａｔｎｄ ｗａｔｅｒ－ｂａｔｈｅｄ ３ ｈｏｕｒｓ ａｔ ８０￣Ｃ，ｔｈｅｎ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ．Ｔｈｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ Ｗａｓ ｄｒｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｖａｃｕｕｎｌ ｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｆｎｇ ａｆｔｅｒ ｗａｓｈｉｎｇ ３ ｏｒ ４ ｔｉｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ．Ｙｉｅｌｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｈｅ ｆｔｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｗａｓ １０．８０ＯＡ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ｐｒｏｔｅｉｎ，ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｎｄ ａａｓｈ Ｗａｓ ８７．７０％，０、４５％，６．７２％，１．０５％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｕｔｏｌｙｓｉｓ－ｅｎｚｙｍｅ—ａｌｋａｌｉ ｍｅｈｏｄ；Ｙｅａｔｓｔ １３－１．３－ｇｌｕｃａｎ；Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； Ｄ一１，３一葡聚糖是一种活性强、无毒副作用的高效生 物应答物（ＢＩ ｖＩｓ），具有抗肿瘤、增强机体免疫力、 抗菌抗病毒等功能，已广泛用于医药、食品行业【Ｊ Ｊ。 酵母细胞壁含有碱不溶性、酸溶性和碱溶性三种葡聚 １材料与方法 １．１试验材料 酵母３－１，３一葡聚糖：实验室自制，从酵母泥中提 取；酵母泥：武汉东西湖啤酒厂；酵母粉：酵母泥经 低温干燥后，粉碎制得。ＨＡＰ碱性蛋白酶（８万Ｕ／ｇ）、 １３９８中性蛋白酶（２万Ｕ儋）、５３７酸性蛋白酶（３万Ｕ／ｇ）． 无锡星达生物工程有限公司；木瓜蛋白酶（１．５万Ｕ儋）： 广州远天酶制剂厂；化学试剂：均为分析纯。 １．２试验方法 糖，其中碱不溶性的Ｄ一１，３一葡聚糖为主要组分【２Ｊ。我国 啤酒生产量已居世界第二位，啤酒业每年大约产生３—５ 万吨废酵母泥（干基） Ｊ，开发高价值产品，对提高资 源利用价值具有重要意义。 国外学者多采用酸一碱处理法从酵母中提取ｆ｝－葡 聚糖，已形成较成熟的提取工艺并申请了美国专利 Ｊ。但这一工艺方法酸碱用量大，对环境污染严重， １．２．１酵母３－１，３一葡聚糖的提取 工艺步骤多，而且Ｂ一葡聚糖得率较低。为解决这一问 题国内学者做了很多探索［１－２，６－８］，如采用蛋白酶处理后 再用热碱处理以减少碱的用量，或尝试直接利用制备 酵母抽提物时剩下的自溶残渣来进行提取。本文在比 啤酒废酵母泥过滤去杂后，离心收集酵母沉淀， 所得的酵母加入２％ＮａＣＩ溶液，于５５℃自溶２４ｈ，并 于自溶过程中添加蛋白酶，自溶结束后离心收集沉淀， 加入适当体积与浓度的ＮａＯＨ溶液，热水浴３ｈ后离 心，所得沉淀水洗３遍后进行冷冻干燥，粉碎得成品。 其中离心速度和时间均为２０００ｒ／ｍｉｎ，１５ｍｉｎ。 １．２．２理化指标的测定 较研究酸碱法、酶一碱法、自溶法的基础上，结合酵母 抽提物生产，提出了一种新的酵母Ｂ一葡聚糖提取方法， 即自溶一酶一碱法，并对该方法的生产工艺进行了研究 和探索，以实现酵母抽提物与Ｂ一１，３一葡聚糖生产的联 产目标。 收稿日期：２００５—１２－２２ ２８ 多糖含量，采用苯酚一硫酸法【９】测定；蛋白质含量， 采用微量凯氏定氮法【】ｏＪ测定；水分，１０５℃干燥恒重 ｝＝去【 测定；灰分，采用马福炉挥发恒重法 测定； 维普资讯 http://www.cqvip.com
《现代食品科技》 ＭｏｄｅｒｎＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ１．２２Ｎｏ．２（总ｓＳ） 色度，使用ｗｓＣ—ｓ测色色差仪直接进行样品色度的 测定。 ２结果与分析 ２．１ 蛋白酶种类对提取物多糖及蛋白质含量的影响 于５５￣Ｃ自溶６ｈ后，分别按ｌＯＯＵ／ｇ湿酵母添加碱性 蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，继 续自溶１８ｈ后，再按工艺步骤处理，所得的提取物中 多糖、蛋白质含量见表１。 表１蛋白酶种类对提取物中多糖及蛋白质含量的影响 表１可看出，在酵母自溶过程中添加木瓜蛋白酶 可显著降低提取物中蛋白质含量，多糖损失小。其原 因可能是５５℃、ｐＨ６．０属酵母内源酶作用范围，而这 一条件也正好是木瓜蛋白酶的最适作用范围，两者有 最佳的协同效果，促进了内源蛋白和胞壁中甘露糖蛋 白的分解。故自溶时添加木瓜蛋白酶效果最佳。 ２．２酶添加时间对提取物多糖及蛋白质含量的影响 分别于自溶Ｏｈ、６ｈ、１２ｈ、１８ｈ和２４ｈ时，加入 木瓜蛋白酶ｄｏｏｕ／ｇ湿酵母），再按上述方法制备酵母多 糖，成品中蛋白质、多糖含量见表２。 表２酶添加时间对提取物中多糖及蛋白质含量的影响 表２可知，自溶开始６ｈ后添加木瓜蛋白酶，所得 的提取物中多糖含量最高，蛋白质含量最低，而且这 一时间与自溶法制备酵母抽提物中的时间吻合。因此， 本实验选择自溶６ｈ后添加木瓜蛋白酶。 ２．３医药酶添加剂量对提取物多糖及蛋白质含量的影响 自溶处理时，分别选择５ＯＵ／ｇ、ｌｏｏｕ／ｇ、￣５ＯＵ／ｇ、 ２００Ｕ／ｇ四个水平添加木瓜蛋白酶，其余的操作同上， 制得的成品中蛋白质、多糖含量见表３。 表３木瓜蛋白酶添加量对提取物中多糖及蛋白质含量的影响 提取物组成 巫量自堕鋈垫量 ２ ５０ １００ １５０ ２００ 蛋白质（％） １．３１ １．２６ １－３１ １．４８ 多糖（％） ７５．９８ ８２．６４ ７５．６１ ７４．７４ 结果表明，随着酶添加量的增加，提取物中蛋白 质含量先减少后增加，多糖则先增后减。且酶的添加 量为ｌＯＯＵ／ｇ湿酵母时，蛋白质含量达到最低值，多糖 含量最高。蛋白质量增加的原因可能在于酶本身，多 糖含量减少可能是因为酶剂量的增加使细胞壁水解程 度增大，使多糖更加暴露在外，在ＮａＯＨ作用时导致 多糖损失增加。故最佳酶添加剂量为１００ Ｕ／ｇ湿酵母。 ２－４自溶温度对酵母多糖及蛋白质含量的影响 酵母的自溶多在５Ｏ℃～６ｏ℃范围进行，本研究 选择３Ｏ℃、４０℃、５Ｏ℃、６ｏ℃四个温度进行了试验， 结果见表４。 表４自溶温度对提取物中多糖及蛋白质含量的影响 表４可看出在５Ｏ℃～６ｏ℃时效果较佳，蛋白质 含量不到前两者的１／２，而多糖含量却增加了近１０％， 其中，５Ｏ℃处理的提取物中蛋白质含量最低、多糖含 量最高，故于５Ｏ℃处理最佳。 ２．５碱处理浓度对酵母多糖及蛋白质含量的影响 自溶处理后，再加入浓度分别为２％、３％、４％ 和６％的Ｎａ０Ｈ溶液，经不同浓度ＮａＯＨ处理的提取 物中蛋白质、多糖含量见表５。 表５碱处理浓度对提取物中多糖及蛋白质含量的影响 提取物组成—＿ — 鏖 蛋白质（％） １．３１ １．２２ ０．９２ ０．７９ 多糖（％）８３．９９ ８０．３９ ７８．６１ ７４．４０ 表５显示随碱液浓度的增加蛋白质和多糖的含量 均下降，但随着Ｎａ０Ｈ浓度升高，蛋白质去除率并非 呈直线上升，多糖含量却呈下降趋势。结果还表明碱 处理浓度在３％＂－－４％时蛋白质含量减少最多而多糖损 失最小，因此从蛋白质去除率、多糖含量损失以及污 染等方面综合考虑应选择３％Ｎａ０Ｈ作为碱处理浓度。 ２．６碱处理温度对酵母多糖及蛋白质含量的影响 碱处理温度越高对降低蛋白质含量越有利，但同 时多糖的损失率也会增大。故选择４５℃、６ｏ℃、７５℃、 ９０℃四个温度进行试验，结果见表６。 表６碱处理温度对提取物中多糖及蛋白质含量的影响 表６结果表明，７５℃条件下的碱处理效果最好， 蛋白质含量仅为０．５８％，而多糖却高达９１．６２％，明显 优于其它三组实验，因此最佳的碱处理温度为７５℃。 ２．７ 自溶一酶一碱法提取酵母Ｄ—ｌ，３一葡聚糖的工艺优化 为了在保持一定含量多糖的情况下尽可能多地去 除蛋白质，在以上单因素试验的基础上，考虑应用正 交试验设计，找出影响多糖提取的主次因素。正交试 维普资讯 http://www.cqvip.com
《现代食品科技》 Ｍｏｄｅｒｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ１．２２ Ｎｏ．２（总８Ｓ） 验的设计及结果见表７。 表７正交试验结果 注：Ａ为酶添加量（Ｕ／ｇ ｗｅｔ ｙｅａｓｔ）；Ｂ为碱处理浓度（％）；Ｃ 为碱处理温度（℃） 表８正交试验方差分析结果（蛋白质／多糖含量） 注：同格中的上面数据为蛋白质数据，下面为多糖数据 由方差分析结果可知，木瓜蛋白酶对提取物中蛋 白质含量的影响最大，达到显著水平，其次是碱浓度 和碱处理温度；而碱处理浓度、木瓜蛋白酶用量对提 取物中多糖含量的影响极显著，碱处理温度的影响较 小。综合考虑各因素对提取物中蛋白质、多糖含量的 影响，选择Ａ２Ｂ１Ｃ３作为最佳提取工艺条件，即５０℃ 自溶６ｈ后按ｌＯＯＵ／ｇ湿酵母添加木瓜蛋白酶，继续自溶 １８ｈ后，离心去上清，沉淀用２％的ＮａＯＨ溶液分散， 于８０℃水浴处理３ｈ，离心，沉淀用蒸馏水洗３～４遍 后进行冷冻干燥，粉碎得成品。成品得率１０．８０％， 其中多糖含量８７．７０％、蛋白质含量０．４５％、水分含量 ６．７２％、灰分含量１．０５％。 ３结论 本试验对自溶一酶一碱法提取废啤酒酵母中Ｂ一１，３一 葡聚糖的工艺条件进行了优化，得到最佳的提取工艺 条件为：啤酒酵母于５０℃自溶６ｈ后，添加ｌＯＯＵ／ｇ湿 酵母木瓜蛋白酶，继续自溶１８ｈ后离心，沉淀用２％的 ＮａＯＨ溶液分散，于８０℃水浴处理３ｈ，再离心去上清， 沉淀用蒸馏水清洗３～４次后进行真空冷冻干燥，粉碎 得成品。酵母Ｂ一１，３．葡聚糖成品色泽乳白，得率高达 ｌ０．８０％，其中多糖含量８７．７０％、蛋白质含量０．４５％、 水分含量为６．７２％、灰份含量为１．０５％。具有得率高、 纯度高、蛋白质含量低的特点，是从啤酒酵母中高效 提纯Ｂ一１，３一葡聚糖的理想途径。 参考文献 【１】 廖鲜艳，顾国贤，李崎等．啤酒废酵母残渣制备碱不溶性葡 聚糖【Ｊ】．酿酒，２００１，２８（１）：７５—７７ 【２】 赵光远，殷蔚申，吴小荣用废啤酒酵母制备碱不溶性葡聚 糖的研究【Ｊ１．微生物学通报，１９９７，２４（３）：１４８－１５２ 【３】 黄刚良，刘曼西，曹元成等．啤酒酵母中（１—３）－ Ｉ）－葡聚糖 的提取及其机理研究【Ｊ】．精细化工，２００３，２０（８）：４５８－４６５ 【４】 Ｓｐｉｒｏｓ Ｊ．，Ｃｈｏｋｙｔｉｌｌ Ｒ．，Ａｍｂｏｎｙ Ｊ．Ｓ．，Ｇｌｕｃａｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｐｒｅｐａｒａｉｔｏｎｔｈｅｒｅｏｆ［Ｐ］．ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰａｔｅｎｔ． Ｎｏ．５０２８７０３，１９９１ 【５】 ＢｙｒｏｎＡ．Ｄ．，Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｂｅｔａ（１，３）ｆｉｎｅｌｙ ｇｒｏｕｎｄ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｇｌｕｃａｎ ｃｏｍｐｏｓｉｉｔｏｎ ｗｉｈｔ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｎａｄ ｎｕｔｒｉｉｔｏｎ￣ｕｓｅｓ［ｐ］．Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ＰａｔｅｎＬ Ｎｏ．５５７６０１５，１９９６ 【６】 李卫旗，皇浦宏等．啤酒酵母中 １，３一葡聚糖的提取及其性 能的分析【Ｊ１．浙江大学学报（理学版），１９９９，２６（２）：７５．７８ 【７】 胡晓忠，明杰，甄宝贵用酸碱法从面包酵母中提取 １，３．葡 聚糖【Ｊ】．工业微生物，２０００，３０（１）：２８．３１ 【８】 赵光远，钟文辉，殷蔚申．用废啤酒酵母自溶残渣制备碱不 溶性葡聚糖的研究【Ｊ］．食品科学，１９９７，１８（２）：２３－２７ 【９】 张惟杰．复合多糖的生化研究技术（第二版）【Ｍ】．杭州：浙江 大学出版社．１９９９ 【１０】张龙翔．生化实验方法和技术（第二版） ｖｆ】．北京：高等教育 出版社．１９９７ 【ｌ１】无锡轻工业学院，天津轻工业学院合编．食品分析【Ｍ】 Ｅ京： 中国轻工业出版社，１９９４
