SD大鼠1型糖尿病动物模型的建立_常利民

山西医药杂志2009年3月第38卷第3期上半月󰀁ShanxiMedJ,March2009,Vol.38,No.3theFirst

󰀁实验研究󰀁

SD大鼠1型糖尿病动物模型的建立

唐山钢铁集团有限责任公司医院(063020)󰀁常利民上海交通大学医学院附属第九人民医院󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁

董佳生󰀁徐󰀁华󰀁王露萍戴传昌󰀁祝󰀁联󰀁王毅敏

󰀁摘󰀁要󰀁󰀂目的󰀁探讨制作理想糖尿病动物模型的方法。方法󰀁采用空腹腹腔一次性注射65mg/kg链脲佐菌素的方法,建立SD大鼠1型糖尿病模型。结果󰀁造模1周后测血糖均高于16󰀁7mmol/L。持续观察8周,血糖值始终在建模初期高血糖水平上波动,未见到复转,并出现典型的󰀁三多一少󰀁症状,胰腺符合糖尿病成模动物胰腺病理变化。结论󰀁采用空腹腹腔一次性注射65mg/kg链脲佐菌素的方法复制出1型糖尿病模型,具有造模方法简便、用药量小、药物毒性较低、胰岛B细胞损害特异性高等优点,可应用于糖尿病及其并发症研究的各个领域。

󰀁关键词󰀁󰀂糖尿病,1型;󰀁模型,动物;󰀁链脲佐菌素

Establishmentoftype1diabetesratmodelinducedbystreptozotocin󰀁CHANGLi󰀁min*,DONGJia󰀁sheng,XUHua,WANGLu󰀁ping,DAIChuan󰀁chang,ZHULian,WANGYi󰀁min.tal,Hebei063020,China

󰀁Abstract󰀁󰀁Objective󰀁Toestablishanidealtype1diabetesmellitusSDratsmodel.Methods󰀁SDratswerein󰀁jectedintraperitoneallywith65mg/kgstreptozotocinoncetoinducehyperglycemia.Results󰀁Oneweekafterinducedbystreptozotocin(STZ),thebloodglucoseoftheexperimentalgroupwerehigherthan16󰀁7mmol/L.Duringthe8weeksobservation,thebloodglucoseoftheexperimentalgroupwerestablyhigherthan16󰀁7mmol/L.Morphologicalinvestigationonpancreasshowedthereductionofislets,lossof󰀁cellsintheexperimentalgroup.Conclusion󰀁Theex󰀁perimentprovidedanidealtype1diabetesmellitusSDratsmodel.

󰀁Keywords󰀁󰀁Diabetesmellitus,type1;󰀁Model,animal;󰀁Streptozotocin

*

TangshanIronandSteelCo.,Ltd.Hospi󰀁

󰀁󰀁随着人们生活水平的提高,糖尿病的发病率呈上升趋势,糖尿病的相关研究越来越受到人们的重视,而建立相应的动物模型是研究糖尿病的重要手段之一。目前建立糖尿病动物模型的方法较多,如实验性糖尿病动物模型、自发性糖尿病动物模型和转基因糖尿病动物模型等。由于实验条件的,实验性糖尿病动物模型是目前常用的方法。本研究旨在探讨采用链脲佐菌素诱导构建糖尿病动物模型的最佳方法。1󰀁材料与方法

1.1󰀁主要试剂和仪器设备

1.1.1󰀁主要试剂:链脲佐菌素(STZ):美国Sigma公司提供;柠檬酸(C6H5O7󰀁H2O):中国松凯实业有限公司提供;柠檬酸三钠(C6H5O7Na3󰀁2H2O):上海试四赫维化工有限公司提供。

1.1.2󰀁主要溶液的配制:0󰀁1mol/L,pH4󰀁0柠檬酸缓冲液的配制:第一步:配制A液(0󰀁1mol/L柠檬酸水溶液):

柠檬酸21󰀁01g加入蒸馏水至1000mL。第二步:配制B液(0󰀁1mol/L柠檬酸钠水溶液):柠檬酸钠29󰀁41g加蒸至1000mL。第三步:A液33󰀁0mL+B液17󰀁0mL再加蒸馏水至1000mL,即可配制形成0󰀁1mol/L,pH4󰀁0柠檬酸盐缓冲液。

STZ溶液配制:以0󰀁1mol,pH4󰀁0柠檬酸缓冲液溶解,配制成4mg/mL的溶液,0󰀁22󰀁m滤器除菌,现用现配,配好的溶液置冰盒中保存,运输。

1.1.3󰀁仪器设备:One󰀁Touch血糖仪:美国强生公司;乐康全血糖试纸:罗氏诊断公司;0󰀁22󰀁m针孔滤器:Corning,德国。

1.2󰀁实验动物及分组

无特定病原体(SPF)级8周龄雄性(SD)大鼠,数量40只,体质量190~220g,复旦大学医学院动物实验中心提供。随机分为2组:对照组20只,实验组20只。所有大鼠均以标准颗粒饲料、标准笼喂养,每笼5只。各组大鼠实验期间均自由进食、饮水。自然昼夜照明,室内通风良好,氨浓度<20ppm,相对湿度为40%~70%,室温保持在18~22󰀁。1.3󰀁造模方法

SD大鼠经适应性饲养2周后行诱导。诱导前禁食12󰀁󰀁通信作者:董佳生

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󰀁219󰀁

h,按体质量给予65mg/kgSTZ(以0󰀁1mol/L、pH4󰀁0无菌柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液临用时配制成4mg/mL浓度)腹腔一次性注射。对照组给予等量的无菌柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。对症状较重的糖尿病大鼠腹腔注射鱼精蛋白锌胰岛素1~4U/d,以降低死亡率。1.4󰀁糖尿病大鼠各项指标检测

注射前及注射后1、2、4、6、8周分别对两组动物血糖浓度进行测定,若诱导前血糖水平<8󰀁9mmol/L,注射1周后动物血糖浓度>16󰀁7mmol/L即判定为1型糖尿病动物模型,其中尾静脉采血测外周血糖,应用罗氏诊断公司乐康全血糖试纸测定血糖,同时每周测体质量。1.5󰀁标本采集和制作

糖尿病大鼠模型成功诱导后8周与对照组同时处死,分离胰腺,置于10%中性溶液中用于制备石腊组织块,其余部分置于-70󰀁保存备用。石腊组织块定向切片厚度5󰀁m,贴片,干燥,保存。常规苏木素󰀁伊红(HE)染

色,观察胰岛病理变化。1.6󰀁统计学处理

所有实验数据用SAS6󰀁12统计软件处理,结果以󰀁x󰀁s表示,进行方差分析及t检验,以P<0󰀁05为差异有统计学意义。

2󰀁结󰀁󰀁果

2.1󰀁大体观察:实验组诱导后1周血糖逐步升高,均在16󰀁7mmoL/L以上。随着病程的进展,血糖稳定地保持在较高水平,糖尿病大鼠逐渐出现毛色灰暗、枯黄,杂乱,易激惹,体质量明显减轻,皮肤变薄,糖尿病󰀁三多一少󰀁症状明显。诱导8周后糖尿病鼠陆续出现白内障。

2.2󰀁血糖、体质量变化:见表1。由表1可见,诱导后1周实验组大鼠血糖明显升高且持续高水平,而对照组血糖始终正常,二者比较差异有统计学意义(P<0󰀁01)。对照组体质量正常增长,实验组大鼠体质量增长缓慢,与对照组比较差异有统计学意义(P<0󰀁01)。

血糖(mmol/L)

表1󰀁两组各阶段空腹血糖体质量比较(󰀁x󰀁s)

组别对照组实验组组别对照组实验组

只数2020只数2020

诱导前5.1󰀁0.75.2󰀁0.5诱导前200󰀁7202󰀁9

诱导后1周5.2󰀁0.4

󰀁

诱导后2周5.3󰀁0.6

󰀁

诱导后4周5.3󰀁0.6

󰀁

诱导后6周5.1󰀁0.5

󰀁

诱导后8周5.2󰀁0.4󰀁30.2󰀁1.21)诱导后8周418󰀁10󰀁209󰀁121)

28.5󰀁2.21)诱导后1周236󰀁7󰀁219󰀁61)

31.4󰀁1.71)诱导后2周269󰀁10󰀁225󰀁91)

29.8󰀁1.71)诱导后4周322󰀁12󰀁219󰀁121)

30.0󰀁1.31)诱导后6周371󰀁14󰀁211󰀁121)

体质量(g)

󰀁󰀁1)与对照组比较P<0.01。2.3󰀁大鼠糖尿病模型胰腺的形态观察:对照组大鼠胰岛为圆形或椭圆形的细胞团,分散于胰腺腺泡之间,数量较多,无包膜,细胞团块大小不一,B细胞数量较多,胞质丰富,核圆形;实验组胰岛萎缩,数量减少,分布稀疏,胰岛细胞发生退行性改变,数目减少,胰岛中B细胞数量减少、肿胀,胞质着色浅,细胞核固缩,胰岛间质纤维化。

制作糖尿病模型、病毒诱导等;󰀁自发性糖尿病动物模型;󰀁转基因糖尿病模型。自发性糖尿病动物模型与转基因糖尿病动物模型最接近人类糖尿病,应用价值较高,但动物价格昂贵,饲养、繁殖条件要求严格;实验性糖尿病动物模型则可适应不同实验的要求,模拟糖尿病的不同生理、病理状况,制作方法相对简单,应用更为广泛。

用于实验性糖尿病动物模型诱导的化学药物常用的有两种:STZ和四氧嘧啶。两种药物比较,STZ优于四氧嘧啶,具有造模稳定,快速,种属选择性不强,组织毒性相对较小等优点,故STZ最为常用[2]。STZ是一种广谱抗菌素,具有抗菌、抗肿瘤的性能和致糖尿病的副作用,对实验动物的胰岛B细胞具有高度选择性毒性作用。其诱导糖尿病的机制可能是通过自由基损伤胰岛B细胞,使胰岛B细胞功能受损,胰岛素合成减少,引发糖尿病;同一种系中STZ致细胞损伤程度取决于STZ的量,低剂量诱导B细胞INS󰀁1凋亡,高剂量致B细胞坏死[3]。Ledoux和Wilson[4]和Pettepher等[5]认为,STZ对B细胞的细胞毒作用首先是将其DNA碱基上的特殊位点烷基[3]

3󰀁讨󰀁󰀁论

糖尿病是一种发病率较高的代谢性疾病,具有广泛而严重的并发症及很高的致残率和致死率,对糖尿病的研究已经成为世界范围内的热点。糖尿病动物模型的使用,可以克服人体研究的局限性,大大促进糖尿病的相关研究。因此,建立简便、安全、可靠而又接近人类糖尿病的动物模型是糖尿病造模研究发展的必然趋势。动物模型的选择应该遵循以下几点基本原则:󰀁能正确复制所要研究的损伤或病变;󰀁可以多次或用多种方式进行实验;󰀁实验可被别人重复;󰀁在实验中可获取多个活检标本;󰀁容易操作并与动物实验设备相适应;󰀁有可供实验观察的足够时间[1]。目前糖尿病动物模型的构建有多种方法,包括󰀁实验性糖尿病动物模型:胰腺切除法、化学药物特异性破坏胰岛B细胞、手术及药物联合󰀁220󰀁

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化,继而进一步作用于多聚腺苷二磷酸(ADP)核糖体合成酶,从而损伤胰岛B细胞;小剂量注射STZ可破坏少量胰岛细胞,死亡胰岛细胞作为抗原被巨噬细胞吞噬,产生Th1刺激因子,使Th细胞系占优势而产生白细胞介素(IL)󰀁2及肿瘤坏死因子(IFN)󰀁󰀁,在胰岛局部促使炎性细胞浸润,并活化释放IL󰀁1、干扰素(TNF)󰀁󰀁、IFN󰀁󰀁及NO、H2O2等物质,杀伤细胞。死亡细胞作为自身抗原,再次递呈给抗原递呈细胞进行处理,释放细胞因子,放大细胞损伤效应,最终导致糖尿病[6]。

STZ诱导的糖尿病因给药方式不同,其成模效果也有所差别。如采用大剂量一次性注射的给药方法,建立的大鼠模型与人类1型糖尿病相似;如采用小剂量分次给药的方法,建立的大鼠模型与人类2型糖尿病相似。利用STZ诱导糖尿病给药的途径很多,如静脉注射、腹腔注射、皮下注射等。据

[7]

沈亚非和徐淼成研究,通过腹腔或静脉一次性注射给药,均能取得良好的模型复制效果,且各种体征数据差异无统计学意义。考虑到STZ诱导液非常不稳定,在常温下几分钟内就可以分解为可见的气体,故本实验采用腹腔注射给药的方式,操作简单、方便,时间短,确保药效。

本实验选用雄性SD大鼠,按照65mg/kg体质量通过腹腔一次性注射STZ,诱导B细胞破坏,最终成模。大鼠注射STZ1周后测血糖均高于16󰀁7mmol/L(P<0󰀁05),以后血糖保持在较高水平,并随着病程延长有所提高,同时大鼠均出现多饮、多食、多尿、体质量减轻、易激惹及白内障等表现,符合糖尿病诊断标准。观察8周,血糖值始终在建模初期高血糖水平上波动,未见到复转。胰腺常规HE染色显示:胰岛萎缩,数量减少,分布稀疏,胰岛细胞发生退行性改变,胰岛中B细胞数量减少、肿胀,胞质着色浅,细胞核固缩,胰岛间质逐步纤维化,进一步证实了我们诱导的糖尿病模型是成功的。与其他构建实验性糖尿病模型的方法比较,此模型具有制造方法简便、用药量小、药物毒性低、胰岛B细胞损害特异性高等优点。近年来国内外已将此模型广泛应用于糖尿病及其并发症研

究的各个领域,但这一模型是通过STZ直接损伤胰岛B细胞诱发大鼠糖尿病,其局限性在于大剂量STZ能够大面积甚至完全破坏胰岛B细胞,从而引起血糖急剧升高,大鼠体质量急剧下降,还需要进行深入的研究和探讨。

我们认为在一次性腹腔注射STZ复制糖尿病大鼠模型过程应该注意以下事项:󰀁由于STZ溶液极其不稳定,应该现配现用,4󰀁保存。STZ粉剂应-20󰀁保存。󰀁注射前动物应该禁食12h以上,这样可以减少STZ的用量;否则容易造成动物血糖浓度过高,形成酮症酸中毒死亡。󰀁如果实验期间需要从尾部多次采血,应对伤口采取预防感染处理;否则容易出现动物烂尾感染。󰀁由于我们的实验观察时间较长,当动物血糖浓度>30mmol/L时,给予动物皮下注射胰岛素,预防酮症酸中毒而死亡。󰀁在动物饲养期间,一定要保证供水充足。由于成模动物排尿量较多,每天应更换垫料1~2次,保持干燥。

参考文献

1李荟元.创伤动物研究模型:兔耳瘢痕模型的建立与应用.西安:第四军医大学出版社,2005.

2李聪然,游雪甫,蒋建东.糖尿病动物模型及研究进展.中国比较医学杂志,2005,15(1):59󰀁63.

3SainiKS,ThompsonC,WinterfordCM,etal.Streptozotocinatlowdosesinducesapoptosisandathighdosescausesnecrosisinamurinepancreaticbetacellline,INS󰀁1.BiochemMolBiolInt,1996,39(6):1229󰀁1236.

4LedouxSP,WilsonGL.Effectsofstreptozotocinonaclonalisolateofratinsulinomacells.BiochimBiophysActa,1984,804(4):387󰀁392.

5PettepherCC,LeDouxSP,BohrVA,etal.Repairofalkali-labilesiteswithinthemitochondrialDNAofRINr38cellsafterexposuretothenitrosoureastreptozotocin.JBiolChem,1991,266(5):3113󰀁3117.

6彭芳,杨远华.实验性糖尿病动物动物模型制备及指标测定评价.大理学院学报,2003,2(1):1󰀁3,8󰀁

7沈亚非,徐淼成.链脲佐菌素诱导实验性糖尿病大鼠模型建立的研究.实用诊断与治疗杂志,2005,19(2):79󰀁80.

(收稿日期:2008󰀁11󰀁28)

作者简介:常利民,男,1971年2月生,主治医师,唐山钢铁集团有限责任公司医院,063020