c-Fos基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型及迁移的影响

窑691窑

基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型及迁移的影响

张宏伟1，刘宇2，杨野2，张强2（1.天津东丽医院普外科，天津300300；2.中国医科大学附属一院干诊科，沈阳110001）

摘要中

目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞（VSMC）基因，探讨基因表达抑制后siRNA对平滑肌细胞表

型转换及迁移的作用。方法设置正常对照组、阴性siRNA组及阳性siRNA转染组。应用RT鄄PCR半定量法检测VSMC

和琢平滑肌肌动蛋白（）mRNA的水平，采用Westernblot检测琢鄄SM鄄actin、碱性成纤维细胞生长因子

siRNA转染组

基因表达水平降低，而正常对照组与阴性siRNA组比

mRNA和蛋白表达较正常对照组及

基因沉寂可在诱导VSMC

RNA干扰介导的

（bFGF）、内皮素1（ET鄄1）蛋白活性的变化，应用免疫荧光染色检测平滑肌分化标志蛋白琢鄄SM鄄actin，同时应用Transwell检测平滑肌细胞迁移能力。结果较

siRNA转染后阳性

基因表达水平无统计学差异。siRNA转染使

表达减弱后，VSMC中

阴性siRNA组显著上调，bFGF、ET鄄1表达减弱，VSMC迁移速度减慢。结论分化的同时抑制VSMC迁移。关键词中图分类号doi

网络出版地址；RNA干扰；血管平滑肌细胞；细胞表型R322.12；R329.28文献标志码A文章编号0258-46（2011）08-0691-05http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.r.20110726.1659.026.htmlEffectofRNAInterferenceforVascularSmoothMuscleCellsGeneonthePhenotypicTransitionandMigrationof

（1.DepartmentofGeneralSurgery，TianjinDongliHospital，Tianjin300300，China；2.DepartmentofCadres，TheFirstHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China）ZHANGHong鄄wei1，LIUYu2，YANGYe2，ZHANGQiang2AbstractObjectiveToinvestigatetheinfluenceofRNAinterferencetargetingandgeneonthephenotypictransitionandmigrationof

genebyliposome.Effectsof

vascularsmoothmusclecells（VSMCs）.MethodssiRNAonmRNAexpressionofVSMCsweretransfectedwithsiRNAtargetingterminedbyWesternblot.WeobservedthedifferentiationofVSMCsbyimmunofluorescenceandexaminedthemigrationabilityofVSMCswithamodifiedBoyden鄄chamberassaysimultaneously.Resultsincreasedinthedecreasedcomparedtothecontrolgroups（normalcontrolandnegativesiRNAgroups）.TheexpressionandmRNAlevelof

siRNA鄄transfectedVSMCs.TheshapeofAftertransfectedwithsiRNAtargetinggene，expressionofwerewas

wereexaminedbyRT鄄PCRwhilethelevelsof琢鄄SM鄄actin，bFGFandET鄄1werede原

sloweredVSMCmigrationandreducedthenumberofmigratingVSMCs.ExpressionsofbFGFandET鄄1weresignificantlydecreasedafterinhibittheirmigration.KeywordssiRNAtransfection.ConclusionsiRNA鄄transfectedVSMCsturnedintospindle鄄like.siRNA

genesilencethroughRNAinterferencecaninducethephenotypictransitionofVSMCsand

；RNAinterference；vascularsmoothmusclecell；phenotypeVSMC）迁移是血管重建的主要特征之一。目前认为

血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell，要。影响VSMC迁移和分化因素较多，多种生长因子、细胞因子和细胞外基质均能刺激VSMC迁移，其中激活蛋白1（activatorprotein1，AP鄄1）在迁移中占有突出地位。

目前认为，转录因子AP鄄1是一个多种基因转录的重要因子，在心血管及血管成形术中尤为明显［1］，其亚基

是调节AP鄄1活性的关键因素。

阻断其转录调节基因的表达以抑制平滑肌细胞迁移和分化，目的是达到阻止再狭窄。RNA干扰是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，

血管损伤是VSMC表型转换的始动因素，而VSMC迁移和增殖是导致血运重建后再狭窄等增生性血管病的重要机制。由于VSMC的迁移发生在增殖前，因此抑制VSMC迁移和分化对防治再狭窄至关重

基金项目：黑龙江省卫生厅科研课题（2009鄄320）作者简介：张宏伟（1968-），男，副主任医师，博士.收稿日期：2011-02-28E-mail：zhwwjl@126.com网络出版时间：2011-7-26 16:59

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该mRNA发生降解而导致基因沉默，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默［2］。由21~25个核苷酸组成的小片段干涉RNA是RNA干扰过程细胞表现出特定缺失的表中直接起作用的分子［3］，型。为此我们设计了大鼠

的小干扰RNA

（smallinterferenceRNA，siRNA）转染体外培养的制

中国医科大学学报第40卷

染时细胞的汇合度要达到30%~50%。转染步骤按LipofectamineTM2000说明书进行。1.2.4

RT鄄PCR检测：Trizol试剂提取VSMC总

RNA。经紫外分光光度仪检测纯度，RNAA260/A280的比值在1.8~2.0间；50益30min，99益5min，5益5min，1个循环逆转录，然后进行PCR反应：94益预变性2min后，94益变性30s，55益退火30s，72益大鼠

延伸30s，共32个循环，末次延伸时间72益5min。DNASIS软件设计引物。

引物基因序列通过GenBank获得；采用

上游引物5忆鄄TGGTGG

抑VSMC，采用LipofectamineTM2000作为转染试剂，为基因治疗防止经皮冠状动脉成形术术后再狭窄奠定基础。1材料与方法1.1主要试剂和仪器基因的表达，探讨其对迁移和分化的影响，

CGTTCGTTTC鄄3忆，下游引物5忆鄄CACTGACTTGCTCTTCCCTC鄄3忆，扩增目的片段为538bp。

剂盒（GIBCOBRL公司）、玉型胶原酶（Roche公司）、TrizolRNA提取试一抗（Santa公司）、抗5忆鄄CCTTGATGTCACGGACGATCTCAC鄄3忆，扩增目的片段为543bp。CCCTGTTC鄄3忆，下游引物5忆鄄CACCCCATTTGATGTT上游引物5忆鄄TCTGCTCCT

游引物5忆鄄CCATCGTGGGACGTCCCAG鄄3忆，下游引物

上

、（武汉博山羊IgG（中杉公司）S鄄P免疫组化试剂盒、脂质体LipofectamineTM2000试士德生物工程公司）剂（Invitrogen公司）、琢平滑肌肌动蛋白（琢鄄smooth（北京中山生物muscleactin，琢鄄SM鄄actin）单克隆抗体（752型，上海光学技术有限公司）。紫外分光光度计仪器厂）、高速冷冻离心机（Jouan，意大利）、PCR扩增仪（PERKINELMER5700SequenceDetectertor，美（OlympusIX270，。国）、倒置相差显微镜日本）1.2方法1.2.1

大鼠VSMC的培养及鉴定：健康Wistar大鼠物进行2%琼脂糖电泳，并用ChemiImagerTM5500型凝胶成像仪（美国AlphaInnotech公司）进行光密度扫描，结果以1.2.5的积分光密度比值

表示。每次每组检测2复管，实验重复4次。蛋白。山羊抗大鼠琢鄄SM鄄actin、bFGF、ET鄄1多克隆

、AG鄄3忆，扩增目的片段为327bp。最后取10PCR产

Westonblot检测：转染后的细胞提取细胞总

的抗山羊IgG（1∶1000），37益孵育1h，DAB显色至出现棕色条带后在蒸馏水中终止显色。1.2.6免疫荧光染色：将细胞培养在清洁灭菌的盖

IgG抗体（1∶200），37益孵育1h。二抗为HRP耦联

用乙醚麻醉，无菌（中国医大学实验动物中心提供）外膜，游离出动脉条件下取胸主动脉，去除血管内、换1次培养液，实验用第3~7代细胞。倒置显微镜“峰”、“谷”状生下观察，呈现平滑肌细胞特征性的中层，采用组织块贴壁法行原代细胞培养，3~4d更玻片上至70%~80%融合，用4%多聚甲醛固定15min。经PBS洗涤3次后，5%山羊血清封闭30min，min，加入荧光标记的第二抗体孵育2h，DAPI复染

Transwell趋化小室法：待VSMC细胞融合

加琢鄄SM鄄actin，室温孵育4h，PBS洗涤3次，每次5min，PBS洗涤3次，0.2%TritonX鄄100PBS通透15

长。小鼠抗大鼠琢鄄SM鄄actin单克隆抗体免疫荧光鉴基因siRNA序列的设计与合成：siRNA由美国Invitrogen公司设计合成：siRNA正义：5忆鄄CAUGGAGCUGAAGGCUGAACCCUUU鄄3忆，同时照，siRNA正义链5忆鄄GGAUUGAAUCAAGUCAUUC鄄5忆鄄AAAGGGUUCAGCCUUCAGCUCCAUG鄄3忆，反义：

基因序列无关的siRNA作为阴性对

定。1.2.2

合成与

60%后以无胎牛血清的DMEM培养液饥饿24h，经为1伊105/mL为15个视野的平均细胞数。1.3

数据以依统计学处理调整0.1%胰蛋白酶消化后重悬于DMEM培养液中，

1.2.7

共聚焦显细胞核15min，经PBS洗涤后甘油封片，

拍照。微镜观察、

3忆，反义链5忆鄄GAAUGACUUGAUUCAAUCC鄄3忆。特异

进行比较，性siRNA序列输入NCBI数据库（Blast）1.2.3

与其他基因和EST序列没有同源性。

转染：实验设置正常对照组、阴性siRNA组

siRNA转染组。转染前1天，使用24

采用SPSS10.0统计软件进表示，

行单因素方差分析及均数间多重比较。<0.05为差异有统计学意义。

及阳性

孔板，在不含抗生素的适量的培养基中接种细胞，转

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M123

750M123543500bp

bpbp327250bpbp

Mgroup，marker；3，negative；1，non鄄transfectionsiRNAgroup.controlgroup；2，siRNAtransfection图2RT鄄PCR检测VSMC中mRNA的表达Fig.2Expressionof

mRNAinVSMCbyRT鄄PCR

negative1，non鄄transfectionsiRNAgroup.controlgroup；2，siRNAtransfectiongroup；3，

图3Westernblot检测VSMC中α鄄SM鄄actin蛋白的表达

Fig.3

Expressionofα鄄SM鄄actinproteininVSMCbyWesternblot

Anegative，non鄄transfectioncontrolgroup；B，siRNAtransfectiongroup；C，

图4siRNAgroup.siRNA对大鼠VSMC中α鄄SM鄄actin表达的影响

Fig.4TheeffectionofsiRNAinratVSMContheexpres-

sionofα鄄SM鄄actin1negative，non鄄transfectioncontrolgroup；2，siRNAtransfectiongroup；3，图5

siRNAWesterngroup.blot检测VSMC中

下游基因蛋白表达分析

Fig.5ExpressionofdownstreamgeneproteinbyWestern

blot

窑694窑

时间点均无统计学差异（>0.05）。如图6所示，阳性

siRNA转染组显著低于各组（<0.01），该

结果表明

siRNA抑制

中国医科大学学报第40卷

的表达则明显减

弱VSMC迁移能力。

A

A，non鄄transfectioncontrolgroup；B，图6

BsiRNAtransfectiongroup；C，negativesiRNAgroup.

C

苏木素染色后光学显微镜下观察VSMC迁移×200

Fig.6Visionunderthelightmicroscopeafter8μmpolycarbonatemembranestainedwithhematoxylin×200

3讨论

各种血管手术均伴有不同程度的血管内膜损伤，受损后内膜过度增生导致管腔狭窄严重了手术的中、远期疗效。管腔狭窄是血管内膜完整性VSMC转型、增殖和迁移是导致管腔狭窄的基本病理过程。

目前认为，VSMC异常增殖、迁移及大量合成细胞外基质是导致再狭窄的主要原因。VSMC分为分化型（收缩型）和去分化型（合成型）两种表型。损伤后在生长因子作用下，VSMC可由分化型转变为去合成大量细胞分化型，从中膜向内膜下迁移并增殖，外基质，这个过程称为表型转化［8］。a鄄SM鄄actin是分化型VSMC中特有的收缩蛋白，其表达下调是在平滑肌细胞中胞来源于平滑肌组织的重要标志，表达，而合成表型平滑肌细胞中含量甚微。有文献报道，将与琢鄄SM鄄actin特异结合的单克隆抗体1A4可显著促进成纤维用电穿孔方法导入成纤维细胞，细胞迁移［5］，用3鄄UTI阻滞琢鄄SM鄄actin蛋白合成也能促进成纤维细胞迁移。Li等［6］研究也发现，与幼年大鼠相比，老年大鼠VSMC迁移能力明显增强，琢鄄SM鄄actin等细胞骨架蛋白在其中起重要作用。这些结果说明琢鄄SM鄄actin的重要功能之一就是抑制平滑肌细胞迁移，表达减少就会促**滑肌细胞迁移。血管损伤后平滑肌细胞由分化表型转换为去分化表型是导致细胞增殖和迁移的起始步骤，也是增生性迁移能力血管疾病的共同病理基础［7］。VSMC增殖、的获得与VSMC表型转换密切相关。

基因治疗近年来已成为预防和控制血管成形术VSMC表型转化最重要的标志［4］。琢鄄SM鄄actin是细遭到破坏后一系列细胞反应的必然结果。其中中膜而后再狭窄、抑制平滑肌细胞增生是主要研究方向，抑制迁移和促进分化也是不可忽视和缺少的治疗途径。AP鄄1是各种信号传导通路中的重要效应子。转可以激活一录因子AP鄄1和AP鄄1结合位点结合后，系列细胞增殖因子和细胞外增殖产物，包括c鄄myc﹑成纤维细胞生长因子、转化生长因子茁、ET鄄1和血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂1等。当前的试验设计在体外采用siRNA使血管平滑肌细胞AP鄄1

活性丧失、来抑制其下游多个基因，实现了多基因联在很大合治疗的目的。siRNA作为细胞内源性基因，程度上具有调节物质的低毒性和特异性，而且它比寡核苷酸、核酶有更强的基因沉默效率。siRNA速度发展成为基因治疗的一种新方法。我们证实基因siRNA转染的血管平滑肌

、，72

细胞经48h孵育RT鄄PCR检测色分析琢鄄SM鄄actin，结果发现后h后Westernblot检测琢鄄SM鄄actin，同时免疫荧光染

表达呈动态变化，在收缩表型平滑肌细胞中呈优势变为长梭形，环绕排列呈明显的管腔样生长，VSMC表型改变极其显著，细胞由原来的多边形转mRNA表达明显增强，平滑肌特异性分化标志

基因siRNA转染

mRNA表达明显降低，同时原代培养大鼠

蛋白琢鄄SM鄄actin表达上调，说明细胞由合成表型逆转为分化表型。琢鄄SM鄄actin是VSMC分化早期表达的标志性蛋白，当细胞处于分化表型，琢鄄SM鄄actin表达上调，血管损伤处于去分化表型的VSMC大量增殖和迁移时，琢鄄SM鄄actin表达下调［8］。本实验观察到VSMC分化过程中，表达上调。

我们用

siRNA能诱导琢鄄SM鄄actin

基因siRNA转染的血管平滑肌细

胞，72h后Westernblot检测bFGF及ET鄄1蛋白表达也达到预期的降低，而且细胞迁移速度减慢。研究发现，VSMC的迁移主要发生在G1后期［9］。bFGF

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第8期张宏伟等.基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型及迁移的影响

窑695窑

也能使细胞从G1既能使VSMC由G0期进入G1期，

期进入S期。bFGF也是一种细胞分化抑制因子，它可通过

和

基因介导，抑制VSMC由合成型

［2］FireA，XuS，MontogonieryMK，eta1.Potentandspecificgenetic

Nature，1998，39l（6669）：806-81l.

interferencebydouble鄄strandedRNAinCaenorhabditiselegans［J］.

向收缩型转化，从而促进VSMC的增殖。在血管活性物质中，ET鄄1是强力的有丝原之一。离体和在体实验发现，ET鄄1和内皮素受体表达的增加能促使VSMC由中膜向内膜移行并致增生。正常情况下收缩型VSMC向合成型转化是VSMC增生的先决条件。结果提示，如能阻止VSMC表型的转变，就能阻止VSMC的增殖；阻止体内有丝原的作用亦能阻止VSMC的过度增殖。VSMC增殖和移行是移植血管狭窄的关键，我们采用术有效地抑制的表达，这充分说明基因siRNA技及及其的下游基因［3］BernsteinE，CaudyAA，HammondSM，eta1.Roleforabidentateri原

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基因在平滑肌细胞迁移和表型转换中起重要作用，且协调其下游大量的增殖、分化、迁移的相关基因。综上所述，我们证实siRN粤干扰成功地抑制下游基因、的表达，增强琢鄄SM鄄actin和蛋白表达，促**阻止平滑肌细胞迁移，滑肌细胞分化，使细胞迁移速度减慢，为再狭窄的防治提供了新思路。参考文献：

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赵传胜）

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