Clark氧电极生物传感器的研究及分析应用
【摘要】：生物传感器是一类特殊的化学传感器,它以生物活性单元(如酶、抗体、核酸、细胞、组织等)作为生物敏感元件,对被测目标物具有高度选择性的检测器。它通过各种物理、化学型信号转换器捕捉目标物与敏感元件之间的反应,然后将反应的程度用离散或连续的电信号表达出来,从而得出被测物的浓度。与传统的分析方法相比,生物传感器这种新的检测手段具有如下优点:(1)选择性好;(2)响应快;(3)成本低;(4)可连续在线监测。Clark氧传感器具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、分析速度快等优点,将酶或细菌生物活性单元与Clark氧传感器相结合,在生化分析等领域具有广泛的应用前景。本文以生物相容性好的高分子物质如鸡蛋膜、壳聚糖和聚乙烯醇作为载体材料,以半乳糖氧化酶、乙醇氧化酶和甲烷氧化细菌为分子识别元件,用适当的交联剂分别固定在载体基质上,并与Clark氧电极(电化学换能器)相结合,制备简单、快速、灵敏的几种基于耗氧反应的酶和细菌的生物传感器。通过优化实验条件,分别建立了测定半乳糖、乙醇和甲烷的分析方法,并将其应用于实际样品中半乳糖、乙醇的分析测定。第一章:主要综述了生物传感器的特点、研究现状及其应用。第二章:以戊二醛为交联剂,将半乳糖氧化酶共价交联固定于鸡蛋壳膜载体上,基于半乳糖氧化酶能催化半乳糖的氧化反应,利用Clark氧电极构建了半乳糖生物传感器,通过氧浓度的变化间接测定半乳糖,并对实验条件、电极的响应特性、可能存在的干扰物进行了考察。实验结果表明,用于半乳糖测定的最佳实验条件为:底液磷酸缓冲溶液浓度为74mM,pH=7.0,实验温度为室温。该传感器的平均响应时间为
100
秒,半乳糖浓度在
1.0×10~(-4)—8.5×10~(-3)mol/L呈良好的线性关系(r~2=0.9984),以信噪比的3倍计算传感器的检出限为5.0×10~(-5)mol/L,相对标准偏差为3.74%(n=7),连续使用3个月后,响应值降为初始值的83.6%。实际样品中可能存在的干扰物对测定无干扰,并进行了回收实验。结果表明,此种传感器具有选择性高,重现性好,操作简便,干扰少,检测速度快,使用寿命长等优点,对于食品和临床的半乳糖检测具有重要的意义。第三章:在氧气存在下,乙醇氧化酶
可催化氧化乙醇生成乙醛和过氧化氢,氧浓度的变化可引起Clark氧电极电流信号的改变。基于上述原理,以壳聚糖为交联剂,将乙醇氧化酶固定于新鲜鸡蛋壳膜上,将固定有酶的鸡蛋膜紧贴于Clark氧电极表面设计出一种简便、快速、灵敏和稳定性高的乙醇生物传感器。并对实验条件、电极的响应特性、可能存在的干扰物及实际样品进行了考察。实验结果表明,酶的固定化及样品测定的最佳实验条件为:壳聚糖浓度为0.50%(w/v),乙醇氧化酶的最佳用量为1.0mg,底液磷酸缓冲溶液浓度为25mM,pH=7.4,实验温度为室温。该传感器的平均响应时间为1分钟,乙醇浓度在6.0×10~(-5)-8.0×10~(-4)mol/L呈良好的线性关系(r~2=0.9988),该传感器的检出限为3.0×10~(-5)mol/L,RSD为3.20%(n=11),连续使用3个月后,响应值降为初始值的86.6%。在干扰测定中只有甲醇、正丙醇、正丁醇表现出一定形式的干扰,实际样品中其它可能存在的干扰物对测定无干扰。并对酒样品中乙醇含量进行了测定和回收实验,结果满意。第四章:甲烷氧化细菌能在室温下催化氧化甲烷,并在催化过程中消耗氧。采用聚乙烯醇将甲烷氧化细菌固定化,并与Clark氧电极结合设计出一种简便,快速,灵敏的生物传感系统。并对实验条件、传感系统的响应特性等进行了考察。实验结果表明,细菌的固定化及甲烷测定的最佳实验条件为:聚乙烯醇浓度为0.50%(w/v),细菌的最佳用量和比率分别为40mg和1∶1。底液磷酸缓冲溶液的pH=7.0,实验温度为室温。建立了甲烷测定的生物传感新方法。该方法的平均响应时间为100秒,甲烷浓度在1%-5%(v/v)呈良好的线性关系(r~2=0.9912),RSD为3.10%(n=8),检测限(S/N=3)为0.3%(v/v)。连续使用1个月后,响应值降为初始值的50.0%。第五章:结合在不同高分子材料上酶与细菌的固定化包括在蛋壳膜上用戊二醛固定半乳糖氧化酶、壳聚糖固定乙醇氧化酶、以及聚乙烯醇固定甲烷氧化细菌,初步探讨了固定化机理。第六章:合成了一种对甲烷具有选择性吸附的传感膜材料(穴番A)。以香草醛为原料,在乙醇溶液中和1,2-二溴乙烷反应生成1,2-二(4-甲酰-2-甲氧基苯氧基)乙烷,再依次对其进行硼氢化和质子化,三步合成笼状超分子主体化合物穴番-A。产物通过硅胶柱分离纯化后用核磁光谱对其进行了分析鉴定,并且用荧光和紫外光谱对它的发光性能进行了研究。【关键词】：生物传感器Clark氧电极半乳糖乙醇甲烷穴番
A
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：TP212.3
【目录】：中文摘要12-15ABSTRACT15-19第一章绪论19-491引言19-202生物传感器的基本组成、工作原理、分类及特点20-213生物传感器中生物组分的固定化方法21-223.1化学方法21-223.2物理法224生物传感器研究进展22-284.1酶传感器22-254.2微生物传感器25-274.3免疫传感器274.4电化学DNA传感器27-285生物传感器的应用28-335.1在医学领域的应用28-305.2在发酵生产中的应用305.3在食品分析中的应用30-325.4在环境监测中的应用32-336本论文的立题背景和主要内容33-376.1本论文研究意义33-356.1.1电化学换能器-Clark氧电极33-346.1.2固定化材料34-356.2本论文研究的主要内容356.3本论文的主要创新点35-37参考文献37-49第二章半乳糖生物传感器的研究及分析应用49-631引言49-502实验部分50-512.1仪器与试剂502.2半乳糖生物传感器的制备502.3样品处理50-512.4测定方法513结果与讨论51-583.1半乳糖传感器的响应行为51-523.2不同缓冲体系的影响52-533.3缓冲溶液pH的影响533.4缓冲溶液离子强度的影响53-543.5温度的影响54-553.6传感器的分析性能55-563.7干扰测试56-583.8回收实验584结论58-59参考文献59-63第三章乙醇生物传感器的研究及分析应用63-811引言63-2实验部分-652.1仪器和试剂2.2样品的预处理2.3乙醇氧化酶的固定化2.4固定化酶膜扫描电镜表征-652.5乙醇生物
传感器的制备和乙醇的测定方法653结果与讨论65-753.1壳聚糖固定乙醇氧化酶65-663.2乙醇生物传感器的响应行为66-673.3壳聚糖和酶用量的影响67-683.4交联剂的影响68-693.5缓冲溶液pH的影响693.6温度的影响69-703.7乙醇生物传感器的分析性能70-713.8稳定性研究713.9干扰测试71-743.10样品分析74-754结论75-76参考文献76-81第四章甲烷微生物传感系统的构建及分析应用81-991前言81-832实验部分83-862.1实验材料832.2试剂和培养基的配制83-842.3细菌培养842.4形态观察84-852.5菌体大小的测定852.6细胞收集852.7PVA-硼酸交联法固定甲烷氧化细菌85-862.8甲烷微生物传感系统的组装和甲烷的测定863结果讨论86-943.1甲烷氧化细菌的菌落特征86-873.2甲烷氧化菌的个体细胞特征87-3.3甲烷氧化细菌菌体大小的测定3.4对甲烷利用情况的测试3.5甲烷微生物传感系统的响应行为-903.6NaCl的影响90-913.7甲烷氧化细菌的数量的影响913.8缓冲溶液pH的影响91-923.9温度的影响92-933.10甲烷微生物传感系统的分析性能933.11稳定性研究93-944实验结论94-95参考文献95-99第五章生物传感器固定化机理探讨99-1111酶的组成和结构特点992酶的失活机理993酶的稳定化99-1004酶固定化类型100-1024.1吸附法1014.2共价键固定法101-1024.3交联法1024.4包埋法1025酶固定化载体102-1095.1半乳糖氧化酶交联固定于鸡蛋膜上的固定化机理探讨103-1045.2乙醇氧化酶交联固定于鸡蛋膜上的固定化机理探讨104-1055.3聚乙烯醇固定甲烷氧化细菌的机理探讨105-109参考文献109-111第六章新型甲烷吸附材料─穴番A的合成及光谱表征111-1191引言111-1122实验部分112-1142.1试剂与仪器112-1132.2合成路线113-1143结果与讨论114-1163.1~1HNMR谱图解析114-1163.2紫外和荧光光谱11结论116-117参考文献117-119总结与展望119-122总结119-121展望121-122攻博士学位期间发表论文和所获奖励122-123附录:已发表论文首页123-124个人简历及联系方式124-125致谢125-126附件126-130 本论文购买请联系页眉网站。
