双柱双泵高效液相色谱－电化学检测法测定尿中儿茶酚胺袁倚盛赵飞浪杨巷菁沈敏（南京军区总医院中心仪器分析科）儿茶酚胺类（ＣＡｓ）化合物是人体内重要的生理活性物质，主要包括肾上腺素（Ｅ）、去甲肾上腺素（∟ＮＥ┘岸喟桶（ＤＡ）Ｄ蛑ＣＡｓ的水平不仅可作为嗜铬细胞瘤等疾病的诊断标准［，２］而矣肷龉δ芄叵得芮校此具有重要的临床诊断和研究价值［］图ＣＡｓ在体液中含量低，以往用萤光分光光度法只能测Ｅ和ＮＥ的总量，无法测ＤＡ。采用ＨＰＬＣ－ＵＶ法虽能分别测定上述三种物质［］，槊舳鹊停荒艽锏郊觳馍的目的。本法采用国产仪器组成双柱双泵的高效液相色谱－缁Ъ觳庀低常℉ＰＬＣ－ＥＤ）芍苯硬饽蛑械腅ＥＮＥ虳ＤＡ灵敏度高、操作简便快速、结果准确等特点。Ｅ、ＮＥ和ＤＡ的回收率均达９０％以上，线性范围１．６７－３３．３ｎｇ／ｍｌ钚】杉觳８０ｐｇ／ｍｌ，日内误差与日间误差的Ｃ分直别小于６％和１５％。实验部分（一）仪器、试剂与标准溶液ＷＧＰ－５型微量高压平流泵（杭州之江科学仪器厂），ＹＳＢ－２型平流泵（上海科学仪器厂）。ＹＰ－１０１型液相色谱仪电化学检测馄器（江苏江宁分析仪器厂）；７１０５型六通平面进样阀（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ，．Ｓ．Ａ．），琄Ｋ－５０１通平面进样阀（上海科学仪器厂）。φ４．６２００ｍｍ不锈钢柱（大连色谱开发中心），内填ＹＷＧ－Ｃ１８（１０ｍ）；２４ｍｍ不锈钢柱（自制），内填酸性氧化铝２００目以上）。ＥＮＥ及ＤＡＦｌｕｋａ，瑞士）；酸性氧化铝（色谱用，上海五四农场化学试剂厂）；Ｔｒｉｓ（三羟甲基氨基甲烷，上海生化试剂商店）；其余试剂均为分析纯。本法中水溶性试剂均用亚沸蒸馏水配制。１１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ缓冲液（ｐＨ８６）：Ｔｒｉｓ１２１．２ｇ，ＥＤＴＡ－２Ｎａ２０ｇ加水至１０００ｍｌ。用ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ调ｐＨ为８．６。ＣＡｓ标准溶液：精密称取Ｅ、ＮＥ和ＤＡ各１．００ｍｇ置同一容量瓶（１００ｍｌ）中，加０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ至刻度，避光４℃存放。（二）双柱双泵的ＨＰＬＣ－ＥＤ系统该系统由双泵、双柱（一个分析柱，一个氧化铝柱）及双阀组成。其流程图参见图哂１。样品由阀进入特制大体积（１．６ｍｌ）取样管后，切换阀，流动相样品送入阀Ⅱ中的微型ＡＯ２ｌ３柱中，使ＣＡｓ吸附在氧化铝柱上，而其它杂质被清洗掉。１０分钟后，切换阀，由该流动相将吸附在氧化铝柱上的ＣＡｓ洗脱下来并带入分析柱。流动相的流速均为１．０ｍｌ／ｍｉｎ。ＣＡｓ经分析柱分离后被ＥＤ检测。分析完毕后，用水清洗氧化铝柱至中性，以备下次进样。ＥＤ的极化电压为０．７７８Ｖ，灵敏度：２５０或２１００ｍＶ。（三）样品收集与处理２４小时总尿：第一次留尿后即加入６ｍｏｌ／ＬＨＣｌ １０ｍｌ作为防腐剂、稳定剂，测其总量后取１０ｍｌ置４℃备用。长期保存应置低温冰箱中。取上述尿液（ｐＨ３．５左右）４．０ｍｌ，加醋酸乙酯４．０ｍｌ振荡３分钟，离心１０分钟（２５００ｒ／ｍｉｎ）。取下层液体０．５ｍｌ，加水镅１．５ｍｌ，１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ缓冲液１．０ｍｌ，混煸匀后进样。结果与讨论但ＣＡｓ在碱性条件下易氧化，因此Ｔｒｉｓ缓冲液必须在进样前加入。（二）线性范围与最小检测量（一）氧化铝柱的使用及注意事项目前国外报道尿中ＣＡｓ测定方法大多采用氧化铝或离子交换树脂对尿样进行预处理［４］。前一方法不能除净干扰物质，而且在浓度１．６７－３３．３ｎｇ／ｍｌ范围内，峰高与浓度呈良好的线性关系（ｒ均为０．９９８。本法最低可检测８０ｐｇ／ｍｌ。（三）回收率与精度回收率偏低（７０％以下）后一方法虽能除去干扰物质，但大多回收率低（３０４０）。此外，这些方法的操作手续繁琐，耗费较多时间。采用本系统后，将氧化铝处理过程放到色谱线上（ｏｎ－ｌｉｎｅ）进行，即简化了处理过取正常人尿液进行回收率及精度试验。回收率按下式计算。日内误差及日间误差之ＣＶ分别小于６％和１５（表１）。程，又除去了干扰物质，同时提高了回收率，降低了最小检测量。色谱图见图２。氧化铝对ＣＡｓ的吸附在ｐＨ８．６时最佳［４］，故样品中亦加入１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ缓冲液。Ｓ：标准品峰高，ＳＭ：尿样中加标准品所测峰高，Ｂ：空白尿峰高。（四）尿样测定结果用本法测定了２２例正常人尿样，结果与表１ 尿ＣＡｓ分析的精度及回收率文献值（ｎ＝１５）基本一致（表２）。本文测得ＤＡ值范围较大，系未控制受试者ＮａＣｌ摄入量所致，ＤＡ与尿Ｎａ关系密切，正在研究之中。（１０），７７０（１９８６）．在临床样品分析中，检测出嗜铬细胞瘤［４］张惠，药学学报，１８（１），６８（１９８３）．［５］Ｔ．Ｐ．Ｍｅｙｅｒ，Ｎ．Ｓ．Ｊｉａｎｇ，Ｇ．Ｍ．Ｔｙｃｅ ｅｔ ａｌ．，或肾病患者中ＣＡｓ异常者，病例见表３。Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２５（２），２５６（１９７９）．（收稿日期，１９８６年１１月２８日）表２ 正常人尿ＣＡｓ测定结果（ｍｏｌ／Ｌ ２４ｈｒ）Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｉｕｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｅｌｅｃｔｒｏ－ＣｈｅｍｉｃａｌＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｄｏｕｂｌｅ Ｃｏｌｕｍｎ－Ｄｏｕｂｌｅ Ｐｕｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｙｕａｎ Ｙｉｓｈｅｎ，Ｚｈａｏ Ｆｅｉｌａｎｇ，Ｙａｎｇ Ｘｉａｎｇｊｉｎｇａｎｄ ｅｎ ｉｎ，Ｄｐａｒｔｍｅｎｔ ｏＩｓｔｒｕｍｅｎｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓ，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉａｌ ｏＮａｎｊｉｎｇ Ｃｏｍｍａｎｄ，ＰＬＡＡｎ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔａｇｓａｐｈｙ－ｅｌｅｃｔｒｏ－ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ （ＨＰＬＣ－ＥＣＤ） ａｓｓｅｍｂｌｙｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｔｗｏ ｐｕｍｐｓ ａｎｄ ｔｗｏ ｃｏｌｕｍｎｓ ｈａｓ ｂｅｅｎｕｓｅｄ ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｃａｔｅｃｂｏｌａｍｉｎｅｓ表３ 尿ＣＡｓ异常者举例（ＣＡｓ）ｉｎ ｕｒｉｎｅ．Ｓａｍｐｌｅｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｐｕｍｐｅｄ ｉｎｔｏｃｏｌｕｍｎ （２４ｍｍ） ｐａｃｋｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｉｄ ｗａｓｈｅｄａｌｕｍｉｎａ （２００ｍｅｓｈ） ｗｅｒｅ ｃｌｅａｎｅｄ ｕｐ ｂｙ ｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ ．ＣＡｓ ａｂｓｏｒｂｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｌｕｍｉｎａ ｗｅｒｅｔｈｅｎ ｅｌｕｔｅｄ ｂｙ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｉｃａｌｃｏｌｕｍｎ．ｃｏｌｕｍｎ（ＹＷＧ－Ｇ１８，１０ｍ，４．６×２００ｍｍ）．ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ：０．０２１ｍｏｌ／Ｌ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ－００４７ｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ－００６０ｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ５％ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ ８．６，ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ：００２１ｍｏｌ／Ｌ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ－００４７ｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ－参考文献０．０６０ｓｍｏ１／Ｌ ｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ－５％ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ４．５，Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ ｉｓ ｃａ．８０［１］Ｒ．Ｋ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．Ｓｏｌｅ，Ａ．Ｄ．Ｂａｉｎｅｓ ｅｔｐｇ／ｍｌ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＣＡｓ ｆｒｏｍ ｕｒｉｎｅ ｗａｓ ｍｏｒａａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４２，２６１（１９８２）．ｔｈａｎ ９０％．Ｔｈｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａ－ａｎｄ ｉｎｔｅｒ－［２］Ｒ．Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ａ．Ａ．Ｂｅｖｅｒｌｉｅ，Ｒｅｎａｌａｓｓａｙ ｗｅｒｅ ｉｔｈｉｎ ６％ａｎｄ １５％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅＰｈｙｓｉｏｌ．，８，１５０（１９８５）．ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ［３］商振华、方树华、陈洪薇等，分析化学，１４ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ．非水反相高效液相色谱法测定血清中维生素Ｅ、Ａ醋酸酯及Ａ醇含量卓海通（南京军区南京总医院）人体中ＶＥ和ＶＡ的浓度与生长、发育和血清中ＶＥ、ＶＡ的含量，国外虽有报道［１，２］，疾病有密切的关系。监测血清维生素浓度对但国内报道很少。维生素缺乏症的诊断和治疗有重要意义。本法可用于血、尿及组织等生物样品和药物制实验部分剂的维生素浓度测定。采用ＣＨ３ＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（一）仪器、试剂和条件二元溶剂作流动相，在微型柱上分析，具有贝克曼３４４Ｍ型高效液相色谱仪，１６５ＵＶ分离度好、灵敏度高、洗脱完全、分析时间检测器，双波长检测，１２９２，２３２４ｎｍ，灵短和节省溶剂等优点。用ＨＰＬＣ法同时测定敏度：０．０２ＡＵＦＳ，ＤＢ４１双笔记录仪，纸
