微生物的实验室培养(5年15考)
(2013新课标全国Ⅱ卷、四川理综、江苏卷，北京卷、浙江、山东，天津)
一、培养基
1概念：按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质
1一般都含有水、、无机盐、碳源、氮源2．营养构成
2还需满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及O2的要求
3．培养基的种类及用途
划分 标准 培养基 的种类 液体培养基 物理性质 固体培养基 化学成分 天然培养基 合成培养基 成分不明确的天然物质 培养基成分明确 培养基中加入某种化学物选择培养基 质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长 半固体培养基 加凝固剂，如琼脂 特点 不加凝固剂 用途 工业生产 观察微生物的运动、鉴定 微生物的分离与鉴定、活菌计数、菌种保藏 工业生产 分类、鉴定 培养、分离出特定微生物(如在培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素；在培养金黄色葡萄球菌时，可在培养基中加入高浓度的食盐等) 鉴别不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基检测饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽) 用途 根据微生物的代谢特点，在鉴别培养基 培养基中加入某种指示剂或化学药品 特别提醒 自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同： ①自养微生物所需的碳源、氮源来自含碳、含氮的无机物，而异养微生物需要的碳源、氮源来自含碳、含氮的有机物，因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。②含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源，也能作为能源物质，提供能量，如NH3既作为硝化细菌的氮源也作为能源。 二、无菌技术
特点：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死
1．消毒 物体表面或内部的部分微生物不包括芽孢和孢子常用方法：煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法特点：指使用强烈的理化因素杀死物体内外
2．灭菌 所有微生物包括芽孢和孢子
常用方法：灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
3．消毒和灭菌比较
比较 理化因素的作用强度 消毒 灭菌
较为温和 强烈 消灭微生物的数量 部分生活状态的微生物 全部微生物 芽孢和孢子能否被消灭 不能 能 三、微生物的纯化培养及菌种的保藏 1原理:在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。 2．制备固体培养基的流程计算―→称量―→溶化―→灭菌―→倒平板 3．纯化大肠杆菌的方法
常用的微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
(1) 平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培
养基的表面。(如下图示)
(2)稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。( 如下图所示)
①系列稀释操作(如下图所示) ②涂布平板操作(如下图所示) (3)两种纯化细菌的方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法 优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征 缺点 不能计数 吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延 适用范围 适用于好氧菌 适用于厌氧菌和兼性厌氧菌 4.培养：接种后的培养皿放入恒温箱内培养 5．菌种保藏 (1)临时保藏
操作：采用固体斜面培养基，菌落长成后，放入4 ℃冰箱中保藏，以后每3～6个月，转移一次新的培养基
缺点：保存时间不长，菌种易被污染或 产生变异
(2)长期保存法：甘藏法，放在－20_℃下保存 特别提醒 (1)配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项
①倒平板的适宜温度是50 ℃左右，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
②平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 (2)平板划线操作的注意事项
①第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环。
②灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。 ③划线时最后一区不要与第一区相连。
④划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
微生物培养与分离的考查
1．(·江苏)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是( )。 A．培养基分装到培养皿后进行灭菌 B．转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线 C．接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养 D．培养过程中每隔一周观察一次
解析 本题考查微生物的分离和培养过程中的操作要求和培养条件等相关知识，意在考查考生的知识运用能力和实验处理能力。培养微生物的过程中应先灭菌再倒平板，A错误；每一次划线前都要进行接种环的灼烧灭菌，B正确；接种后的培养皿应在恒温培养箱中进行培养，光照会影响温度等条件；培养过程中观察间隔的时间一般不超过24 h。 答案 B
微生物实验室培养的拓展应用
2．(·新课标全国Ⅱ理综)临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。 回答下列问题：
(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用____________法或____________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。
(2)取该单菌落适当稀释，用__________法接种于固体培养基表面，在37 ℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。
(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A____________；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B____________；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明____________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的____________________________________________________。
(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好选用抗生素__________。
解析 (1)在微生物的培养过程中，常用来分离微生物的方法是稀释涂布平板法或平板划线法。(2)为了使微生物在培养基上能够均匀分布，一般用稀释涂布平板法将微生物接种在培养基上。(3)在抗药性检验过程中，如果在菌落周围出现透明圈，说明此种抗生素可抑制该细菌；透明圈的大小表示此种抗生素抗菌效果的强弱。据此可判断抗菌效果强弱依次是A、C、B；D的透明圈中出现了一个菌落，说明该菌落对此种抗生素具有耐药性。
答案 (1)平板划线 稀释涂布(或涂布)平板 (2)稀释涂布平板(涂布) (3)敏感 不敏感 该致病菌对C的敏感性比对A的弱 耐药菌 (4)A 归纳比较
1．培养基的配制原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需pH不同。 2．培养基的营养构成
(1)各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐； (2)不同培养基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 3．微生物和动植物营养要素的比较
项目 动物 碳源 糖类、脂肪等 糖类、脂肪、醇、 有机酸等 氮源 蛋白质或其降解物 蛋白质或其降解物、铵盐、盐、N2等 NH3、铵盐、盐等 CO2、碳酸盐等 铵盐、盐 能源 同碳源 同碳源 都需要，种类及功能氧化无机物或利用光能 光能 基本相同 无机盐、水 异养型自养型 微生物绿色植物 32. (8分)农业生产上有一种广泛使用的除草剂在土壤中不易被降解，长期使用会污染土壤。为修复被污染的土壤，可按图示程序选育出能降解该除草剂的细菌。已知该除草剂(含氮有机物)在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明。
A B C D
(1) 微生物接种是微生物学研究中最常用的基本操作技术，该技术的核心是________，应该在________旁完成。图中B、C所示操作的目的是将聚集的菌种逐步________。
(2) 在选育过程中，应将土壤浸出液接种于以________为唯一氮源的固体培养基上。为了筛选出高效的目的菌，可比较单菌落周围透明圈的大小。实验结果如右图显示的A～E五种菌株中，________是最理想菌株。
(3) 若想对初步筛选得到的目的菌进行纯化并计数，可采用的接种方法是________。对分离的细菌数目统计时，统计的菌落数目往往比活菌的实际数目________。
(4) 操作过程中有三种材料或用具需要消毒或灭菌：①培养细菌用的培养基与培养皿；②操作者的双手；③玻棒、试管、烧瓶和吸管。其中需要灭菌的是________。(填序号) 32. (8分)
(1) 无菌操作 酒精灯火焰 稀释获得单个菌落
(2) 该除草剂 E (3) 稀释涂布平板法 少 (4) ①③ 【微生物培养】 35．（15分）
I．下表所示为某微生物培养基的配方，请回答：
（1）依物理性质划分，该培养基属于_________培养基；依用途划分，则属于_________培养基。 （2）依培养基的成分，所培养微生物的同化作用类型是_________。
（3）如要鉴定自来水中的大肠杆茵是否超标，至少要加入_________、_________和_________，除去
_________。 I．（1）液体 选择 （2）异养 （２分） （3）琼脂 伊红和美蓝 青霉素（２分） 【微生物培养】 33．（8分）土壤中含有大量的难溶性磷酸盐，为了从土壤中筛选出能够将难溶性磷酸盐转化为植物能吸收的可溶性磷的优良解磷菌株，以便将其添加到有机肥中，改善植物磷元素供应。科研人员进行如下实验：
实验原理：固体培养基中难溶性磷酸盐在微生物的作用下溶解，会在菌落周围形成透明圈（如右图），
透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）代表微生物溶解磷的能力大小。 实验步骤：
步骤1 取某地区土样5g制得土壤溶液后稀释，取稀释液1mL接种到基础培养基A上，在适宜温度下培
养72h。 透明圈直径 菌落直径 菌株 D/d 步骤2 在基础培养基A上用接种环挑取代表性菌落再次（D） （d） 接种，培养3～4d后观察菌落特征和透明圈的大
M-3-01 18.8 12.3 1.5 小，初步筛选出三种优良解磷菌株（如右表）。
B3-5-6 20.7 9.1 8.0 6.5 2.6 1.4 分析回答：
（1）从物理形态看，培养基A属于 培养基。培养基中磷源应该是 。
T1-4-01 （2）步骤1中接种方法是 ，步骤2中接种环的灭菌方法是 。 （3）根据实验结果可以确定溶解磷能力最强的菌株是 。 （4）为进一步测定初步筛选的三种菌株实际溶解磷的能将它们接种到基础培养基B中，并在37℃、200 r·min-1 摇取上清液，测定溶液中可溶性磷含量，得到右图所示曲线。 ①用摇床进行培养的好处是 。
②结果表明最优良的解磷菌株是 。
33.（8分，除特殊注明外，每空1分）
（1）固体 难溶性磷酸盐 （2）稀释涂布平板法 灼烧 （3）B3-5-6
（4）①增加培养液中的溶氧量；使菌株与培养液充分接触，有利于物质的交换（2分）
②M-3-01
【微生物培养】高考及模拟题
31.(8分)人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃,可用来发酵处理秸秆,提高秸秆的营养价值。 为了增强发酵效果,研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株,并对其降解纤维素能力进 行了研究。请回答下列问题:
(1)在样品稀释和涂布平板步骤中,下列选项不需要的是 _________ (填序号)。 ①酒精灯 于培养皿 ③显微镜 ④无菌水
(2)在涂布平板时,滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是 _________ 。 (3)向试管内分装含琼脂的培养基时,若试管口粘附有培养 基,需要用酒精棉球擦净的原因是 _________ 。
(4)刚果红可以与纤维素形成红色复合物,但并不与纤维素降 解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚 果红培养基平板上,筛到了几株有透明降解圈的菌落(见
右图)。 图中降解圈大小与纤维素酶的 _________ 有关。 图中 降解纤维素能力最强的菌株是 _________ (填图中序号)。
(5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4,在不同温度和pH条件下进行发酵, 测得发酵液中酶活性的结果见下图,推测菌株 _________ 更适合用于人工瘤胃发酵, 理由是 _________ 。
力，研究人员床培养，定期
31.(8分)
(1)③ (2)培养基表面的菌悬液会出现积液,导致菌体堆积,影响分离效果 (3)避免培养基污染棉塞 (4)量与活性 ①
(5)J4 发酵过程会产热和产酸,J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高
