第３Ｏ卷第２期 ２０１２年３月 北京工商大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏ１．３０ ＮＯ．２ Ｍａｒ．２０１２ ２７ 文章编号：１６７１—１５１３（２０１２）０２—００２７—０８ 食品中磺胺类药物化学发光酶联免疫检测 试剂盒的初步研究 万宇平， 吴 鹏， 冯月君， 罗晓琴， 韩京朋 （北京勤邦生物技术有限公司，北京 １０２２０６） 摘 要：在常规酶联免疫法的基础上，将磺胺类母核与牛血清白蛋白合成免疫抗原后免疫小鼠制 得磺胺类单克隆抗体，并进一步优化抗体工作浓度、反应时间等实验参数，建立了一种简便、快速、 精确的磺胺类残留一步式化学发光酶联免疫检测方法．结果表明该方法最佳检测范围为１．０～ ８１．０ ｎｇ／ｍＬ，检测ＩＣ 。达３．０４７ ｎｇ／ｍＬ，对猪肉的最低检测限为０．７４ ｎｇ／ｇ，可检出国际规定的ＳＡｓ残 留标准底限值以下的残留量．与常规ＥＬＩＳＡ方法相比，检测限和灵敏度基本一致，但反应时间缩短 了６０ ｒａｉｎ．证明采用一步式化学发光酶联免疫检测磺胺类残留可以大幅度缩减检测时间，符合快 速检测的要求． 关键词：兽药；检测技术；磺胺类；化学发光酶联免疫法；试剂盒 中图分类号：ＴＳ２０１．６ 文献标志码：Ａ 磺胺类药物（ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅｓ，ＳＡｓ）的基本结构为 对氨基苯磺酰胺，具有芳氨基和磺酞胺基，多为两性 物残留会随着食物链最终蓄积在人体内，从而影响 人体的健康。。 ．因此，国内外对磺胺类药物残留均 有限量要求，我国以及美国、欧盟等国家规定动物性 化合物，药物具有一定酸性 ．磺胺类药物的抑菌 作用机理是磺胺类药物中能分解出对氨基苯磺酰 胺，其分子的大小和形状与组成叶酸中的对氨基苯 食品中总磺胺以及单个磺胺的最高残留限量（ｍａｘｉ— ｍｕｍ ｒｅｓｉｄｕｅ ｌｉｍｉｔ，ＭＲＬ）为０．１ ｍｇ／ｋｇ，其中磺胺二 甲基嘧啶（ＳＭ，）的ＭＲＬ为０．０２５ ｍｇ／ｋｇＨ ． 甲酸相近，化学性质也类似．由于细菌对二者缺乏 选择性，大量的对氨基苯磺胺替代了对氨基苯甲酸 而被细菌吸收，干扰细菌叶酸的合成而影响其生长 繁殖，从而可抑制大多数革兰氏阳性菌和某些阴性 目前，针对磺胺类兽药残留的检测方法有薄层 色谱（ｔｈｉｎ—ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＬＣ）、高效液相色 谱（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ） 法、液质联用（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ— ｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ，ＨＰＬＣ／ＭＳ）、气相色谱（ｇａｓ ｃｈｒｏ— ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＧＣ）、酶联免疫吸附（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍ— ｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）和毛细管电泳（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ 菌．磺胺类药物应用较广，具有一定疗效的就有几 十种 ． 磺胺类药物在动物疾病的防治方面具有显著的 疗效，例：针对动物的肠炎、乳房炎、肺炎、脑膜炎等 疾病．因此磺胺类药物作为兽药和饲料添加剂，在 ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＨＰＣＥ）法等 ．由于复 食源性动物的饲养中被广泛应用 ．同时，这类药 物具有显著的毒副作用，影响人的泌尿系统功能，引 起结晶尿、血尿、尿痛、尿少等症状，或产生一些皮 杂的仪器设备和繁琐的前处理过程，仪器分析方法 不适合现场监控和大量样本的筛选，其中ＥＬＩＳＡ方 法作为一种新型的动物源性食品中磺胺类药物残留 筛选方法已被使用，并且ＥＬＩＳＡ法在稳定性和准确 度方面存在着一定的局限性，大部分只能针对磺胺 炎、发热等过敏反应以及致癌性作用 。 ．如果这 类药物不按规定或要求使用与停药，动物体内的药 收稿日期：２０１１—１０—２４ 作者简介：万宇平，男，北京勤邦生物技术有限公司副总经理兼研发总监，主要从事食品安全快速检测技术方面的研究 ２８ 北京工商大学学报（自然科学版） ２０１２年３月 类其中一种或者少数几种药物进行检测，不利于磺 胺类药物的全面检测 ． 化学发光免疫检测方法具有特异性强、稳定快 速、检测范围宽、操作简单、自动化程度高、试剂稳定 且有效期长（６～１８个月）等优点，其检测限比酶联 免疫法和理化检测方法高几个数量级 ．化学 发光进口仪器与试剂性能较好，而国外的技术垄断 导致化学发光仪、发光底物液和试剂盒价格居高不 下，而且试剂或试剂盒与仪器相匹配，进口试剂常常 不能在国产仪器中使用，造成化学发光免疫方法无 法在基层普及．化学发光底物液是化学发光酶免疫 检测方法的关键试剂，配制出低成本且性能良好，适 合国产仪器使用的的发光底物液，可降低化学发光 方法的使用成本，有利于在基层的普及．建立稳定 的化学发光酶免疫分析方法，是进行化学发光试剂 盒的研制的基础，同时对于严把食品安全的检验环 节有重要的意义． １材料与方法 １．１仪器与设备 ２０００ＳＢＬ型电子天平，美国Ｓｅｔｒａ公司；９０—２ 型磁力搅拌器，上海振荣科学仪器有限公司；微量移 液器，单道２０～２００ Ｌ、１００～１ ０００ Ｌ，多道５０～ ３００ Ｌ，美国Ｔｈｅｒｍｏ公司；ＤＳＹ—ＩＩＩ型氮吹仪，北京金 科精华苑科技有限公司；ＱＬ一９０１型漩涡混合器，海 门市其林贝尔仪器制造有限公司；Ａｎｋｅ ＴＤＬ一４０Ｂ 型低速离心机，上海安亭科学仪器有限公司；Ｃｅｎ— ｔｒｏＬＢ９６０型微孔板式发光仪，德国Ｂｅｒｔｈｏｌｄ公司； Ｏｐｔｉ．ｐｌａｔｅＴＭ型化学发光板，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ公司；ＤＨＰ ６００型生化培养箱，天津市中环实验电炉有限公司． １．２材料与试剂 鲁米诺、三（羟甲基）氨基甲烷，Ｓｉｇｍａ公司；磺 胺类药物标准品，德国Ｄｒ．Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅ公司；牛血清 白蛋白ＢＳＡ、卵清蛋白ＯＶＡ，Ｓｉｇｍａ公司；乙酸乙酯、 三乙胺、柱层析、６一氨基烟酸、柱层析、６一氨基烟酸乙 酯、４一乙酰氨基苯磺酰氯、二氯乙烷、二甲基甲酰胺， 国药集团化学试剂有限公司；辣根过氧化物酶标记 的羊抗鼠二抗，美国Ｊａｃｋｓｏｎ公司；弗氏完全佐剂、弗 氏不完全佐剂，北京望尔生物技术有限公司；其他有 关化学试剂均为分析纯． １．３其他试剂制备 １．３．１标准品溶液 以常规方法将磺胺类药物纯品用含有１０％甲 醇的０．０５ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ＝７．４的ＰＢＳ配制成浓度分 别为０．０，１．０，３．０，９．０，２７．０，８１．０ ｎｇ／ｍＬ的磺胺类 标准溶液，所属百分比为体积百分比． １．３．２酶标二抗 用洗涤溶液按照１：２ ０００的体积比将辣根过氧 化酶标记羊抗鼠ＩｇＧ配制成酶标二抗工作液． １．３．３抗体工作液 磺胺类单克隆抗体是用人工免疫抗原免疫动物 制得的单克隆抗体，将所得磺胺类单克隆抗体用洗 涤溶液稀释成１：６４ ０００的工作浓度． １．３．４鲁米诺化学发光溶液 Ａ液为鲁米诺含量为０．０１ Ｍ、对甲苯酚含量为 ０．００１ Ｍ ｐＨ＝８．８的三（羟甲基）氨基甲烷溶液；Ｂ 液为１００ ｍＬ溶液含柠檬酸２．１ ｇ，无水Ｎａ ＨＰＯ ２．８２ ｇ，０．７５％的过氧化氢脲０．６４ ｍＬ的溶液． １．３．５浓缩复溶液 ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２０ ５．７４ ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ３２．６ ｇ 溶于１ Ｌ去离子水中． １．３．６浓缩洗涤液 按体积分数０．０５％将吐温一２０添加至ｐＨ＝ ７．４，０．１ ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液中． ２试剂盒组成及其制备 ２．１试剂盒组成 磺胺类化学发光试剂盒包括：９６孔化学发光板 １块（包被有偶联抗原）；标准液６瓶（１ ｍＬ／瓶）： ０．０，１．０，３．０，９．０，２７．０，８１．０ ｎｇ／ｍＬ；高浓度标准品 （１ ｍＬ／瓶）：１ ｐ，ｇ／ｍＬ；酶标二抗１ ｍＬ；抗体工作液７ ｍＬ；鲁米诺化学发光液Ａ液６ ｍＬ、Ｂ液６ ｍＬ；２０倍 浓缩洗涤液４０ ｍＬ；２倍浓缩复溶液５０ ｍＬ． ２．２抗原的合成 ２．２．１母核半抗原合成 于２５ ｍＬ单口瓶中加入６一氨基烟酸０．８７ ｇ，乙 醇２０ ｍＬ，盐酸（１２ ｍｏｌ／Ｌ）３．７ ｍＬ，加热回流，反应 ８ ｈ，薄层色谱法（ｔｈｉｎ—ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＬＣ）监 测，反应完毕，减压除去溶剂，溶于饱和ＮａＨＣＯ，水 溶液，乙酸乙酯萃取，无水Ｎａ ＳＯ 干燥，柱层析（乙 酸乙酯／石油醚，２／１，ｖ／ｖ）纯化．于２５ ｍＬ单口瓶中 加入６一氨基烟酸乙酯０．８９ ｇ，三乙胺（Ｅｔ Ｎ）１．６ ｍＬ， ＣＨ，Ｃ１，１０ ｍＬ，搅拌溶解后，加入催化量４一二甲氨基 吡啶（４一ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎ叩ｙｒｉｄｉｎｅ，ＤＭＡＰ）．缓慢滴入含 １．５７ ｇ ４－乙酰氨基苯磺酰氯的２ ｍＬ二氯甲烷溶液， 第３０卷第２期 万宇平等：食品中磺胺类药物化学发光酶联免疫检测试剂盒的初步研究 ２９ ＴＬＣ监测，５ ｈ，反应完毕，１０ ｍＬ水洗３次，饱和食盐 水洗一次，干燥，柱层析纯化（乙酸乙酯／石油醚，１／ １０，ｖ／ｖ）．于２５ ｍＬ单口瓶中加入上述产物１ ｇ，２ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液１２０ ｍＬ，加热回流，ＴＬＣ监测， 反应１０ ｈ，反应完毕，调节ｐＨ值４～５，有固体析出， 得到磺胺母核半抗原． ２．２．２免疫原（ＳＡｓ—ＢＳＡ）合成 取１２ ｍｇ磺胺类半抗原，溶解于１ ｍＬ二甲基甲 酰胺（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆ０ｒｍａｍｉｄｅ，ＤＭＦ）中，冷却至１０℃，取 １５ ｍｇ二氯乙烷（ｄｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｎｅ，ＥＤＣ）用０．２ ｍＬ水 充分溶解后加人冷却好的磺胺类半抗原ＤＭＦ溶液 中，室温下搅拌２４ ｈ，即可得到反应液Ａ．称取ＢＳＡ ４０ ｍｇ，使之充分溶解在３ ｍＬ ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）中，将反 应液Ａ逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅 拌２４ ｈ，用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ在４℃透析３ ｄ，每天换３ 次透析液，以除去未反应的小分子物质．分装，于一 ２０℃保存备用 …． ２．２．３ 包被原（ＳＡｓ—ＯＶＡ）的合成 称取３０ ｍｇ ＯＶＡ和１２ ｍｇ磺胺母核半抗原，按 ２．２．２步骤反应，合成ＳＡｓ—ＯＶＡ，供包被用． ２．３单克隆抗体的制备 用上述制备出的免疫原（ＳＡｓ—ＢＳＡ）按１００ ｇ／ 只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积 混匀，颈背部皮下注射免疫６～８周龄Ｂａｌｂ／ｃ雌鼠， 初次免疫后第７，１４，２８ ｄ以免疫原与弗氏不完全佐 剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前３ ｄ以免疫 复合物１００ ｇ／只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次． 按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数 生长期的小鼠骨髓瘤细胞（ＳＰ２／Ｏ）混合，然后在４５ Ｓ 内缓慢加入预热的融合剂（ＰＥＧ４０００）进行融合，用 ＨＡＴ培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培 养于９６孔培养板，于３７℃，５％ＣＯ 培养箱中培养，５ ｄ后用ＨＴ培养基半换液，９ ｄ时候进行全换液，得到 杂交瘤细胞，将２～３次亚克隆建株后的杂交瘤细胞 扩大培养，收集上清液用间接ＥＬＩＳＡ测定效价，冻 存；并取８～１０周龄Ｂａｌｂ／ｃ小鼠腹腔注射液体石蜡 ０．５ ｍＬ／只，７～１０ ｄ后腹腔注射杂交瘤细胞１～２ Ｘ １０。／只，７～１０ ｄ后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定 效价，并冻存备用 ． ２．４磺胺类化学发光检测方法的建立 ２．４．１酶标板的制备 用包被缓冲液将磺胺类包被原稀释成１０ ｇ／ ｍＬ，每孔加入１００ ｔｘＬ，３７ ｃｃ温育２ ｈ，倾去包被液，然 后在每孔中加入１５０ ＩｘＬ封闭液，３７℃温育２ ｈ，倾去 孔内液体，用稀释２０倍的浓缩洗涤液洗涤１次， 拍干． ２．４．２ 确定抗原抗体最佳稀释比例 采用方阵滴定法确定包被原与单克隆抗体的最 佳工作浓度．将包被抗原按１６０．０，８０．０，４０．０， ２０．０，１０．０，５．０，２．５，１．２５￣ｇ／ｍＬ的系列稀释度包 被酶标板，将酶标磺胺类单克隆抗体按１：１ ０００，１： ２ ０００，１：４ ０００，１：８ ０００，１：１６ ０００，１：３２ ０００，１： ６４ ０００。１：１２８ ０００，１：２５６ ０００的倍数进行稀释，用常 规ＥＬＩＳＡ方法，采用方阵法确定抗原抗体的最佳稀 释比例 ． ２．４．３磺胺类化学发光酶联免疫方法标准抑制曲 线的绘制 向用磺胺类偶联包被原包被的酶标板微孔中加 入浓度分别为０．０，１．０，３．０，９．０，２７．０，８１．０ ｎｇ／ｍＬ 的磺胺类标准品溶液各５０ Ｌ，每孔加人酶标羊抗 鼠抗体５０ Ｌ，再加入磺胺类单克隆抗体工作液５０ Ｌ，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，２５℃恒温箱中反 应１５ ｍｉｎ，倒出孔中液体，重复洗板５次，拍干．每 孔加入化学发光显色液１００ Ｌ，轻轻振荡混匀，３ ｍｉｎ后用微孔板式发光仪测定每个孔的发光强度． 每个浓度的标准品溶液的发光强度平均值（ＲＬＵ） 除以第一个标准品溶液（０标准）的发光强度值 （ＲＬＵ ）再乘以１００％，得到百分发光强度值，以磺 胺类标准品浓度（ｎｇ／ｍＬ）的对数值（１ｇＣ）为 轴，百 分发光强度值为Ｙ轴，绘制标准曲线图． ２．４．４ 检测与其他药物的交叉反应率 以磺胺甲氧异恶唑作为标准，按试剂盒程序操 作，加入不同的磺胺类竞争物和非磺胺类竞争物，并 以实验所得化学发光强度值，计算抑制百分比并制 作标准曲线，根据线性方程计算各竞争物５０％抑制 浓度（ＩＣ 。）．交叉反应率（ＣＲ％）即为抗体对磺胺 甲氧异恶唑的Ｉｃ 。与抗体对竞争物的Ｉｃ 。之比的百 分数，按式（１）进行计算： 交叉反应率（ＣＲ％）＝ 抗体对磺胺类竞争物的Ｉｃ 枷……。％．～ ㈩ 。２．４．５ 猪肉中磺胺类残留检测 称取２．０±０．０５ ｇ均质物至５０ ｍＬ聚苯乙烯离 心管中，加入２００ ｔｘＬ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ，再加入３．８ ｍＬ乙腈和２ ｍＬ乙酸乙酯，立即振摇３ ｍｉｎ，４ ０００ ｒ／ ａｒｉｎ离心５ ｍｉｎ；取３ ｍＬ上清液至１０ ｍＬ干净玻璃试 ３０ 北京工商大学学报（自然科学版） ２０１２年３月 管中，于５０～６０℃水浴氮气流下吹干；加入１ ｍＬ 正己烷，用涡旋仪涡动３０ ｓ溶解干燥残留物，加入 １ ｍＬ磷酸盐缓冲液，用涡旋仪涡动１０ Ｓ后转入２ ｍＬ离心管中，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ，室温（２０～２５℃）离心５ ｍｉｎ；除去上层正己烷相，取下层水相５０ Ｌ用于 分析． ２．４．６最低检测限 取２０份不含磺胺类药物的空白猪肉样品，按照 ２．４．５步骤处理后所建立的ＥＬＩＳＡ方法进行检测． 通过标准曲线计算对应的浓度．以２０份空白样品 对应的样品浓度平均值加上３倍标准差作为样本检 测的最低检测限： 最低检测限＝ ＋３ ， （２） 式（２）中： 为２０份空白样品的平均值，Ｓ为２０份空 白样品的标准差． ２．４．７ 准确度及精密度 取磺胺甲氧异恶唑标准品分别对猪肉样品按照 １．０ ｎｇ／ｇ、２．０ ｎｇ／ｇ进行添加回收实验．分别抽取３ 个批次试剂盒进行检测，每个浓度做６个重复，每个 样品２个平行，计算准确度及精密度． ２．４．８ 试剂盒稳定性实验 取磺胺类药物化学发光试剂盒用于稳定性实验 的测定，分别放置一２０℃冰箱和３７℃温箱６ ｄ后进 行实验，比较放置前后各标准品发光强度值变化． ３ 结 果 ３．１磺胺半抗原的结构特点及其ＴＬＣ色谱 合成后的半抗原结构图如图１． 厂＝＝＝＼ ＝＝＼ Ｈ＾Ｎ ＳＯｚＮＨ ／广∞㈨ 图１ 磺胺类半抗原结构 Ｆｉｇ．１ ＳＡｓ ｈａｐｔｅｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 从合成的半抗原ＴＬＣ可以看出，在４５０ ｎｍ紫外 灯下磺胺类药物半抗原在薄层板上已经呈现出规则 的原点状，并且无拖尾现象，证明合成的磺胺类半抗 原的纯度较高，如图２． 半抗原分子中，左半边结构保持了磺胺类化合 物的共有特征结构，而因为磺胺类化合物右半边大 部分结构都是含Ｎ的杂环结构，所以在半抗原右半 边引入带羧基的吡啶环结构，从而更易产生对大部 分磺胺类化合物具有交叉反应的抗体． 注：名称为６。（４一氨基苯磺酰胺基）烟酸；薄层色谱条件为ＣＨ２ＣＩ２ 与ＭｅＯＨ的体积比为１：１；紫外显色． 图２磺胺类半抗原薄层色谱图 Ｆｉｇ．２ ＳＡｓ ｈａｐｔｅｎ ｔｈｉｎ－ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ３．２包被抗原及ＳＡｓ单抗最佳稀释倍数 经方阵法实验，根据实验得到的０ ｔｘｇ／Ｌ标准品 吸光度值（ＯＤ值）和１．０ Ｉｘｇ／Ｌ标准品ＯＤ值，计算 抑制率，结果如表１． 对于酶标仪，ＯＤ值在１～２时读数的可信度较 大，所以一般取ＯＤ值在１．５～２．０的孔所对应的包 被浓度为最佳包被浓度；另外为了试剂盒的灵敏度 和准确度考虑，一般控制抑制率在７０％～８０％，从 表１中可知，抗体、抗原包被浓度过大，ＯＤ值普遍 偏高，另外抗体浓度大或包被浓度大，也是造成不必 要的浪费．抗体浓度小或者抗原包被浓度太小，则 造成整个板显色偏低，当抗原包被浓度为１０ Ｉｘｇ／ ｍＬ，ＳＡｓ单抗稀释倍数为１：６４ ０００时，实验效果较 理想（ＯＤ值在１．５～２．０，抑制率在７０％～８０％）， 因此，确定抗原包被浓度为１０ Ｉｘｇ／ｍＬ，ＳＡｓ单抗的 稀释倍数为１：６４ ０００． ３．３竞争反应时间优化 按上述实验方法加入标准品和标记抗体后测定 室温下反应１０，ｌ５，２０，２５ ｍｉｎ后加入发光溶液，测 定０标准品的发光值，结果表明在反应１５ ｍｉｎ时， 发光值最大，因此本试剂盒选取反应时间为１５ ｍｉｎ． 结果见图３． 根据确定好的反应模式和反应时间，与常规 ＥＩＬＳＡ方法进行反应时间比较，结果见表２． 从表２可以看出，化学发光试剂盒方法比常规 ＥＬＩＳＡ方法节省时问至少４７ ｍｉｎ，最多可节省７２ ｍｉｎ． ３．４标准工作曲线 以磺胺甲氧异恶唑标准品浓度对数为横坐标， 发光百分比（ＲＬＵ／ＲＬＵ。）为纵坐标，绘制抑制标准 曲线，结果见图４。 表２ 化学发光试剂盒与ＥＬＩＳＡ试剂盒反应时间比较 Ｔａｂ．２ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＣＬＥＩＡ ｋｉｔ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ ｍｉｎ 一从图４中可以看出，得到的曲线线性方程为Ｙ： ３５．１６６ｘ＋６９．１６５，线性相关系数Ｒ ＝０．９９１ ９，其 中Ｙ为ＲＬＵ值， 为磺胺甲氧异恶唑标准品浓度 对数． 将磺胺甲氧异恶唑浓度对数值用专业分析软件 替换为磺胺甲氧异恶唑浓度，制作标准工作曲线，用 以分析样品中磺胺类药物残留，所得标准工作曲线 见图５． 由图５得出Ｉｃ 。值为３．０４７ ｎｇ／ｍＬ，线性范围为 １．０～８１．０ ｎｇ／ｍＬ． ３２ 北京工商大学学报（自然科学版） ２０ｌ２年３月 图３ 反应时间与发光强度的关系 Ｆｉｇ．３ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ 恤 图４磺胺类试剂盒线性回归方程及标准曲线 Ｆｉｇ．４ Ｅｑｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ＣＨＩＶｅ ｏｆｔｈｅ ＳＡｓ ｋｉｔ 标准品浓度／（ｎｇ－ｍＬ。。） 图５磺胺类试剂盒标准工作曲线 ３．５试剂盒特异性 磺胺类单克隆抗体对其类似物的交叉反应率见 表３． 表３可见，该单克隆抗体对１７种磺胺类药物的 交叉反应率均较高，而对非磺胺类药物基本无交叉 反应，所以该试剂盒适用于检测１７种磺胺类药物的 总残留量． ３．６最低检测限 对２０份不含磺胺类药物的空白猪肉样本进行 检测，测定结果的平均值加上３倍标准差为该方法 对实际样本的最低检测限，结果见表４．根据２０份 样本的检测结果，并利用公式计算，该试剂盒对猪肉 样本的最低检测限为０．７４ ｎｇ／ｇ． 表３磺胺类试剂盒特异性实验 Ｔａｂ．３ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ＳＡｓ ｋｉｔ 概一断～嘶洲融 一 一 触铋 一一嫩㈣ ３．７准确度与精密度 ＥＬＳＩＡ法的准确度以回收率表示，精密度以变 异系数来表示．取猪肉样本分别添加磺胺甲氧异恶 唑标准品至１．０ ｎｇ／ｇ和２．０ ｎｇ／ｇ，对样本进行添加回收 实验，分别计算准确度和精密度，检测结果见表５． 从表５可知，试剂盒对猪肉样本的添加回收率 在７０％～１００％，批内变异系数在１０．４％～１４．１％， 批间变异系数在１１．７％～１２．２％． 第３０卷第２期 万字平等：食品中磺胺类药物化学发光酶联免疫检测试剂盒的初步研究 ３３ １．４２ ２．０ １．８５ １．８２ １．９２ １．８９ １．４６ １．６２ ２．００ １．８３ １．４１ １．５８ １．８３ ７９．ｏ ８９．０ ８５．０ ｌ３．３ ｌＯ ５ １０．４ ３．８试剂盒稳定性 无交叉反应，该试剂盒的标准曲线线性范围为１．０～ ８１．０ ｎｇ／ｍＬ，ＩＣ 为３．０４７ ｎｇ／ｍＬ，对猪肉的最低检 测限为０．７４ ｎｇ／ｇ，样本添加回收率在７０．０％～ １００．０％，批内变异系数在ＩＯ．４％～１４．１％，批间变 异系数在１１．７％～１２．２％． 试剂盒分别放置于一２０℃冰箱和３７℃温箱６ ｄ 后进行实验，比较放置前与放置后参考标准品各点 ＲＬＵ值，参考标准品各点ＲＬＵ值未见明显降低，且 本底发光值无明显升高，表明试剂盒标准曲线无明 显漂移，满足稳定性要求．在实际应用中，试剂盒一 般存放在２～８℃冰箱，所以对于整体试剂盒的稳定 我国规定，磺胺类药物在食品中的残留限量为 所有食品动物肌肉、动物肝、牛奶１００ ｍｇ／ｋｇ口 ，本 实验方法的各项指标均能满足检测要求．经检验， 性评判，还需要进行２～８℃放置保存实验，从而进 一步验证试剂盒的稳定性． 与常规一步式或两步式ＥＬＩＳＡ的检测效果基本一 致，且可缩短反应时间约６０ ｍｉｎ．可见，以一步式 ＣＬＥＩＡ检测动物组织中得ＳＡｓ残留更符合快速检测 的要求，实现了对ＳＡｓ残留的简便、快速、精确检测． 参考文献 ４ 结 论 由于磺胺类药物是小分子物质，没有免疫原性， 所以必须连接到大分子载体上产生特异性免疫应 答，本实验将磺胺类药物的母核分别与牛血清白蛋 白和卵清蛋白偶联，合成免疫原和包被原．本研究 根据间接竞争反应原理建立快速检测ＳＡｓ的一步式 ＣＬＥＩＡ，经进一步优化，其最佳反应条件为：抗原包 被浓度为１０￣ｇ／ｍＬ，包被温度为３７℃，反应２ ｈ， ［１］ 郝晓丽．磺胺类药物残留检测方法研究［Ｄ］．北京： 首都师范大学，２００９． ［２］ 姜大富．磺胺类药物的临床应用及使用心得［Ｊ］．畜 牧兽医科技信息，２００６（６）：８５． ［３］ 胡园园，陈一资．胺类药物磺胺二甲嘧啶对人和动物 的危害机理及其残留的检测方法［Ｃ］．中国畜牧兽医 学会兽医食品卫生学分会第五次会员代表大会暨第 九次学术交流会．北京：２００６． ［４］ 陈瑞玲．磺胺类药与甲氧苄啶的合理应用［Ｊ］．中国 临床医生，２００８，３６（７）：１８—２０． ＳＡｓ单抗最佳稀释倍数为１：６４ ０００，竞争反应１５ ｍｉｎ，洗涤液为ｐＨ ７．４、含０．０５％吐温一２０的ＰＢＳＴ 溶液．本研究所制备的单克隆抗体对磺胺类药物具 有很高的特异性（ＩＣ 。＝３．０４７ ｎｇ／ｍＬ），并且对磺胺 类药物抑制标准曲线线性良好，对１７种磺胺类药物 类似物的交叉反应率较高，而对其他非磺胺类药物 ［５］ 王瑞深．肉品中残留磺胺类药的危害及其监控［Ｊ］． 兽医导刊，２０１０（２）：５０—５１． 北京工商大学学报（自然科学版） ２０１２年３月 ［６］ 刘正才，杨方，余孔捷，等．超高效液相色谱一串联质谱 法快速检测鳗鱼中磺胺类、喹诺酮类、四环素族抗生 素药物残留［Ｊ］．食品科学，２００９，３０（１４）：１６７一 ｌ７０． 志，２００３，３９（６）：６ ８． 关嵘，顾鸣，魏万贵，等．酶联免疫法检测动物组织 中磺胺嘧啶残留方法的建立［Ｊ］．检验检疫科学， ２００４，１４（１）：３． ［７］ 张海玲．分泌抗磺胺类药物单克隆抗体杂交瘤株的建 立［Ｄ］．哈尔滨：哈尔滨工业大学，２００９． ［８］ 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ｎｇ／ｍＬ，ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｗａｓ ０．７４ ｎｇ／ｍＬ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＥＬＩＳＡ，ｔｈｅ ＣＬＥＩＡ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｂｕｔ ａｌｓｏ ｓｈｏｒｔｅｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｂｙ ６０ ｍｉｎｕｔｅｓ．ＣＬＥＩＡ ｋｉｔ ｉｓ ｍｏｒｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡｓ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｆｏｏｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅｓ；ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕ— ｎｏａｓｓａｙ；ｋｉｔ （责任编辑：李宁）
