第３６卷第４期 ２０１０年８月 湖南农业大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ） Ｖｌ０１．３６ ＮＯ．４ Ａｕｇ．２０１０ ＤＯＩ：ｌ０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１２３８．２０１０．００３８１ 水稻Ｌ一半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆和 原核表达及抗体的制备 俞乐 ，刘拥海 ，彭新湘 （１．华南农业大学生命科学学院，广东广州５１０６４２；２．肇庆学院生命科学学院，广东肇庆５２６０６１１ 摘 要：应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从水稻叶片中克隆了水稻Ｌ．半乳糖内酯脱氢酶（ＧＬＤＨ）的全长基因．序列分析表明， 水稻ＧＬＤＨ基因全长１ ７５２ ｂｐ，亚克隆其部分成熟蛋白编码基因（７８９ ｂｐ），利用基因重组技术构建了Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＥＴ３０ａ— ＧＬＤＨｅ，经酶切鉴定，ＤＮＡ测序，证实重组质粒构建正确；将重组质粒转化大肠杆菌Ｒｏｓｓｅｔａ，ＩＰＴＧ诱导表达， ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析证实表达出相对分子质量约为３６ ０００的蛋白．用原核表达蛋白作为抗原免疫家兔制备抗体，用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测抗体的特异性及效价，结果表明，抗体血清效价为１：１ ０００，在加ＩＰＴＧ诱导后的菌液中可以检 测到相应的蛋白条带（相对分子质量为３６ ０００），在水稻叶片样品中能检测到１条相对分子质量为３６ ０００的蛋白 条带． 关键词：水稻；Ｌ．半乳糖内酯脱氢酶；原核表达；抗体 文献标志码：Ａ 文章编号：１００７—１０３２（２０１０）０４．０３８１—０４ 中图分类号：Ｑ７８５ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎｏ－１，４－１ａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒＯｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ＧＬＤＨ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＹＵ Ｌｅ １，２ＬＩＵ Ｙｏｎｇ—ｈａｉ２ＰＥＮＧ Ｘｉｎ—ｘｉａｎｇ １ ，，（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈａｏｑｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙ，Ｚｈａｏｑｉｔｎｇ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５２６０６ １，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎｏ－１，４－ｌａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＬＤＨ）ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅ ｍｐｌａｉｉｆｅｄ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｂｏｕｔ Ｉ ７５２ ｂｐ．Ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ｐａｒｔ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（７８９ ｂｐ） ｗａｓ ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ－３０ａ（＋）．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ３０ａ—ＧＬＤＨｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｄａｔａ ｏｆ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ａ ３６ ０００（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ）ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ａｇａｉｎｓｔ ＧＬＤＨ ｗａｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｉｈ ｔｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ ｐｏｌｙｅｌｏｎａｌ ｎｔａｉｂｏｄｙ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ｓｐｅｃｉｉｃｉｆｙ ａｎｄ ｔｔｉｔｅｒ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｕｌｄ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ＧＬＤＨ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙａｎｄｉｔｓｔｉｔｅｒｗａｓ ａｂｏｕｔ１：１ ０００． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｉｃｅ；Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎｏ－１，４－ｌａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ 抗坏血酸（ＡｓＡ）对植物自身的抗氧化、光保护 以及调节生长发育等都有重要作用 卜 ．Ｌ一半乳糖途 径是公认的植物ＡｓＡ的主要合成途径 ，在该途径 中，Ｌ一半乳糖内酯脱氢酶（Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎｏ一１，４一ｌａｃｔｏｎｅ 收稿ｔ３期：２００９．１２．１４ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＬＤＨ，ＥＣ１＿３．２．３）直接氧化Ｌ一半乳糖 内酯（Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎｏ一１，４一ｌａｃｔｏｎｅ，Ｇａ１）生成ＡｓＡ，是植物 ＡｓＡ生物合成途径中最后一步的关键酶 】． ＧＬＤＨ最早从豌豆中得以鉴定 引，此酶定位于 基金项目：国家自然科学基金项Ｉ￣（３０８７０１８４） 作者简介：俞乐（１９７４一），女，广西玉林人，博士，讲师，从事植物逆境生理与分子生物学研究，ｙｕｌｅ＠ｚｇｕ．ｅｄｕ．ｃａ ３８２ 湖南农业大学学报（自然科学版） ２０１０年８月 植物细胞线粒体内膜上，专一地以细胞色素ｃ （Ｃｙｔｃ）作为酶反应的电子受体，催化还原Ｃｙｔｃ，同 时氧化Ｇａｌ生成ＡｓＡ［ ．已从花椰菜 和甘薯 中纯 化得到ＧＬＤＨ，它们由相对分子质量为５６ ０００的单 一公司合成，序列如下：ＧＦ１：５ ｃＴＡＧＡＧｃＴＩｏＧＧ ＡＡＡＡＣａ Ａ１ＴｒＣＧ ｒＣ．３ ，引入酶切位点ＳａｃＩ； ＧＲ１：５ｒ＿ＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＴＴＡ Ｃ一３，引入酶切位点Ｈｉｎｄｌｌ１． 多肽组成，都含有对酶活性起重要作用的半胱氨 １．２．２原核表达载体ｐＥＴ３０ａ—ＧＬＤＨｅ的构建 用已测序的ｐＹＬ．ＧＬＤＨ质粒作为模板设计引 物，克隆原核表达片段ＧＬＤＨｅ，引物序列如下： 酸残基．ＧＬＤＨ的ｃＤＮＡ已从花椰菜Ｉ６】、甘薯［ 、 烟草㈣、拟南芥 、甜瓜 及番茄㈣等植物中获得 克隆，来源于不同植物的ＧＬＤＨ基因具有相似的结 构，它们编码具有较高相似性的５８１－６１０个氨基酸． 用ＮＣＢＩ网站的Ｂｌａｓｔ和ＲＧＰ网站的Ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ对搜索结果进行分析，发现在水稻基因组 有２个ＧＬＤＨ基因的相似序列，分别位于第１１和１２ 染色体上，其ｃＤＮＡ全长分别为２ １５２ ｂｐ和２ １３５ ｂｐ （ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＫ１ ０２６９７、ＡＫ２４ １ ５６５），相似 性达９８％，ＯＲＦ均为１ ７５２ ｂｐ，编码５８３个氨基酸， 所注释的编码产物均为ＧＬＤＨ．笔者以ＮＣＢＩ上推 测的水稻ＧＬＤＨ的ｃＤＮＡ（ＡＫ２４ １ ５６５）为模板设计引 物，克隆得到水稻ＧＬＤＨ的ｃＤＮＡ，构建原核表达 载体，并在Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｓｅｔａ中进行表达．进一步免疫 家兔，制备了水稻ＧＬＤＨ的抗体，以期为研究水稻 ＧＬＤＨ的特点以及与ＡｓＡ的关系奠定基础． １材料与方法 １．１材料 水稻粳稻品种中花１１、ｐＹＬ载体、原核表达载 体ｐＥＴ－３０ａ（＋）、Ｅ．ｃｏｌｉ／ＤＨ５ａ、Ｒｏｓｓｅｔａ均为华南农业 大学生命科学学院分子植物生理研究室种植保 存．酶Ｈｉｎｄｍ、ＳａｃＩ，Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自 ＴａＫａＲａ公司，山羊抗兔ＩｇＧ购自Ｓｉｇｍａ公司，其 他试剂均为分析纯． １．２方法 １．２．１水稻ＧＬＤＨ基因的克隆 提取分蘖期水稻叶片总ＲＮＡ，根据ＮＣＢＩ上已 报道的水稻ＧＬＤＨ全长ｃＤＮＡ序列设计引物ＧＦ１、 ＧＲ１，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得目的片段，ＰＣＲ扩增 反应参数为：９４℃，２５ ｓ；５５．５ ０Ｃ，３０ ｓ；７２￣Ｃ，２ ｍｉｎ； ２８个循环．片段连接ｐＹＬ载体后，转化Ｅ．ｃｏｉｌＤＨ５ｃｔ， 酶切检测法鉴定重组子，挑选阳性克隆测序鉴定． 引物ＧＦＩ、ＧＲ１由上海生工生物工程技术服务有限 ＧＦ２：５＇－ＧＣＧＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＴＴＴＡＣＣＴＣＡＡＡ－３ ． 引入酶切位点 ｃＩ；ＧＲ２：５＇－ＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡ ＴＣＡＧｃＡＣＡＡｃＣ兀Ａｃ一３ ，引人酶切位点Ｈｉｎｄｍ． ＰＣＲ扩增反应参数为：９４℃，３０ Ｓ；５５．５℃， ４０ Ｓ；７２℃，１ ｍｉｎ；２５个循环．回收ＰＣＲ产物， 用Ｈｉｎｄｌｌｌ和ＳａｃＩ双酶切后与同样酶切的ｐＥＴ－３０ａ（＋） 连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ，用酶切检测法鉴定重组子， 挑选阳性克隆测序鉴定，用测序正确的质粒转化Ｅ． ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ． １．２．３ ｐＥＴ３０ａ—ＧＬＤＨｅ的原核表达 挑含有ｐＥＴ３０ａ．ＧＬＤＨｅ的单菌落至含相应抗 生素的ＬＢ液体培养基中振荡培养，３７℃、２００ ｒ／ｍｉｎ 培养至ＯＤ６ｏ０ 为０．４～０．６，加入ＩＰＴＧ至终浓度为 １ ｍｍｏｌ／Ｌ，分别于诱导前，诱导后１、３、４、５、６ ｈ 取样，进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳分析． １．２．４抗备和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析 将诱导后的菌液离心后去掉上清，重悬细菌后 进行超声破碎处理，离心回收沉淀，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电 泳分离目的蛋白，目的蛋白凝胶条带和无菌水以及 弗氏完全佐剂匀浆，充分乳化．第１次注射免疫家 兔时使用弗氏完全佐剂，随后的几次注射均采用弗 氏不完全佐剂．第２次注射在１０ ｄ后进行，第２次 注射７～１０ ｄ后进行第３次注射，第３次注射ｌ０～１５ ｄ 后采血． 称取水稻叶片，用ＳＤＳ．ＰＡＧＥ样品缓冲液匀浆， 离心后取适量上清用于电泳．同时取诱导前后菌液 加ＳＤＳ．ＰＡＧＥ上样缓冲液点样进行电泳．将蛋白质 电转至ＮＣ膜，用５％脱脂奶封后按１：１ ０００的稀释 比例加入第一抗体，３７℃孵育１ ｈ，经洗涤后，按 １：２０ ０００的稀释比例加入第二抗体（山羊抗兔 Ｇ）， ３７℃孵育１ ｈ．最后用底物氮蓝四唑（ＮＢＴ）和５一溴 ．４．氯．３一吲哚磷酸二钠盐（ＢＣＩＰ）￣色，观察结果． 第３６卷第４期 俞乐等 水稻Ｌ一半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆和原核表达及抗体的制备 ３８３ ２结果与分析 ２．１ 水稻ＧＬＤＨ基因的扩增与鉴定 肽位点与跨膜区域的片段做原核表达，共表达２６３ 个氨基酸，蛋白相对分子质量为３０ ０００，加上Ｈｉｓ 标签后相对分子质量为３６ ０００． 用特异引物ＧＦ１／ＧＲ１扩增水稻ＧＬＤＨ基因， 经１％琼脂糖凝胶电泳检测，可见约１ ８００ ｂｐ的产 物（图１）． Ｍ Ｍ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；１ ＰＣＲ产物． — ４６ ９２ １３８ １８４ ２３０ ２７６ ３２２ ３６８ ４１４ ４６０ ５０６ ５５２ 图３水稻ＧＬＤＨ蛋白的抗原决定簇分析 Ｆｉｇ．３ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ＧＬＤＨ ２Ｉ３原核表达基因片段的扩增与鉴定 图１水稻ＧＬＤＨ基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩增 Ｆｉｇ．１ ＲＴ－ＰＣＲ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＬＤＨ ｇｅｎｅ ｉｎ ｒｉｃｅ 产物用性内切酶Ｈｉｎｄｍ和ＳａｃＩ酶切，连 接到ｐＹＬ载体上，经酶切（图２）及测序验证结果正 确，无碱基错配，重组质粒命名为ｐＹＬ—ＧＬＤＨ． ２ ０００ｂｐ １ ０００ｂｐ ７５０ｂｐ ５００ ｂｐ Ｍ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；１、２重组质粒双酶切 图２质粒ｐＹＬ．ＧＬＤＨ的酶切鉴定 Ｆｉｇ．２ Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＹＬ－ＧＬＤＨ ２．２ ＧＬＤＨ蛋白的抗原表面分析 利用ＤＮＡＳＴＡＲ中的Ｐｒｏｔｅａｎ程序分析水稻 ＧＬＤＨ蛋白，再用Ｊａｍｅｓｏｎ—ｗｏｌｆ方法分析ＧＬＤＨ蛋 白的抗原表位，由图３可见，ＧＬＤＨ全蛋白的抗原 决定簇具体分布位置，横坐标代表氨基酸序列，纵 坐标代表抗原表位．水稻ＧＬＤＨ蛋白的抗原决定簇 分布主要集中在第３２２到５８３位氨基酸．试验最初 选用整个ＯＲＦ进行原核表达，但发现未加ＩＰＴＧ前 菌液的０１）值始终只能维持在０．３，不能逐步升高 达到０．５，判断可能是转入了ＧＬＤＨ蛋白的信号肽 和跨膜片段造成菌体死亡，所以改选用不包括信号 以已测序的质粒ＧＬＤＨ．ｐＹＬ为模板，用引物 ＧＦ２／ＧＲ２扩增原核表达片段ＧＬＤＨｅ，经电泳检测 可见约８００ ｂｐ的产物（图４）． 量 Ｍ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；１重组质粒双酶切 图５质粒ｐＥＴ３０ａ—ＧＬＤＨｅ的酶切检测 Ｆｉｇ．５ Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＴ３０ａ－ＧＬＤＨｅ ２．４重组质粒ｐＥＴ３０ａ—ＧＬＤＨｅ的诱导表达 菌液培养到０１９６ｏ０ 为０．５时加入ＩＰＴＧ，诱导 效果如图６．未加入ＩＰＴＧ的菌液中有一蛋白条带 ３８４ 湖南农业大学学报（自然科学版） ２０１０年８月 与目的蛋白条带位置接近，加诱导剂后３ ｈ，目的 薯、花椰菜、拟南芥的ＧＬＤＨ的氨基酸序列进行比 对分析，发现它们在Ｎ端均存在有一段推测的线粒 蛋白被大量诱导表达．取经诱导３ ｈ的菌液进行目 的蛋白分离用于免疫家兔，电泳时注意相近蛋白条 体定位结构域序列，并存在有信号肽的切割位点 带的充分分离． ９６ ０００ ６６ ０００ ４３ ０００ ３１ ０００ ２２ ０００ ｌ４ ０００ 目的蛋白 Ｍ蛋白ｍａｒｋｅｒ；Ｏ～５ ＩＰＴＧ诱导０、１、３、４、５、６ ｈ的Ｒｏｓｓｅｔａ／ ｐＥＴ３０ａ—ＧＬＤＨｅ样品． 图６ Ｒｏｓｓｅｔａ／ｐＥＴ３０ａ－ＧＬＤＨｅ的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析 Ｆｉｇ．６ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒｏｓｓｅｔａ／ＩｌＥＴ３０ａ－ＧＬＤＨｅ ２．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交检测抗体的效价 Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交结果（图７）显示，用稀释１ ０００倍 的抗体血清在加ＩＰＴＧ诱导后的菌液中可以检测到 相应的蛋白条带（相对分子质量３６ ｏｏｏ），而在水稻 叶片样品中，在相对分子质量５４ ０００的位置未能发 现预期蛋白条带，只能检测到１条小于预期蛋白的 条带（相对分子质量为３６ ｏｏｏ）． ９６ ０００ ６６ ０００ ４３ ０００ ３１ ０００ ２２ ０００ Ｍ蛋白ｍａｒｋｅ；１水稻叶片样品；２ ＩＰＴＧ诱导３ ｈ的ＲｏｓｓｅｔａＪ ｐＥＴ３０ａ－ＧＬＤＨｅ样品；３ ＩＰＴＧ诱导０ ｈ的Ｒｏｓｓｅｔａ／ｐＥＴ３０ａ－ＧＬＤＨｅ样品． 图７ ＧＬＤＨ抗体效价检测 Ｆｉｇ．７ ＧＬＤＨ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ ａｓｓａｙ ３讨论 克隆的水稻ＧＬＤＨ全长基因与ＧｅｎＢａｎｋ登录 号为ＡＫ２４１５６５的水稻ＧＬＤＨ序列的相似性为 １００％，与其他已报道植物ＧＬＤＨ氨基酸序列的相 似性均达到７０％以上，说明该基因相对保 守．Ｐａｔｅｒａｋｉ等［１２］对甜瓜、草莓、烟草、番茄、甘 ＦＲ／ＹＡ．该信号肽的特点是相对富含Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ 和Ｓｅｒ，而少含Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ｖａｌ和Ｉ１ｅｌｊ引．本研究曾 采用原核表达载体ｐＥＴ－３０ａ表达ＧＬＤＨ全长基因， 但没有获得成功，将ＧＬＤＨ的信号肽以及跨膜片段 缺失，结果在Ｒｏｓｓｅｔａ／ｐＥＴ－３０ａ中获得高效表达，这 表明信号肽和跨膜片段在表达中起负作用，可能是 信号肽和跨膜片段带有疏水蛋白，不利于外源基因 在原核中的表达． Ｂａｒｔｏｌｉ等 Ｊ的Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交结果显示，在马铃薯 叶中可检测到相对分子质量为５６ ０００的ＧＬＤＨ成熟 蛋白条带和相对分子质量分别为３０ ０００、２８ ０００、 ２６ ０００的ＧＬＤＨ蛋白降解片段．Ｔａｂａｔａ Ⅲｊ在烟草 细胞中分别检测到相对分子质量为６８ ０００（带信号 肽蛋白）、５６ ｏｏｏ（无信号肽蛋白）和３７ ｏｏｏ（降解片段 蛋白）的条带．笔者制备ＧＬＤＨ兔抗后的Ｗｅｓｔｅｍ 杂交结果显示，在加ＩＰＴＧ诱导后的菌液中可以检 测到相应的蛋白条带（相对分子质量为３６ ｏｏｏ），说 明ＧＬＤＨ部分片段的原核表达已获成功．另外，根 据ＮＣＢＩ上提供的ｃＤＮＡ序列可推测水稻ＧＬＤＨ成 熟蛋白的相对分子质量为５４ ０００，但在水稻叶片样 品的Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交结果中始终未能发现相应的蛋白 条带，而在相对分子质量为３６ ０００的位置出现１条 明显的条带，推测此条带为水稻ＧＬＤＨ蛋白的降解 片段，ＧＬＤＨ蛋白在水稻植株体内的存在形式是否 不同于双子叶植物，值得进一步的探讨研究． 参考文献： 【ｌ Ｊ Ｓｍｉｒｎｏｆｆ Ｎ．Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ａｎｎ Ｂｏｔ，１９９６，７８：６６１—６６９． ［２】Ｄａｖｅｙ Ｍ Ｗ，Ｖａｎ Ｍｏｎａｔｇｕ Ｍ，Ｉｎｚｅ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｐｌａｎｔ Ｌ—ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉＩｙ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｃｅｓｓｊｎｇ［Ｊ］．Ｊ Ｓｃｉ Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ，２０００，８０：８２５．８６０． ［３】Ｐａｓｔｏｒｉ Ｇ Ｍ，Ｋｉｄｄｌｅ Ｇ，Ａｎｔｏｎｉｗ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｌｅａｆ ｖｉｔａｍｉｎ－Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００３，ｌ ５：９３９—９５ １． （下转第４２９页） 第３６卷第４期 陈或等 油茶抗炭疽病优良单株筛选及抗病机理研究４２９ （上接第３８４页） 【４】Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｇ Ｌ，Ｊｏｎｅｓ Ｍ Ａ，Ｓｍｉｒｎｏｆｆ Ｎ．Ｔｈｅ ｂｉｏｓ— ｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ－Ｃ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ ｔｏｂａｃｃｏ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｆｏｒ Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎｏ一１，４－ｌａｃｔｏｎｅ—ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ【Ｊ】．Ｐｌａｎｔ Ｊ， ２００１，２７：１３９—１４８． ［Ｊ］＿Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９３：３６５—３６９． ｋａｗａ Ｓ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｐｕｒｉｔｉｃａｔｉｏｎ 【５］ Ｏｂａ Ｋ，Ｉｓｈｉ【ｌ １］Ｔａｍａｏｋｉ Ｍ，Ｍｕｋａｉ Ｆ，Ａｓａｉ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｌｉｇｈｔ—ｃｏｎｔｏｒｌｌｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎｏ一 ・ｌａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｗｈｉｃｈ ａｆｆｅｃｔｓ ａｓｃｒｏｂａｔｅ ｐｏｏｌ ｓｉｚｅ ｉｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎ一’，一ｌａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｆｒｏｍ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｒｏｏｔｓ［Ｊ１．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９５，ｌ １７： ｌ２Ｏ一１２４． Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ，２００３，１６４： １１ｌ１．１１１７． ［６］ Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｊ，Ｐｅｒｓｉａｕ Ｇ，Ｄａｖｅｙ Ｍ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ［１２】Ｐａｔｅｒａｋｉ Ｉ，Ｓａｎｍａｒｔｉｎ Ｍ，Ｋａｌａｍａｋｉ Ｍ Ｓ，ｅｔ ａ１． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｍｅｌｏｎ ｆｒｕｉｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｏｆ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎｏ・Ｙ—ｌａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏ— ｇｅｎａｓｅ，ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎ—ｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎｏ一１，４一ｌａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ，２００４，５５：１６２３－１６３３． ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ［Ｊ】．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９７，２７２：３０００９—３００１６． ｈａｇｄｏｗ Ｍ，Ｍｏｕｎｅｔ Ｆ，Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｌ，ｅｔ ａｔ．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ［１３］ Ａｌｏｆ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎｏ一１，４－ｌａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｆｆｅｃｔｓ ｐｌａｎｔ ｉ Ｃ Ｇ．Ｐａｓｔｏｒｉ Ｇ Ｍ，Ｆｏｙｅｒ Ｃ Ｈ．Ａｓｃｏｒｂａｔｅ 【７】 Ｂａｒｔｏｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｉｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓⅢａｎｄ ＩＶ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０００，１２３：３３５．３４３． ａｎｄ ｆｒｕｉｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２００７，１４５：１４０８．１４２２． ｓｈｅｒｗｏｏｄ Ｆ Ａ，Ｃｈｅｎ Ｙ Ｔ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ［８］Ｍａｐｓｏｎ ＬＷ， Ｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ．ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ：Ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎｏ．ｖ—ｌａｃｔｏｎｅ ｉｎｔｏ Ｌ—ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｐｌａｎｔ ［１４］ Ｖｏｎ ＨｅＯｎｅ Ｇ．Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ［Ｊ】．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １９８６，１４：４６８３—４６９０． ｍｉｔｏｃｈ０ｎｄｒｊａ『Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，１９５４，５６：２１—２８． 『９］ Ｉｍａｉ Ｔ，Ｋａｒｉｔａ Ｓ，Ｓｈｉｒａｔｏｒｉ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｌ—ｇａｌａｃｔｏｎｏ一 ７－ｌａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒ０ｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ：Ｐｕｒｉｆｉｃａ－ 责任编辑：罗慧敏 英文编辑：胡东平 ｔｉｏｎ ａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９８，３９：１３５０—１３５８． ｆｌＯ１ Ｔａｂａｔａ Ｋ，０ｂａ Ｋ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ—ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
