促红细胞生成素对大鼠内皮祖细胞生物学特点的影响

Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 9, 2010 Vol.14, No.15

促红细胞生成素对大鼠内皮祖细胞生物学特点的影响**★ 王 东1，王 亮1，刘庆国2，王晓楠1，尉辉杰1，张建宁1

Effects of erythropoietin on biological characteristics of rat endothelial progenitor cells

Wang Dong1, Wang Liang1, Liu Qing-guo2, Wang Xiao-nan1, Wei Hui-jie1, Zhang Jian-ning1

Abstract BACKGROUND: Endothelial progenitor cells (EPCs) is the progenitor cells of endothelial cells, which participated in angiogenesis. Some researches demonstrate that recombinant human erythropoietin (rhEPO) can mobilize EPCs from bone marrow, and have a beneficial effect on recovery of injury tissue. OBJECTIVE: To investigate the effect of rhEPO on the function of rats EPCs. METHODS: Bone marrow was obtained from both femurs and tibials of Wistar rats, and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation, followed by cultured and treated with several does of rhEPO (0, 4, 8 U/mL). At 7 days after culture, EPCs were identified by FITC-UEA-1 and Dil-Ac-LDL co-staining. Meanwhile, EPCs were marked by CD133 and CD34, identified by flow cytometry; additionally, the functions of EPCs were evaluated using adhesion test, migration assay and proliferation experiment. RESULTS AND CONCLUSION: At 7 days after culture, the cell morphology changed completely, and formed a tube-like structure, which presented typical cobblestone appearance after cell conjugation. The fluorescence staining showed that the EPCs were positive to both FITC-UEA-1 and Dil-Ac-LDL co-staining. The CD133 and CD34 cells were combined to EPCs by flow cytometry. Finally, the adhesion test, migration assay and proliferation experiment demonstrated that rhEPO could improve adhesion, migration and proliferative capacities in a dose-dependent manner. The results demonstrated that rhEPO can significantly enhance the functions of EPCs in dose-dependent manner at 0-8 U/mL concentration. Wang D, Wang L, Liu QG, Wang XN, Wei HJ, Zhang JN. Effects of erythropoietin on biological characteristics of rat endothelial progenitor cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(15): 2705-2708. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]

摘要 背景：内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞，可参与新生血管的形成。研究发现，促红细胞生成素对骨髓内皮祖细胞有动员作用，促进血管的新生和损伤组织修复。 目的：观察不同浓度促红细胞生成素对体外培养的大鼠内皮祖细胞功能的影响。 方法：提取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓，利用密度梯度离心方法分离单核细胞进行培养，分别在培养基中加入0，4，8 U/mL不同浓度的促红细胞生成素进行培养。培养7 d后，对内皮祖细胞利用FITC-UEA-1和 Dil-Ac-LDL共同染色方法进行鉴定；同时利用CD34和CD133共同标记，以流式细胞仪进行鉴定；采用黏附实验、迁移实验及MTT实验对其功能进行评定。 结果与结论：培养到7 d左右，细胞形态变化完全，细胞之间形成联接，并可以围成似管腔状形态，十二三天时，细胞融合，形成铺路石样。培养细胞荧光染色显示内皮祖细胞呈双阳性染色，经流式细胞仪鉴定培养的内皮祖细胞可以结合CD133和CD34。黏附实验、迁移实验及MTT实验显示，促红细胞生成素呈剂量依赖性提高内皮祖细胞的黏附、迁移和增殖能力。说明在0~8 U/mL浓度内，促红细胞生成素呈剂量依赖性提高内皮祖细胞的黏附、迁移和增殖功能。 关键词：内皮祖细胞；促红细胞生成素；细胞培养；功能；大鼠；血管组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.15.011

王东，王亮，刘庆国，王晓楠，尉辉杰，张建宁. 促红细胞生成素对大鼠内皮祖细胞生物学特点的影响[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2010，14(15):2705-2708. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]

Department of Neurosurgery,

General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China; 2

Department of Neurosurgery, Affiliated Heping Hospital of Changzhi Medical College, Changzhi 047100, Shanxi Province, China

Wang Dong★,

Studying for master’s degree, Department of Neurosurgery, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China 54454241@qq.com

Correspondence to: Zhang Jian-ning, Professor, Doctoral supervisor, Department of Neurosurgery,

General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China jianningzhang@ hotmail.com

Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30772229 *; Doctoral Program Foundation of Institutions of Higher Education of China, No. 20070062008*

Received: 2009-10-12Accepted: 2009-11-21

1

0 引言

重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)在过去的十几年中，已被数以百万计的患者用于治疗肾性贫血。

自内皮祖细胞(Endothelial progenitor

近年来，随着人们研究的深入，EPCs的功能和作用已远远超过了其干细胞的生物学作用，其具有抗炎症、抗凋亡、促进神经元新生等作用[4-7]，同时促红细胞生成素可以动员骨髓EPCs到外周血中，在血管新生中发挥重要作用[2，6]。本文通过体外培养大鼠骨髓EPCs，观察不同浓度rhEPO对于EPCs功能的影响，为EPCs的临床

cells，EPCs)被Asahara等[1]从外周血分离出并证实具有分化为成熟内皮细胞和在体内能参与成体动物的新血管生成的能力后，其应用价值越来越受到人们的关注。此后，EPCs被用来进行治疗性血管新生、 覆盖组织工程血管及基因治疗、生物性心肌再生等多方面的研究[1-3]。

ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 2705

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王东，等. 促红细胞生成素对大鼠内皮祖细胞生物学特点的影响

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天津医科大学总医院神经外科，天津市 300052；2

山西长治医学院附属和平医院神经外科，山西治市 047100

王 东★，男，1982年生，天津市人，汉族，天津医科大学在读硕士，主要从事颅脑损伤的基础与临床研究。 54454241@ qq.com

通讯作者：张建宁，教授，博士生导师，天津医科大学总医院神经外科，天津市 300052

jianningzhang@hotmail.com

中图分类号:R318 文献标识码:A

文章编号:1673-8225 (2010)15-02705-04

应用提供实验基础。 1 材料和方法

设计：随机对照动物实验，细胞学体外实验。

时间及地点：于2008-10/2009-06在天津市神经病学研究所完成。

材料：成年雄性清洁级Wistar大鼠20只，体质量200~250 g，由军事科学院提供。对动物处置方法符合科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

主要仪器与试剂：

养基(EBM-2)中止，将细胞悬液收集于离心管中，于800 r/min离心5 min，弃上清，悬浮在 500 µL 培养液并计数，然后将相同数目的细胞接种于提前包被有人纤维链蛋白的24 孔板，在37 ℃和体积分数5% CO2培养箱培养30 min 后，吸去上清液，用HBSS液轻洗2次后，计数贴壁细胞数。

迁移实验：培养7 d的EPCs用迁移小室测定

EPCs的迁移功能。各组细胞以0.25%的胰酶消化成细胞悬液收集于无菌离心管中，以800 r/min离心5 min，弃上清，用无菌PBS洗2遍，用含0.05%BSA的无血清培养基重悬，并计数，调制成含有2×104个EPCs的悬液，每个上室加入200 µL，将1 200 µL含血管内皮生长因子

仪器与试剂

来源

(50 µg/L)和血清的培养基加入小室的下室，于37 ℃和5% CO2培养箱培养24 h后，用棉签刮去滤膜上未移动的细胞，用40 g/L多聚甲醛固定，DAPI荧光染色，在倒置显微镜下随机选择3个400倍视野计数。

增殖实验：培养7 d的EPCs以0.5%的胰酶消

倒置荧光显微镜 Olympus，Japan

重组人促红细胞生成素 麒麟鲲鹏公司Japan Dil-Ac-LDL invitrogen, USA FITC-UEA-1 Sigma, USA 内皮基础培养基(EBM-2) Lonza, USA 人纤维连接蛋白 BD，USA 淋巴细胞分离液 sigma，USA

迁移小室 Costar, USA

收稿日期：2009-10-12

修回日期：2009-11-21(20090905011/GW·Z)

和CD34 Santa Cruz, USA CD133

化收集贴壁细胞，制成悬液以800 r/min离心 5 min，弃上清，用无菌PBS洗2遍，调制成含1×107 L-1的悬液，以等量细胞数接种于包被有纤维连接蛋白的96 孔培养板， 每孔加100 µL MTT (5 g/L)，培养4 h后，弃上清液，再加入二甲基亚砜(150 µL/孔)，充分振荡10 min，使结晶物完全溶解，置酶标仪上于波长490 nm测吸光度(A)值。

主要观察指标：不同浓度促红细胞生成素干预后EPCs功能的变化。

设计、实施、评估者：实验设计为第一作者与通讯作者，干预实施和结果评估为第一、二、三、四、五作者。

统计学分析：计量资料用均数±标准差表示，多组间的比较采用one-way ANOVA，组间比较采用LSD法，所有数据均采用SPSS 16.0进行统计学分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。统计学处理由第四、五作者完成。

2 结果 2.1 EPCs的体外培养及鉴定 大鼠骨髓EPCs于培养24 h后贴壁，培养4 d后开始出现梭形变化，未贴壁的细胞如单核细胞等在换液时被移去，培养到7 d左右，EPCs形态变化完全，细胞之间形成联接，并可以围成似管腔状，见图1。

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实验方法：

EPCs的分离与培养：采用大鼠骨髓经过密度

梯度离心的方法分离单核细胞[8-9]。Wistar大鼠采用脱颈处死后，于体积分数75%乙醇中消毒15 min后，在无菌环境下，取出其胫骨和股骨后，于超净台内，用无菌HBSS液冲出骨髓，吹打均匀后，加进提前放有淋巴细胞分离液的无菌离心管的上层，在2 000 r/min下分离20 min，吸取白膜层，于HBSS液中清洗2次，转速为 15 00 r/min，各离心5 min，后悬于培养基中调成浓度为1×109 L-1，加于提前包被有人纤维连接蛋白的12孔板上，在37 ℃，体积分数5% CO2的细胞培养箱中培养，3 d后分成3组，分别加含有3种不同浓度rhEPO的培养液(0，4，8 U/mL)，将不贴壁的细胞移走，后每隔3 d换一次培养基。

EPCs的鉴定：取培养第1代细胞进行鉴定，

培养7 d时，以FITC-UEA-1和Dil-Ac-LDL双标鉴定[1]。细胞在含Dil-Ac-LDL(10 mg/L)的培养基中孵育4 h，然后用40 g/L多聚甲醛固定15 min，磷酸盐缓冲溶液漂洗后再与FITC标记的UEA-1(10 mg/L)作用，洗净荧光染料后，在倒置荧光显微镜下观察照相，可双染的为EPCs。

黏附实验：骨髓单个核细胞培养7 d 后用

0.25%胰蛋白酶消化2.0~3.0 min后，加入2倍培

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a: Cells presented fusiform shape

at 4-5 days after culture

b: Cells formed a tube-like structureat 7-8 days after culture

Figure 3 Identification of endothelial progenitor cells: upper right quadrant was positive endothelial progenitor cells(CD133 and CD34) 图3 EPCs流式鉴定图：右上象限为双阳性的EPCs (CD133和CD34)

2.2 EPCs黏附实验、迁移实验、增殖实验结果 培养基中加入不同浓度的rhEPO，与对照组相比，4，8 U/mL干预组均明显增加了EPCs的贴壁数量[对照组：(29.58±5.68)个/×400；4 U/mL组：(53.12±8.46)个/× 400；8 U/mL组：(63.72±10.8)个/×400；P < 0.05]；且同时具有一定的浓度依赖性。

含有不同浓度rhEPO的培养基显著改善了EPCs的迁移功能，而随着rhEPO浓度的增加[对照组：(76.23±13.24)个/×400；4 U/mL组(95.62±15.37)个/× 400；8 U/mL组(107.12±17.97)个/×400；P < 0.01]；EPCs的迁移功能进一步改善。

用不同浓度的rhEPO干预后与对照组相比，4， 8 U/mLEPO干预组均能明显提高EPCs的增殖能力(对照组为0.10±0.02；4 U/mL组为0.25±0.04；8 U/mL组为0.34±0.04；P < 0.01)，且具有一定的浓度依赖性。

3 讨论

在临床及基础实验中，rhEPO可以动员骨髓EPCs到

a: UEA-1 staining

b: Dil-Ac-LDL staining

c: Cells presented typical cobblestone appearance at 12-13 days after

culture

Figure 1 In vitro culture of endothelial progenitor cells (×200)

图1 EPCs体外培养(×200)

培养细胞的荧光染色显示EPCs呈双阳性染色，见图2，表明其可以吞噬Dil-acLDL发红光，同时可以结合UEA-1发绿光。

并经流式细胞仪鉴定培养的EPCs可以结合CD133和CD34，见图3，CD133表明其具有祖细胞的特性，CD34表明其具有内皮细胞的特性。

ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH

c: Merge picture

外周血中，可以增加损伤区域的血管新生[2，6]。本实验以不同浓度的rhEPO对体外分离培养的大鼠骨髓EPCs进行干预，结果发现rhEPO对体外培养的EPCs的功能有正性作用，可以提高EPCs的迁移，黏附和增殖能力，增强了EPCs的功能，且呈剂量依赖性。这为应用rhEPO于创伤和缺血性疾病提供了进一步的实验依据。

EPCs的鉴别主要依靠两种方法[9]，一种是细胞表面标志物，如CD34，CD133，VEGFR-2，CD133在早期EPCs上表达，随着EPCs向内皮细胞转化，其表达量会下降，而另一些抗原表型会增多，如KDR，CD144等；另一种EPCs可以特异结合UEA-1，摄取Ac-LDL进行鉴别。

EPCs被从骨髓动员出来后，可以参与血管的修复与新生。在大部分研究中如吸烟，心血管疾病，糖尿病等[10-12]，人们关注最多的还是外周血中EPCs数量的减低，其功能和活性的高低也将直接影响修复和新生的程

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Identification of endothelial progenitor cells (×200)Figure 2

图2 EPCs的鉴定(×200)

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度，进而影响将来功能的恢复，所以在增加外周血中EPCs数量的同时，提高EPCs的功能也是有效的途径。本文通过体外实验发现rhEPO可以明显提高EPCs的功能，为进一步的实验打下基础。

在基础实验中，已经在多种模型中证实通过移植或动员使外周血中EPCs数量增加，可以明显提高其血管新生和功能的恢复。在肢体缺血的大鼠上，EPCs的移植可以明显提高损伤区的血管新生，降低其致残率[13-14]。在对患有心血管疾病的大鼠上移植体外扩增的EPCs，可以发现明显增加血管的新生，提高心肌功能[15]。在脑损伤的动物模型上也发现可以明显增加动脉内皮化[16-18]，也发现可以明显提高血管的新生， 进而对于损伤组织的血液再通和功能恢复发挥重要的作用，为神经的新生提供了更加适宜的环境，同时是对于有害因子的排出，减轻二次损伤的发生，是组织代谢和功能恢复必需的[19]。

EPO是一种可由自身肾脏分泌的细胞因子，人工制剂被应用于临床治疗肾性贫血取得了较好的效果。近年来，随着人们研究的深入，逐渐发现了rhEPO的很多非干细胞的生物学作用。在体内实验中，rhEPO对于EPCs的作用也被得到了证实。在动员EPCs方面，Bahlmann等[20]在应用rhEPO治疗贫血的患者中，测定其外周血中的EPCs数，发现外周血中的活性的EPCs增加了近3倍。实验证实了rhEPO可以增强EPCs的活性，EPCs的增殖，黏附和迁移功能是与其参与血管新生直接相关的，说明rhEPO对于EPCs有直接的正性作用，动员出来的EPCs是有能力归巢到损伤区并直接参与血管的新生。

目前，EPCs的研究主要集中于心肌梗死，脑梗死，肢体缺血，肿瘤等的相关研究中[21]，脑损伤的研究报道较少，前期本实验室研究发现脑创伤患者机体会动员骨髓的EPCs到外周血中，使外周血中的EPCs明显增加。同时在基础实验中的相关研究中证实，EPCs是可以归巢到创伤区参与血管的新生[22]。综上所述，rhEPO在动员EPCs的基础上，同时可以增强其活性，促进血管新生和受损血管内皮的修复，利用EPCs进行细胞治疗将成为缺血性疾病和创伤修复临床治疗的新途径。

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来自本文课题的更多信息--

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利益冲突：无利益冲突。 课题的价值：促红细胞生成素在动物实验和临床应用研究中可以明显动员骨髓中的内皮祖细胞到外周血中的细胞数量，本文从体外实验中证实促红细胞生成素可以提高体外培养的内皮祖细胞功能。 设计或课题的缺陷与不足：增殖、迁移和黏附等指标仅能阐述内皮祖细胞的部分生物学特点。由于实验条件的，未能完全评价内皮祖细胞的功能，没有从分子生物学的角度进行评价。 提供临床借鉴的价值：近年来促红细胞生成素在心肌梗死、脑梗死、肢体创伤及缺血、脑损伤中的基础研究较广泛且得到了较好的结果，其神经保护，抗凋亡，抗炎症等作用已被证实，为将来应用于临床上述相关疾病上打下实验基础。2708

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