噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用

#1829#

综述#讲座

噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用

薛国柱, 吕勇刚, 窦科峰

第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西西安710032

Selectiontechnologyofphageantibodylibraryanditsapplicationintumorresearch

XUEGuo-zhu,LUYong-gang,DOUKe-feng

DepartmentofHepato-biliarySurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi.an710032,P.R.China=摘要> 噬菌体抗体是指表达在噬菌体表面的抗体分子Fab或scFv,这些分子的群体称为抗体库。经特定抗原或细胞筛选后可以获得针对该抗原或细胞表面标志物的特异性抗体。经典的筛选方法为固相或液相抗原识别,前提条件是能得到抗原纯品,对于抗原无法提纯或抗原性质不确定的情况则不能适用,所以又出现全细胞筛选,直接利用肿瘤细胞或组织细胞进行筛选,无需纯抗原,但目标抗原一定要有较高的表达水平,对于表达较低的情况,一种策略是先利用正常细胞筛选,去掉无关抗原后,再利用肿瘤细胞筛选;另一种策略是细胞内化筛选,特异性抗体被内化入细胞,然后用酸性洗脱液洗脱掉细胞膜上非特异结合的噬菌体抗体后裂解细胞,获得特异性抗体。其余筛选方法还有切片组织筛选、体内筛选等,适用面较窄,未获推广。筛选效率主要通过以下几项的检测:转化数,即被感染的噬菌体数,它随筛选轮数的增加而增加;抗体基因插入载体的频率,高比例的丢失意味着筛选的低效率;抗体亲和性。抗体库技术避免了杂交瘤技术中的许多难点,如细胞融合、动物免疫等,目前该技术已逐渐在肿瘤诊断和肿瘤治疗中发挥重要作用。

肿瘤防治杂志,2005,12(23):1829-1832

##

[ABSTRACT] PhageantibodymeansthoseFaborscFv,whichdisplayinthemembraneofphages.Therepertoiresoftheseantibodiesareantibodylibrary.Biopinnedbyantigenorcell,relevantantibodycanbegot.Classicalbiopanningtech-niqueisantigen(solidifiedorliquefied)recognitionbypurifiedantigen,whenthepurifiedantigencannotbeobtained,theclassicaltechniquecannotbeapplied.Sofullcellbiopanninghasappeared,whichneedsnotpurifyantigen,butthetargetantigenmustbehighlyexpressed,otherwise,somestrategycanbeused.Oneiswipingofftheirrespectiveantigenbynor-malcells,thentumorcellantigenisrelativelyhigh,anotherstrategyisinternalizingbiopanning:specialantibodyisinter-nalizedbycertaintechnique,thentheirrelativeantibodyiswashedoff,specialantibodyisgotbysplittingthecells.Oth-ertechniquessuchasintissuesectionsselectionandinvivoselectionwerenarrowlyapplied.Thebiopanningefficiencyisdetectedbyfollowingaspects:transformingunit,enhancedwiththeroundofbiopanning;thefrequencyofgenefusing,highdeletionofantibodygenemeaninglowefficiency;theaf-finityofantibody.Theantibodylibrarytechniquecanavoidmanyproblemsofhybridomasuchascellfusionandanimalimmunity.Ithasbeenusedintumordiagnosisandtreatment.

ChinJCancerPrevTreat,2005,12(23):1829-1832

=关键词> 肿瘤/免疫学;噬菌体/免疫学;抗体,细菌;综述文献

[KEYWORDS] neoplasms/immunology;bacteriophages/immunology;antibodies,bacterial;reviewliterature=中图分类号> R730.3 =文献标识码> A =文章编号> 1009-4571(2005)23-1829-04

噬菌体抗体是指表达在噬菌体表面的抗体分子Fas或单链抗体ScFv。用基因克隆技术将B细胞全

=第一作者简介> 薛国柱,男,河南新野人,博士,副主任医师,主要从事肿瘤抗体研究工作。

Tel:86-29-83375259 E-mail:xgzhu2003@yahoo.com.cn=通讯作者简介> 窦科峰,男,陕西乾县人,博士,教授,博士生导师,主任医师,主要从事肝癌、肝移植的研究工作。Tel:86-29-83375259 E-mail:gdwk@fmmu.edu.cn

套可变区基因克隆出来,组装到表达载体内并表达到噬

菌体表面成为噬菌体抗体的群体,即为噬菌体抗体库[1]。经特定抗原或细胞筛选后获得该特异性抗体。该技术可绕过免疫制备全人源性抗体,避免了鼠源性抗体在人体应用时诱发HAMA等不良反应,成为继多克隆抗体、单克隆抗体之后的第三代基因工程抗体技术,在生物科学,尤其是肿瘤研究领域极具潜力

[2,3]

。

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薛国柱,等 噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用

1 噬菌体抗体库的筛选方法

噬菌体抗体的特点是它既可以识别相应抗原与其相结合,又能够感染宿主菌进行再扩增。利用这一特性,利用靶抗原亲和-吸附-洗脱-扩增,可筛选到靶分子的配体肽链[4]。可经突变和链置换方法改进抗体亲和力,最终获得高亲和力的特异性抗体。要获得高亲和力的噬菌体抗体,抗体库的筛选是关键环节和步骤[1,5]。抗体库的筛选,需要优化许多条件,更重要的是优化筛选策略。

噬菌体抗体库的筛选包括2个主要步骤:淘筛和鉴定[5,6]。淘筛(panning)是指噬菌体抗体库与选择的抗原共同孵育,通过几轮洗脱中断噬菌体-抗原反应,而同时不影响噬菌体的感染能力,弃去未结合的噬菌体,收集结合的噬菌体。获得的噬菌体感染细菌并扩增,进行下一轮淘筛。几轮淘筛后富集到抗原特异性结合的噬菌体多克隆。筛选过程包括将从噬菌体多克隆中挑选出单克隆抗体;淘筛出的噬菌体感染细菌、铺板,挑选单克隆。至此可得到高特异性单克隆菌株,并可继续分离出抗体基因,可进一步分析、鉴定和工程化生产[5]。1.1 固相或液相纯化抗原的筛选

用纯化或重组的抗原从噬菌体抗体库中筛选噬菌体抗体的传统方法主要有:1)将纯抗原包被在固相介质上,如酶标板、免疫试管或亲和层析柱,然后加入待筛选的噬菌体,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收高亲和性的噬菌体。2)将抗原与生物素基团相连,再将其固定在包被有链亲和素(streptavidin)的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。生物素化的抗原与磁珠结合,再通过磁场将结合抗原的噬菌体与未结合的噬菌体分开。当筛选大库容量的抗体库时,液相筛选会更好些,因为它可以增加抗原与结合噬菌体接触的机会。回收的噬菌体感染宿主菌,增殖后进行下一轮筛选

[7]

感染能力,进入宿主细胞增殖。这一系统也显示了较高的筛选效率。1.2 全细胞筛选

目前,文献报道的特异性噬菌体抗体多数是由固相纯化抗原筛选得到的[4]。经典筛选技术的前提条件是目标抗体所针对抗原的性质明确,能得到抗原纯品。对于抗原无法提纯、抗原性质不确定(如癌细胞表面受体),或传统筛选会使抗原失活(如某些膜的内在蛋白)的情况,传统筛选技术不再适用,建立新的筛选系统成为研究的另一个重点。为了提高筛选效率,许多研究者对传统的筛选技术进行了改进。

为了分离得到肿瘤特异性抗体,必须在肿瘤抗原上进行筛选。最近,直接用细胞系从单链噬菌体抗体库筛选细胞表面受体结合抗体已有报道[10]。人们通过改进筛选策略,用肿瘤作为靶抗原已从噬菌体抗体库中筛选出许多肿瘤特异性抗体,如Kupsch等[11]筛选出了与黑色素瘤细胞特异性结合的抗体。

用全细胞来筛选抗体库,目标抗原一定要有较高的表达水平,一般在筛选前有必要先与不表达该抗原的细胞进行孵育。Ridgway等[12]就是采用这一方法先用正常的支气管上皮细胞系将非特异的噬菌体抗体预先清除后,再用肺腺癌细胞系成功地筛选到了抗CD55的单链抗体。但其筛选效率仍较低,且容易丢失亲和性噬菌体。因此,有的学者把少量抗原阳性的细胞与大量抗原阴性的细胞混合,其中抗原阴性的细胞可吸附非特异性的噬菌体,而特异性的噬菌体可竞争性地与抗原阳性细胞结合,再用荧光激活细胞分类法(fluorecence-activatedcellsorter,FACS)将结合有特异性抗体的抗原阳性细胞分离。此法筛选的效率虽高,但其中需有靶细胞特异性抗体,故不适用于靶细胞特异性抗体难以得到的情况,如癌细胞,且受FACS本身的。Siegel等

[13]

[9,10]

。提出了磁性细胞分离法

为提高筛选效率,对传统的用包被在固体表面的抗原进行筛选的方法进行了不断改进,如将噬菌体感染宿主菌的过程与筛选过程相关联,产生了选择性感染系统。传统的筛选系统中基因重组噬菌体仍有野生型的pÓ蛋白存在。因此,重组噬菌体具有感染能力,这导致了在筛选后的扩增时,特异性和非特异性的噬菌体均可进入宿主菌增殖。选择性感染噬菌体(se-lectively-infectionphage,SIP)筛选系统把筛选和扩增合并为一步,只有特异性噬菌体才能感染宿主菌扩增。这样不仅简化了筛选步骤,而且大幅度地提高了筛选效率。噬菌体感染E.coli细胞是通过Fpilus(伞毛)介导,噬菌体外壳pÓ蛋白N端参与噬菌体穿过细胞膜和同Fpilus的结合。SIP筛选的基本原理是把其中之一用特定的多肽或蛋白替代使配基的结合恢复感染能力,只有特异性噬菌体可以通过配基的结合恢复[8]

(magnetically-activatedcellsorting,MACS),抗原阳性细胞预先包裹磁珠,然后混入大量作为非特异性噬菌体吸收体的抗原阴性细胞中,加入待筛选的噬菌体后,结合有特异性噬菌体的抗原阳性细胞用磁柱快速分离。他们采用磁激活细胞分离法,以人血红细胞Rh(D)-positive为靶细胞,Rh(D)-negative为非特异性噬菌体吸收体,成功地从Fab噬菌体抗体库中筛选出了一系列抗Rh(D)的抗体。

研究结果表明,噬菌体抗体库也可以细胞内化进行筛选[14]。配体-受体的复合体经内化的方式吞入细胞内,抗体与抗原的结合可以模拟这一过程。其基本步骤是:先用非抗原表达细胞吸附抗体库后,再将吸附后的抗体库与抗原表达细胞在37e下孵育15min,使特异性抗体被内化入细胞,然后用酸性洗脱液洗脱掉与细胞膜非特异结合的噬菌体后裂解细胞,再用裂解肿瘤防治杂志2005年12月第12卷第23期 CHINJCANCERPREVTREAT,December2005,Vol.12 No.23

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液中含有的特异性噬菌体感染细菌。由于酸性洗脱液对于噬菌体的感染有一定影响,所以细胞结合筛选的洗脱液酸度不可能太大,因而不能最大限度地去除非特异性噬菌体。而采用细胞内化的方法后,在特异性噬菌体已经被内化后才开始洗脱,所以完全可以加大洗脱液的酸度而不必担心特异性噬菌体的丢失。通常控制配基和抗体内化进入细胞的方法是用低pHbuffer(glycine-HCl,pH218)来分离表面结合抗体。1.3 切片组织筛选

制备噬菌体抗体的目的主要是应用于临床,为更接近于临床应用,筛选到真正与人肿瘤组织特异的噬菌度化。Tordsson等[15]报道用冷冻组织切片来进行筛选,但回收和富集的噬菌体较少,因抗原量有限。1.4 体内筛选

Mutuberria等报道用表达EGF-2阳性的大肠癌细胞系接种裸鼠,然后尾静脉注入抗体库,在不同时间处死裸鼠,回收组织内噬菌体。Johns等[16]用类似方法在小鼠胸腺内筛选出了抗内皮细胞特异性单链抗体。这一方法更适合于分离针对肿瘤血管内皮细胞上特异性抗原的噬菌体抗体。

[6]

以介导噬菌体有效的细胞内化,ScFv或Fab进行多价连接后介导内化作用明显增强。几个细胞表面受体已显示出能介导抗体内化,如EGFreceptor、erbB2和转铁蛋白受体,还有神经黏附分子(neuralcelladhe-sionmolecule,NCAM)、前列腺特异性膜抗原(pros-tatespecificmembraneantigen,PSMA)、癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)及黏液素(mu-cins)。细胞内化抗体筛选对抗体和抗体介导的靶向药物治疗尤为重要[4,5]。3.1 肿瘤治疗研究

自从首次报道用鼠B细胞融合杂交瘤生产单克隆抗体以来已有28年。FDA批准同意单克隆抗体治疗也已17年(OKToR3)。到目前为止,各制药公司正在生产多达12种的mAb。2002年最新通过了Zeva-lin和Xolair两种。目前,进行临床试验的单克隆抗体约有140种,大部分仍是由鼠杂交瘤技术生产。约15%是全人抗体,由转人抗体基因鼠或噬菌体展示人抗体库生产。后者在临床研究中约占30%

[5]

TM

TM

。

作为肿瘤生物学和抗体工程技术发展的结果,最初批准用于治疗人类肿瘤的两种抗体已进入临床应用,用于治疗非霍奇金淋巴瘤的Rituxan和治疗乳腺癌的Herceptin。这两种抗体都能和过度表达于靶肿瘤细胞表面受体(非霍奇金淋巴瘤的CD20和乳腺癌的erbB-2)结合。Rituxan和Herceptin可产生直接治疗效果,或诱导细胞凋亡(Rituxan),或产生生长抑制(Herceptin)。只有抗体的一部分作用于已知细胞表面受体(如erbB-2),产生这种直接抑制肿瘤生长的作用。因此,必须设法采用其他策略,如用抗体连接对肿瘤细胞有杀伤作用的毒素等。Herceptin应用于erbB-2过表达的乳腺癌患者的临床试验结果表明,单独应用曲佐单抗的有效率为1116%~16%,而与化学药物联合治疗的有效率可达50%。与单独化疗相比,进展期复发乳腺癌患者的生存期延长,死亡率降低。

erbB-2是肿瘤研究领域的热点癌基因,其产物蛋白p185工程抗体已用于多种肿瘤的诊疗。Wright等[18]证实erbB-2特异ScFv对erbB-2高表达细胞系有明显细胞毒作用。利用erbB-2ScFv和假单胞外毒素融合蛋白可使肺癌和前列腺癌动物模型肿瘤体积明显缩小。完全人表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorrecep-tor,EGFR)抗体对EGFR高表达的实体组织肿瘤具有良好的生长抑制作用[5]。噬菌体抗体技术出现后,治疗性抗体的发展出现了新的转折。基因工程抗体将产生大量新的基于抗体的治疗方法

[19,20]

[17]

[2,4]

2 筛选效率的检测

在噬菌体筛选过程中,常常存在/插入丢失克隆0的积累,即编码部分或全部克隆Fab或ScFv的噬菌体克隆丢失了。携带这些克隆(没表达Fab或ScFv)的大肠埃希菌细胞比表达有Fab或ScFv的细胞的生长速度快。因此,对每一轮筛选都需要进行检测,以证实筛选的有效性。需要进行3个方面的测试:1)感染的噬菌体数(转化数,transformingunit)。它随筛选轮数的增加而增加。2)抗体基因插入载体的频率。由于噬菌体表达的一个突出问题是外源基因的部分或全部丢失。因此,有必要用PCR检测被洗脱的噬菌体感染的宿主单克隆。高比例的丢失意味着筛选的低效率。3)亲和性。随机选择一些被洗脱的噬菌体感染的宿主单克隆,用ELISA鉴定洗脱噬菌体的亲和性[5]。

3 抗体库筛选技术在肿瘤诊断和治疗方面的应用

噬菌体抗体库技术省去了传统单抗制备中的细胞融合,甚至可以不经免疫,直接利用抗原从库中筛选特异性抗体,并可直接克隆到抗体基因,使单抗的制备变得简单易行、稳定有效。这一技术面临的挑战是如何在最大限度地减少非特异性的噬菌体结合的同时,最大限度地富集特异性噬菌体。因此,筛选方法的改进始终是该技术发展的动力[2,5]。

噬菌体抗体库将单拷贝连接于噬菌体pÓ蛋白的ScFv或Fab展示于噬菌体表面,假如单价展示不足。利用抗肿瘤相关

抗原的单抗与药物前体、酶或细胞因子交联,靶向定位到肿瘤局部,激活药物前体使之转变为细胞毒药物,在肿瘤局部发挥细胞毒作用,以克服药物所致的全身毒副反应,或通过单抗介导提高肿瘤局部细胞因子浓度,研

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究已显示了较好的靶向治疗效果。应用抗CEATNFA

单抗联合放疗治疗进展期大肠癌,较单独放疗有明显抑制肿瘤细胞生长的效应[21]。

3.2 放射免疫成像和治疗

用连接放射性核素的抗体的放射免疫治疗或免疫成像定位是一很有前途的肿瘤治疗诊断方法。以标记抗体注入体内显示肿瘤部位抗原与抗体结合形成放射性浓集,可以进行肿瘤的放射免疫成像和治疗。美国已有铟标记的肿瘤抗体经FDA批准用于临床[1,5]。

4 结语

抗体不仅有特异性识别抗原决定簇的能力,而且具有很好的稳定性和根据需要工程化生产的可能。因此,抗体技术出现后即引起了广泛关注并得到迅速发展。分析潜在的组成有机体的成千上万的蛋白质需要大量的通用的和特异性工具,如对蛋白质分析的McAb,对深入分析其构型表达和功能研究具有重大作用。噬菌体抗体除了可提供治疗性抗体外,也非常适合肿瘤识别研究之用。因此,噬菌体抗体库技术的出现及噬菌体抗体的研制成功已成为生命科学研究的突破性进展之一,必将为生物技术领域的发展,尤其是肿瘤研究和应用带来巨大的推动。

抗体的肿瘤治疗策略均依赖于抗体结合到细胞表面受体,产生受体介导的细胞内化,将细胞毒素等引入细胞。近来,已可直接从噬菌体抗体库筛选可内化入哺乳动物细胞的抗体片段,抗体作为靶向非病毒基因治疗载体,为了将基因转入细胞内,也需要诱导细胞内化的抗体。像生长抑制一样,免疫反应产生的大部分抗体不与细胞受体结合激发细胞内化。直接从噬菌体抗体库筛选能特异性结合到细胞表面,并能进行一系列内化的抗体,给人们提供了又一有广泛用途的寻找适于抗癌治疗的全人源化抗体方法

[5,9][1-3]

。

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收稿日期:2004-01-14 修回日期:2004-06-02

(编辑:范开席)