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Pull Down实验流程
1. 混合两种预测相互作用的蛋白。（Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用GST 树脂IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down。） 2. 加入1 mL Binding Buffer。
Binding Buffer：50 mM Tris.HCl （pH7.50.） 100 mM NaCl
0.25% Triton-X 100
35 mM β-Me（巯基乙醇）
3. 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4 h。 4. 加入20-30 μL GST-BindTM Resin结合2-4 h。
5. 4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。 6. 加入1 mL Binding Buffer，4 ℃条件下旋转混匀5-10 min，4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清。
7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。 8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的 Loading Buffer，95℃金属浴5-10 min，150-200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。 电泳样品顺序：
Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B
此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。
用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下： （input，蛋白量为后两者的1/10）
Marker，Protein-B-HIS ， GST+ Protein-B-HIS， Protein-A-GST+ Protein-B-HIS Marker，Protein-A-GST ， HIS+ Protein-A-GST， Protein-B-HIS+ Protein-B-GST
9. 转PVDF膜，350 mA 恒流，2 h 左右。（PVDF膜用之前，用甲醇泡2 min） 10. 做Western Blot 过程：
预杂交1 h 以上；杂交一抗1 h 以上；洗膜三次，每次10 min ；杂交二抗1 h 以上；洗膜三次，每次10 min。 11. 显影：
用1 mL 发光液A + 1 mL发光液B浸润PVDF膜，然后固定，显影液显影1 min（时间可以适当调整），水洗，定影1 min。 12. 扫描杂交胶片结果。
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