中国现代药物应用２０１３年３月第７卷第６期Ｃｈｉｎ ＪＭｏｄ ＤｍｇＡｐｐｌ。Ｍａｒ ２０１３，Ｖｏ１．７，Ｎｏ．６ ・５・ 盐酸阿扑吗啡鼻喷剂微生物限度检查方法 的验证 王连兰郭小红 【摘要】 目的建立盐酸阿扑吗啡鼻喷剂微生物限度检查方法，所检测的样品及检验程序不得对 可能存在的各类微生物产生抑制作用。方法《中国药典）２０１０年版二部附录收载的微生物限度检查法 中的薄膜过滤法进行实验。结果薄膜过滤法试验中稀释剂对照组的菌回收率和试验组的菌回收率均 大于７０％，微生物没有抑制作用。结论微生物限度检查方法可以采用薄膜过滤法。 【关键词】 盐酸阿扑吗啡鼻喷剂；微生物限度；验证 Ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｎａｓａｌ ｓｐｒａｙ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌｉｍｉｔ ｔｅｓｔｓ ＷＡＮＧ Ｌｉａｎ—ｌａｎ， ＧＵＯ Ｘｉａｏ— ， ．ｚｈｑｉａｎｇ Ｊｉｍｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，３１８０２０ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｅｈｌｏｒｉｄｅ ｎａｓａｌ ｓｐｒａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌｉｍｉｔ ｔｅｓｔｓ，ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｓｈａｌｌ ｎｏｔ ｍａｙ ｅｘｉｓｔ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏ－ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ“Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ’’２０１０ ｅｄｉｔｉｏｎ ｔｗｏ ａｐｐｅｎｄｉｘ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌｉｍｉｔ ｔｅｓｔ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｈｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｄｉｌｕｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｒａｔｅｓ ａｒｅ ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ ７０％，ｎｏ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒ－ ｇａｎｉｓｍｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｌａ ｌｉｍｉｔ ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｎａｓｌａ ｓｐｒａｙ；Ｍｉｃｒｏｂｉｌａ ｌｉｍｉｔ；Ｔｅｓｔ １供试品、培养基、器材及菌种 养物，加３～５ ｍｌ含０．０５％聚山梨酯８０的０．９％无菌氯化钠 １．１供试品盐酸阿扑吗啡鼻喷剂批号：１１０４１７由浙江济 溶液将孢子洗脱，再用无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试 民制药股份有限公司提供（注：验证试验采用一批供试品三 管内，用含０．０５％聚山梨酯８０的０．９％无菌氯化钠溶液将菌 次的平行试验） 悬液稀释至每１ ｍｌ中含１０—１００ＣＦＵ的孢子悬液，做活菌计 １．２培养基脂培养基（批号１０１１３０）；玫瑰红钠琼脂培养 数备用。采用中国药典２０１０版提供的方法制备菌液，除黑 基（批号１１０８０８）；改良马丁培养基（批号１１０５２４２）；改良马 曲霉菌液取１０－５外，其余５种均取１０－７的菌液。 丁琼脂培养基（批号１００６２２）；胆盐乳糖培养基（批号 ３方法及结果 １０００３１）；营养肉汤培养基（批号１００６２８）；甘露醇氯化钠培 中国药典有关微生物限度检查法方法验证试验 。 养基（批号１００８２５）；硫乙醇酸盐流体培养基（批号１１０３１１）； ３．１菌落计数（常规法） ４－甲基伞形酮葡糖苷酸（ＭＵＧ）培养基（批号：０９１０２９）；麦康 ３．１．１供试液的制备样品１Ｏ ｍｌ，加ｐＨ７．０无菌氯化钠－ 凯琼脂培养基（批号１００１２５）；溴化十六烷基三甲铵琼脂培 蛋白胨缓冲液至１００ ｍｌ，充分摇匀制成１：１０的供试液。 养基（批号：１０１００５）；稀释液（冲洗液）：ｐＨ７．０无菌氯化钠－ ３．１．２试验组薄膜过滤法，取两只已灭菌的可拆卸集菌 蛋白胨缓冲液（批号１１０５３１２）；以上培养基、稀释液均由北 器，先泵入１００ ｍｌ左右的ｐＨ７．０无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液， 京三药科技开发公司生产。 再泵入２０Ⅱｄ上述供试液，混匀，过滤。用ｐＨ７．０无菌氯化 １．３器材ＨＴＹ－２０００Ａ集菌仪；ＰＹ一３３０型号一次性使用集 钠．蛋白胨缓冲液，冲洗滤膜３次，每次１００ ｍｌ，在最后一次淋 菌培养器（批号２０１１０９２４）；可拆卸式集菌仪培养器以上器 洗液中分别接人１ ｍｌ已制备好的菌液，取出滤膜，菌面朝上 材均由杭州泰林医疗器械有限公司提供。 贴于琼脂培养基平板上培养。重复上述操作，做完其余的试 １．４验证用微生物及其菌号枯草芽胞杆菌ＣＭＣＣ（Ｂ） 验菌。每株试验菌平行制备２个平皿，按平皿法测定其 ６３５０１，金黄色葡萄球菌ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３大肠埃希菌ＣＭＣＣ 菌数。 （Ｂ）４４１０２，白色念珠菌ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１，黑曲霉ＣＭＣＣ（Ｆ） ３．１．３供试品对照组验组的方法处理，不加菌液，菌面朝 ９８００３，铜绿假单胞菌ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４ 上贴于相应的培养基培养。 ２菌液制备 ３．１．４菌液组１ ｍｌ上述制备的菌液，直接接种于平皿，加 ２．１取经３０～３５￣Ｃ培养ｌ８～２４ ｈ，金黄色葡萄球菌、大肠埃 入相应的培养基培养。 希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌的肉汤培养物１ ｍｌ加９ ３．１．５稀释剂对照组直接以ｐＨ７．０无菌氯化钠－蛋白胨 ｍｌ盐水（０．９％无菌氯化钠溶液），１０倍稀释至１０－７，细菌数 缓冲液替代供试品，其余试验操作同试验组。 约为１０～１００ＣＦＵ／ｍｌ，做活菌计数备用。 ３．２培养营养琼脂培养平皿倒置于３Ｏ℃～３５￣Ｃ下培养３ ２．２经２０～２５￣Ｃ培养２４—４８ ｈ的白色念珠菌改良马丁液 ｄ；将玫瑰红钠琼脂培养平皿倒置于２３￣Ｃ一２８￣Ｃ下培养５ ｄ。 体培养物１ ｍｌ加９ ｍｌ盐水（０．９％无菌氯化钠溶液），１０倍 ３．３观察和计数平皿逐日检查计数，结果以培养终了时 稀释至１０－７，细菌数约为１０～ＩＯＯＣＦＵ／ｍｌ，做活菌计数备用。 的计数方法为准，并将每组试验中接有相同试验菌株的２个 ２．３取经２０～２５￣Ｃ培养５～７ ｄ的黑曲霉改良马丁琼脂培 平皿计数进行平均，取平均值。 作者单位：３１８０２０浙江济民制药股份有限公司 ・６・ 中国现代药物应用２０１３年３月第７卷第６期Ｃｈｉｎ ＪＮｏｄ ＤｒｕｇＡｐｐ１．Ｍａｒ２０１３，Ｖｏ１．７．Ｎｏ．６ 表１菌液组计数结果（ＣＦＵ／ｍ１） 实验次数 人工染菌回收率（％） 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 铜绿假单胞菌 供试品对照组的细菌总数和霉菌总数均＜１个／ｇ，根据 在最后一次淋洗液中加入金黄色葡萄球菌菌液，取出滤膜， 以上结果：在三次的平行试验中，稀释剂对照组的菌回 放至１００ ｍｌ的硫乙醇酸盐流体培养基。置３０％～３５％培养 收率和试验组的菌回收率均大于７０％。 箱培养２４～４８ ｈ。 ４控制菌检查法 ４．３阴性对照组方法同试验组，用金黄色葡萄球菌作为 ４．１供试液的制备同菌落计数法。 大肠埃希菌的阴性对照菌，用大肠埃希菌作为金黄色葡萄球 ４．２试验组采用薄膜过滤法，取两只已灭菌的可拆卸集 菌和铜绿假单胞菌的阴性对照菌。置３０％～３５％培养箱培 菌器，先泵入１００ ｍｌ左右的ｐＨ７．０无菌氯化钠－蛋白胨缓冲 养２４—４８ ｈ。 液，再泵入２Ｏ ｍｌ上述供试液，混匀，过滤。用ｐＨ７．０无菌氯 ４．４结果取接有大肠埃希菌的试验组及其阴性对照组的 化钠－蛋白胨缓冲液，冲洗滤膜３次，每次１００ ｍｌ，在最后一次 培养物０．２ ｍｌ，分别接种至５ ｍｌＭＵＧ培养管内，３０％一３５％ 淋洗液中加入已制备好的菌液（其中一管加入１ ｍｌ的大肠 培养箱培养５—２４ ｈ，取未接种的ＭＵＧ培养管作本底对照， 埃希菌菌液，另一管加入１ ｍｌ的铜绿假单胞菌菌液）。取出 将各管置３６５ｎｍ紫外光灯下检视，如有大肠埃希菌生长应呈 滤膜，分别放至１００ ｍｌ的胆盐乳糖培养基中。同以上操作， 现荧光，然后加数滴靛基质试液，结果见表４。 表４ 注：“＋”表示有典型的大肠埃希菌生长 取接有铜绿假单胞菌的试验组及其阴性对照组的培养 根据以上结果，本品控制菌检查采用薄膜过滤法，培养 物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上， 基用量为１００ ｍｌ。 ３０％一３５％培养箱培养１８～２４ ｈ。结果：试验组菌落呈扁 ５小结 平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色色 盐酸阿扑吗啡鼻喷剂的微生物限度检查方法对微生物 素扩散。表示有典型的铜绿假单胞菌生长。阴性对照组没 生长没有抑制性影响。因此，此方法验证通过。 有检出铜绿假单胞菌。 取接有金黄色葡萄球菌的试验组及其阴性对照组的培 参考文献 养物，划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养 ［１］苏德模，马绪荣．药品微生物学检验技术．华龄出版社，２００７： ２４—７２ ｈ。结果：试验组菌落呈金黄色，圆形凸起，边缘整齐， ２７７．３１６． 外围有黄色环，菌落直径０．７—１ ｍｍ。表示有典型的金黄色 ［２］ 国家药典委员会．中国药典．（二部）．中国医药科技出版社， 葡萄球菌生长。阴性对照组没有检出金黄色葡萄球菌。 ２０１０：附录１０７－１１６．
