中国卫生检验杂志２０１３年７月第２３卷第７期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌ ２０１３；Ｖ０１ ２３ Ｎｏ ７ 【论著】 正交试验设计优化小鼠脑组织中１，３一二苯一１，３一丙二酮测定的实验研究 孙生志，陈娟，曹望楠，崔蓉 ，刘晓晓，张宝旭 （北京大学公共卫生学院，北京１００１９１） ［摘要］ 目的：用正交试验设计法优化测定小鼠脑组织中１，３一二苯一１，３一丙二酮含量的实验条件，提高 测定方法的灵敏度。方法：运用基团贡献法筛选萃取剂，然后采用正交试验设计法优化实验条件。结果：乙 酸乙酯／Ｔｒｉｔｏｎ ｘ一１００（９０：１０，ｖ／ｖ）是小鼠脑中１，３一二苯一１，３一丙二酮的最优萃取剂。当萃取剂体积为 ４００ ｔｚｌ，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００所占体积比为２０％，萃取时间为３ ｍｉｎ，离心时间为４ ｍｉｎ，定容溶液中水所占体积比为 １０％时，萃取效率最高。在上述最优的实验条件下测定ＤＰＰＤ的定量下限为２ ｇ／ｍｌ；加标回收率为１０３．５％ １１２．０％；日内和日问精密度测定结果的相对标准偏差多小于１０％。结论：正交试验设计法对测定小鼠脑 中１，３一二苯一１，３一丙二酮含量的实验条件的优化效果令人满意，建立的检测方法能够很好地满足实际测 ～定的需求。 ［关键词］ １，３一二苯一１，３一丙二酮；基团贡献法；正交试验设计；高效液相色谱 ［中图分类号］ Ｒ９６９．１ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １００４—８６８５（２０１３）０７—１６５２—０５ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ １，３一ｄｉｐｈｅｎｙｌ一 １．３一ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｎｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ＳＵＮ Ｓｈｅｎｇ—ｚｈｉ，ＣＨＥＮ Ｊｕａｎ，ＣＡＯ Ｗａｎｇ—ｎ０凡，ＣＵＩ Ｒｏｎｇ ，ＬＩＵ Ｘｉａｏ—ｘｉａｏ，ＺＨＡＮＧ Ｂａｏ一 （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９１，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ １，３一ｄｉｐｈｅｎｙｌ一１，３一ｐｒ０． ｐａｎｅｄｉｏｎｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｍｅｔｈ— ｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｇｒｏｕｐ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｃｏｎｄｉ． ｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ ｆｏｒ １，３一ｄｉｐｈｅｎｙｌ一１，３ 一ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｎｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｗａｓ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ／Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００（９０：１０，ｖ／ｖ），ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ ｖｏｌｕｍｅ ｗａｓ ４００ Ｉｘｌ，ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００ ｗａｓ ２０％，ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ３ ｍｉｎ，ｔｈｅ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ４ ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｖｏｌｕｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ １０％．Ｔｈｅ ｌｏｗｅｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ＤＰＰＤ ｗａｓ ２ ｇ／ｍｌ，ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗｅｒｅ １０３．５％～１ １２．０％，ａｎｄ ｍｏｓｔ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉ— ａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａ—ｄａｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒ—ｄａｙ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｌｌｌｅｓｓ ｔｈａｎ １０％ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ： Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗａｓ ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ ｗｈｅｎ ａｐｐｌｙｉｎｇ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｃｏｎ－ ｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ １，３一ｄｉｐｈｅｎｙｌ一１，３一ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｎｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｓａｔｉｓｆｙ ｔｈｅ ｎｅｅｄｓ ｏｆ ａｃｔｕａｌ ｔｅｓｔ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ １，３一ｄｉｐｈｅｎｙｌ一１，３一ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｎｅ；Ｇｒｏｕｐ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ； Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １，３一二苯一１，３一丙二酮（ＤＰＰＤ），无色至浅黄色 斜方形片状结晶，是从甘草中提取的一种成分（结构式 见图１）。研究发现，ＤＰＰＤ具有抑制ＤＭＢＡ（７，１２一ｄｉｍ— ｅｔｈｙｌｂｅｎｚ［ａ］ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）诱导肿瘤的作用 ，也具有抗 炎的作用 。同时，有研究显示ＤＰＰＤ对小鼠急性肝损 伤具有保护作用，其可能的机制是ＤＰＰＤ可以促进肝内 ＧＳＨ的合成，使其抗氧化损伤功能增强 。近期的研究 也表明ＤＰＰＤ具有抗内质网应激和氧化应激的神经保护 ［作者简介］ 孙生志（１９８７一），男，山东，硕士研究生，从事环境 及生物样品理化检验分析研究。 通讯联系人，Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｕｉｒｏｎｇｌ９＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ 因子 。因此，ＤＰＰＤ有望成为治疗上述疾病的备选药 物。然而，有关ＤＰＰＤ的药代动力学研究仍较少 ～ ，特 别是有关ＤＰＰＤ在脑部的分布、代谢情况的研究目前尚 未见报道。究其原因可能有两个：其一：ＤＰＰＤ的上述生 物学功能是近几年发现的，其实际的临床应用仍在探索 之中；其二：由于血脑屏障的存在，用药后ＤＰＰＤ进入脑 组织的量非常少，因此对检测方法提出很高的要求，特 别是实验的前处理条件。为进一步揭示ＤＰＰＤ的药代动 力学特点和规律，为研发新药提供必要的基础实验数 据，建立准确灵敏的脑组织中ＤＰＰＤ含量的检测方法是 当前亟待解决的问题。 中国卫生检验杂志２０１３年７月第２３卷第７期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌ ２０１３；Ｖｏｌ ２３ Ｎｏ ７ １６５３ ～｝Ｉ ８。 图１ １，３一二苯一１，３一丙二酮（１，３一ｄｉｐｈｅｎｙｌ一１。 ３一ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｎｅ，ＤＰＰＤ） 生物样品中目标物质的有效提取是样品前处理过 程中至关重要的实验步骤。萃取剂的选取一般根据相 似相溶的原则，但相似程度常难以准确掌握。较为严密 的方法是采用溶解度参数予以判断，它可使“相似相溶” 的经验定量化。溶解度参数常用的估算方法是基团贡 献法 。 。 取出脑组织，用生理盐水洗净表面的血液后，用滤纸吸 干后称重，按５００ ｍ ＩＩｌｌ生理盐水匀浆。脑匀浆保存于 ８０℃冰箱，待测。 取１００ ｌ空白小鼠脑组织匀浆或加标小鼠脑组织 匀浆，加入４００ ｇ／ｍｌ的内标溶液１０ ｌ，萃取剂２００ ｌ， 室温下涡旋混匀１ ｍｉｎ或超声提取１５ ｍｉｎ，１２０００ ｒ／ｍｉｎ 离心３ ｍｉｎ。上层溶液转入到干净的管中，室温下氮气 吹干，残渣用２００ 甲醇＋水（６＋１，ｖ／ｖ）溶解，混匀２ ｍｉｎ，０．４５ ｍ尼龙过滤器过滤，测定并记录ＤＰＰＤ的色 谱峰面积Ａ 。 １．３．２标准溶液的制备 分别取２ ｍｇ／ｎ＇ａ的ＤＰＰＤ标 一正交试验设计是一种适用于多因素、多水平的试验 设计方法，可从全面试验的水平组合中挑选出一部分有 代表性的“点”进行试验，同时对所得的实验结果进行统 计分析，从中得到试验因素的最优水平组合，具有很高 的工作效率 ｍ 。 本实验采用基团贡献法筛选ＤＰＰＤ的备选萃取剂， 应用正交试验设计法优化小鼠脑组织中１，３一二苯一１， ３一丙二酮含量测定的实验条件，同时，对建立的高效液 相色谱测定方法进行了论证，实验结果令人满意，能很 好地满足实际测定的需求。 １材料与方法 １．１仪器 Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱仪包括Ｗａｔｅｒｓ １５２５ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣ Ｐｕｍｐ，Ｗａｔｅｒｓ ７１７ ｐｕｌｓ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ，Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ Ｄｕａｌ Ａｂｓｏｒｂａｎｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ科技有限公司）；ＴＧＬ 一１６Ｇ台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；ＦＡ（Ｎ）／ＪＡ （Ｎ）系列电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）； ＢＦ２０００氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）；ＸＷ 一８０Ａ旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公 司）；Ｄ一１３０型手持式超细匀浆器（德国Ｗｉｇｇｅｎｓ公 司）。 １．２试剂 １，３一二苯一１，３一丙二酮（ＤＰＰＤ）标准品（纯度 ９９％，德国Ｍｅｒｃｋ公司）；内标物２一氰基一３，３一二苯基 丙烯酸一２一乙己酯（纯度９５％，日本ＴＣＩ公司）；甲醇 （纯度≥９９．９％，美国Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ Ｂ＆Ｊ公司）；乙酸乙酯 （纯度Ｉ＞９９．５％，北京化工厂）；冰醋酸（纯度≥９９．５％， 北京化工厂）；乙醚（分析纯，北京化工厂）；乙腈（纯度 ＞９９．９％，Ｂｕｒ１ｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ公司）；Ｔｒｉｔｏｎｘ一１００（纯度 １＞９９．０％，天津市光复精细化工研究所）；三氯甲烷（纯 度≥９９．０％，北京化工厂）。 ＤＰＰＤ、２一氰基一３，３一二苯基丙烯酸一２一乙己酯 标准储备液：分别称取ＤＰＰＤ和２一氰基一３，３一二苯基 丙烯酸一２一乙己酯标准品２０ ｍｇ，于１０ ｌｌｌｌ容量瓶中用 甲醇定容，其浓度均为２ ｍｇ／ｍｉ。内标物标准应用液：取 内标物储备液（２ ｍｇ／ｍ１），用甲醇将其稀释至４００ ｇ／ｍｌ。 实验动物，雄性健康的ＩＣＲ小鼠，ＳＰＦ级，体重２２ ｇ 一２４ ｇ，由北京大学医学部实验动物中心提供。 １．３ 实验方法 １．３．１ 样品预处理 将小鼠脱臼猝死，在冰面上迅速 准溶液和４００ ｇ／ｍｌ的内标溶液各ｌ０ ，加入２００ ｌ甲 醇＋水（６＋１，ｖ／ｖ）溶解，混匀２ ｍｉｒ，，０．４５ ｍ尼龙过滤 器过滤，测定并记录ＤＰＰＤ的色谱峰面积Ａ 。 １．３．３ 工作曲线的绘制 取一定体积的ＤＰＰＤ标准储 备液（２ ｒｅ＃ｍ１），用甲醇分别配制浓度为２ ｇ／ＩＩｌｌ，５ ｇ／ＩＩ１ｌ，１０ ｇ／ｍｌ，１００ ｇ／ｍｌ和４００ ｍｌ的ＤＰＰＤ标准 溶液。取１００ ｗｌ空白脑组织匀浆，分别加入上述不同浓 度的ＤＰＰＤ标准溶液和内标溶液（４００ ｇ／ｍ１）各１０ １， 配制标准系列。以ＤＰＰＤ的浓度为横坐标，ＤＰＰＤ与内 标物峰面积比为纵坐标，绘制工作曲线，计算回归方程。 １．３．４ 色谱条件 色谱柱：Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８柱 （２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ ｍ）；保护柱：Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ （２０ ｍｉｌｌ×３．９ ｍｍ，５ Ｉｘｍ）；紫外检测波长：３３２ ｎｍ；流动 相：含２％乙酸的甲醇＋水（６＋１，ｖ／ｖ）；流速：０．７ ｍｌ／ｍｉｎ；室温：２４℃；进样量１０ １。 １．３．５小鼠给药后ＤＰＰＤ的测定随机选取７只雄性 健康的ＩＣＲ小鼠，ＳＰＦ级，体重为２０ ｇ一２２ ｇ，由北京大 学医学部实验动物中心提供。ＤＰＰＤ溶于１％的吐温８０ 中，配成浓度为２５ ｍｇ／ｍｌ的ＤＰＰＤ混悬液。小鼠实验 前，先于动物房饲养２ ｄ。小鼠灌胃ＤＰＰＤ ８００ ｍｇ／ｋｇ，给 药后５ ｈ，取脑组织。加入５００ ｍｓ／ｍ１的生理盐水匀浆， 在正交试验设计法优化的实验条件下，采用高效液相色 谱法测定ＤＰＰＤ含量。 １．３．６数据处理实验数据采用Ｅｘｃｅｌ ２００７与ＪＭＰ９．０ 进行作图和统计分析。 ２结果与讨论 ２．１萃取剂的选择 本研究采用基团贡献法计算溶解度参数。根据ＤＰ． ＰＤ的分子结构式，由Ｓｍａｌｌ基团贡献法 “ 可计算其溶解 度参数，如表１所示。 表１ ＤＰＰＤ中基团的摩尔体积和摩尔吸引常数 ６＝２Ｆ ＝２２．２９式中６为溶解度参数， 为摩 尔吸引常数［（Ｃａｌ・ｃｍ。） ｍｏｌ ］， 为摩尔体积（ｃｍ ／ １６５４ 中国卫生检验杂志２０１３年７月第２３卷第７期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ０ｕｍａｌ ０ｆ ＨｅＭｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌ ２０１３：Ｖｏｌ ２３ Ｎ０ ７ ｍｏ１）。利用上式可计算得到ＤＰＰＤ的溶解度参数为 ２２．２９。根据溶解度参数相近的原则初选能用于萃取 ＤＰＰＤ的有机溶剂（见表２）。 表２筛选的有机溶剂及其溶解度参数 结合相关文献的报道，确定备选的萃取剂：乙酸乙 酯 、乙酸乙酯／甲醇（９５：５，ｖ／ｖ） 、乙醚／甲醇（５：９５， ｖ／ｖ）、乙腈 、三氯甲烷和乙酸乙酯／Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００ （９０：１０，ｖ／ｖ）。样品处理方法同２．１，高效液相色谱法测 定。以选择不同萃取剂时测得的ＤＰＰＤ的峰面积作为考 察指标，优选萃取剂。 同时，为了研究超声对萃取效果的影响 ，本实验 考察了以甲醇和乙酸乙酯作为提取试剂，超声萃取１５ ｍｉｎ的实验效果。ｌ ２ ３ ４ ２．２萃取剂选择的结果 不同萃取剂萃取所得的ＤＰＰＤ的一次提取回收率最 １ ２ ３ ４ 高可达８０．３１％；超声萃取１５ ｍｉ∞ ∞ ∞ ∞ ｎ与涡旋混匀１ ｍｉｎ的 提取效果无明显差异。结果见图２。故本实验确定乙酸 乙酯／Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００（９０：１０，ｖ／ｖ）为小鼠脑组织中ＤＰＰＤ 的最优萃取剂。 ＿ ＿ － Ｉ － ・ 。 注：提取回收率：（Ａｌ／Ａ ）×１００％。 图２不同萃取剂的一次提取回收率 ２．３正交试验设计 根据笔者经验和预实验结果，选取对萃取效果影响 较大的萃取剂体积（Ａ），Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００所占体积比 （Ｂ），萃取时间（Ｃ），离心时间（Ｄ）和定容溶液中水所占 体积比（Ｅ）作为考察的实验因素，每个因素设置４个水 平，按Ｌ （４ ）正交表进行试验，因素水平见表３。以 ＤＰＰＤ峰面积为考察指标，每个组合取３个平行样，以测 定结果的平均值作为该组合的实验结果，确定从小鼠脑 组织中提取ＤＰＰＤ的最佳水平组合。 表３五因素及其各水平取值 ＾冀ｖ惜 血 ● ∞∞ ∞∞∞：ｉ：柏＂０ ５ ∞∞∞∞∞∞∞∞∞∞ １０ １Ｏ １５ ｌ５ ２Ｏ ２０ ２５ ２．４正交试验结果 ２．４．１ 正交试验结果的极差直观分析试验过程中， 为进一步提高萃取效率，小鼠脑组织中ＤＰＰＤ采用乙酸 乙酯／Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００（９０：１０，ｖ／ｖ）提取两次，表４给出了 正交试验的分析结果。对试验结果进行极差分析，可知 各因素对ＤＰＰＤ峰面积的影响各不相同（参见图３）。影 响ＤＰＰＤ峰面积的诸因素的排序为：Ｅ＞Ｂ＞Ａ＞Ｃ＞Ｄ； 各因素的最优水平组合为Ａ Ｂ ｃ Ｄ Ｅ，。 表４正交试验结果及极差分析 １ １００ ５ １ ２ １Ｏ ６３．０５ ２ １００ １０ ２ ３ １５ ６６．１６ ３ １００ １５ ３ ４ ２０ ６９．９４ ４ １００ ２０ ４ ５ ２５ ６１．９Ｏ ５ ２００ ５ ２ ４ ２５ ６４．０１ ６ ２００ １０ １ ５ ２Ｏ ６７．５９ ７ ２００ １５ ４ ２ １５ ７３．８９ ８ ２００ ２０ ３ ３ １０ ８６．６７ ９ ３００ ５ ３ ５ １５ ６９．５２ １０ ３００ １０ ４ ４ １０ ７６．８９ １１ ３ｏｏ １５ １ ３ ２５ ６４．３Ｏ １２ ３００ ２Ｏ ２ ２ ２０ ７８．６２ １３ ４００ ５ ４ ３ ２０ ６６．４７ １４ ４００ １０ ３ ２ ２５ ７１．３９ １５ ４００ １５ ２ ５ １Ｏ ８Ｏ．６９ １６ ５ ５ ６ ５ ５ ５ ６ ７ ６ ６ ５ ６ ５ ６ ７ ６ ５ ７ ｌ ４ ５ ９ ４ ５ Ｏ ７ ６ ８ ８ ２ Ｏ ７ １ ８ ｌ Ｏ ９ ０ ５ ７ ７ １ １ ７ Ｏ ３ ５ ２ ０ ｌ ２ ９ ４ ６ ７ ４ ４ ９ ８ ０ ８ ８ １ ９ ０ ７ ５ ７ Ｏ ７ ２ ０ ９ ８ ９ ７ ６ ８ ２ ８ ３ ６ ３ ５ ４ ５ ２ １ ９ ３ ８ ３ ５ ５ ９ ３ ４００ ２０ １ ４ １５ ７７．０１ Ｔ１ ２２８１４ｏ７ ２２９８７７１ ２３７６５５８ ２５ａ７６８３ ２６８５５１５ Ｔ２ ２５５３２０２ ２４６４７１８ ２５２９７８３ ２４７８３３９ ２５０４３８０ Ｂ ２５２８４５３ ２５２４００２ ２６０００３７ ２５１５６２３ ２４６９８６６ Ｌ ２５８２８６２ ２６５８４３２ ２４３９５４５ ４４２７８ ２２８６１６２ Ｍ１ ５７０３５２ ５７４６９３ ５９４１４Ｏ ６２６９２１ ６７１３７９ Ｍ２ ６３８３０１ ６１６１８０ ６３２４４６ ６１９５８５ ６２６０９５ Ｍ ６３２１１３ ６３１Ｏ０ｏ ６５０００９ ６２８９０６ ６１７４６７ Ｍｄ ６４５７１６ ６６４６０８ ６０９８８６ ６１１Ｏ７０ ５７１５４ｌ Ｒａｎ ，Ｒ ７５３６４ ８９９１５ ５５８７０ １７８３６ ９９８３８ 因素排序 Ｅ＞Ｂ＞Ａ＞Ｃ＞Ｄ 最优水平 Ａ４ Ｂ４ ｃ３ Ｄ３ Ｅ１ 最优组合 Ａ４ Ｂ４ Ｃ３ Ｄ３ Ｅｌ 注：Ｔ：各因素不同水平下测得的ＤＰＰＤ峰面积之和；Ｍ：各因素不 同水平下测得的ＤＰＰＤ峰面积的均值；Ｒ：极差。 正交试验设计的极差直观分析可给出各因素不同 水平的最优组合，但无法考查各因素间的交互作用，为 进一步寻求更准确的最优组合，需要对试验结果进行统 计分析。 中国卫生检验杂志２０１３年７月第２３卷第７期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌ ２０１３；Ｖｏｌ ２３ Ｎｏ ７ １６５５ ■◆ －＿０Ｔ萃离水ｒｉｔ取心所ｏｎ荆时占Ｘ 阐体１０积所 占体积比 图３各因素对ＤＰＰＤ峰面积的贡献图 图中单元格的线条为点线而非实线。从图中可以看出 萃取剂体积与离心时间，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００所占体积比与定 容溶液中水所占体积比，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００所占体积与离心 时间之间的交互作用相对比较明显，而离心时问与定容 溶液中水所占体积比之间的交互作用不明显。 ，．监林＾— 旁一 ２．４．２ 正交试验结果的统计分析对Ａ、Ｂ、ｃ、Ｄ、Ｅ五 因素进行逐步响应面回归拟合，以最小ＢＩＣ为逐步回归 分析的停止规则。结果，Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ四因素被选人拟合模 二＞ ＜： 器 型。拟合模型中各参数的检验见表５。 表５拟合模型参数检验表 截距 ６７９９３９ ４００４９ １６．９８ ＜０．００１ Ａ ８３ ６３ １．３３ ０．２５５ Ｂ ５０２９ ６６６ ７．５５ ０．００２‘ Ｄ 一３８２３ ３１７６ —１．２ ０．３００ Ｅ 一９１４６ １１０５ —８．２８ Ｏ．ｏｏ１’ （Ａ一２５０）（Ａ一２５０）ｌ １ ０．９３ ０．４００ （Ａ一２５０）（Ｄ一３．５） 一１６６ ５０ —３．３ ０．０３０ （Ｂ一１２．５）（Ｄ一３．５） 一４００９ ２１４１ —１．８７ ０．１３５ （Ｄ一３．５）（Ｄ一３．５）４９９０ ４００５ １．２５ ０．２８０ （Ｂ一１２．５）（Ｅ一１７．５） 一６０９ １４８ —４．１１ ０．０１５ （Ｄ一３．５）（Ｅ一１７．５） 一７８８ １４２１ —０．５５ ０．６０９ （Ｅ一１７．５）（Ｅ一１７．５） ３９４ ２５７ １．５４ ０．２００ 模型 Ｆ＝２６．３。Ｐ＝０．００３’ 注：Ａ：萃取剂体积（ １）；Ｂ：Ｔｒｉｔｏｎ ｘ—１００所占体积比（％）；Ｄ：离 心时间（ｍｉｎ）；Ｅ：定容溶液中水所占体积比（％）。 Ｐ＜０．０５。 正交试验结果的拟合方程见下式，Ｒ ＝０．９９，Ｐ＜ ０．０５，方程拟合良好。方程的预测值一实际值参见图４。 ｒ ６７９９３９＋８３Ａ＋５０２９Ｂ－３８２３Ｄ一９１４６Ｂ＋（ —２５０） －１６６（Ａ一２５０）（Ｄ－３．５）－４００９ 一１２．５）（Ｄ－３．５）＋４９９０（Ｄ－３．５）’ －６０９（８—１２．５） 一１７．５）－７８８（Ｄ一３．５） 一１７．５）＋３舛 一１７．５）’ 注：Ｐ＝０．００３２，ＲＳｑ＝０．９９，ＲＭＳＥ＝１４２０５。 图４ ＤＰＰＤ预测峰面积一实际峰面积图 图４中，实线表示拟合的回归方程，两条弯曲的虚 线之间表示回归方程的９５％置信区间。与横轴平行的 虚线表示ＤＰＰＤ实际峰面积的均值线，其与回归方程的 ９５％置信区间相交表示回归方程显著。 图５所示为各因素间的交互作用。交互作用的显 著性以非平行线表示，两条非平行线间夹角越大说明交 互作用越显著。当模型中没有交互作用项时，交互作用 ＞一 ＼＼、＼ 二二 ：＞ ＼ ： ／ ～～一一ｌＯ ／蝻 ■÷采衙占＊瓤比 ｂ ～８ 图５各因素的交互作用图 对所得的拟合方程用ＪＭＰ中的刻画器进行最大化 优化，可得优化条件：Ａ，４００ ｌ；Ｂ，２０％；Ｄ，２ ｍｉｎ；Ｅ， １０％。各因素中，Ｅ因素与Ｂ因素对实验结果的作用显 著，且Ｅ因素的作用大于Ｂ因素，此结论与极差分析的 结果一致，可推断极差分析优化所得的因素水平组合 可信。 试验结果表明增加萃取剂的体积有助于提高ＤＰＰＤ 在萃取剂中的扩散；同时，在一定时间范围内，延长时间 可使ＤＰＰＤ在两相中达到平衡，提高萃取效率。但当萃 取液达到一定浓度，ＤＰＰＤ在小鼠脑组织和萃取剂中已 达到平衡，再无限延长萃取时间已没有实际意义，故本 实验将萃取时间设为３ ｍｉｎ。萃取剂中Ｔｒｉｏｎ Ｘ一１００所 占体积比越大，萃取效果越好，其可能的机理是ＤＰＰＤ中 含有两个羰基，这些基团可与Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００中亲水性部 分的氧乙烯（ＥＯ）基通过氢键结合，增加其稳定性，使其 溶量增长，本实验将Ｔｒｉｏｎ Ｘ一１００所占体积比定为 ２０％ 。离心时间长有利于离心后上清液的提取，由于 ＤＰＰＤ溶解于上清液中，故萃取效果将更好，但离心时间 超过一定值时，萃取效果已无明显变化，故将离心时间 设为４ ｍｉｎ。定容溶液中水所占的体积比越小，萃取效 果则越好，其原因可能是ＤＰＰＤ极微溶于水，极性较小， 随着定容溶液中水所占体积比的增：大，定容溶液极性变 大，ＤＰＰＤ的溶解性将降低。因此本实验选择定容溶液 中水所占体积比为１０％。最终确定优化的实验条件为： 萃取剂体积４００ １，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００所占体积比２０％，萃 取时间３ ｍｉｎ，离心时间４ ｍｉｎ，定容溶液中水所占体积比 １０％。 ２．５验证性实验 按照前文统计分析所得的最优实验条件进行实验， 小鼠脑组织中ＤＰＰＤ的提取效率可达９３．６５％。 ２．６ 最优化实验条件下方法的论证结果 ２．６．１ 方法的特异性实验实验方法见２．５，小鼠８００ ｍｇ／ｋｇ灌胃５ ｈ后，脑组织中ＤＰＰＤ的色谱图见图６。 １６５６ 中国卫生检验杂志２０１３年７月第２３卷第７期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＨｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊｕｌ ２０１３；Ｖｏｌ ２３ Ｎｏ ７ 图６ ８００ ｍｇ／ｋｇ灌胃５ ｈ后。小鼠脑组织中ＤＰＰＤ的色谱图 如图所示，ＤＰＰＤ和内标物峰形良好，可完全分离， 组织中的内源性物质不干扰测定。 ２．６．２ 工作曲线的线性范围 本法线性范围为２ ｇ／ｍ１～４００ Ｗｇ／ｍｌ，回归方程为ｙ＝０．００６８ｘ＋０．００２９，相 关系数为０．９９９６。 ２．６．３ 准确度实验结果在空白脑组织匀浆中分别加 入低、中、高３种不同量的ＤＰＰＤ标准溶液进行加标回收 实验。相同实验条件下，每种浓度做６个平行样，ＤＰＰＤ 的加标回收率为１０３．５％一１１２．０％，可满足卫生分析的 要求。 ２．６．４精密度实验结果用空白脑组织匀浆分别配制 低、中、高３种不同浓度的ＤＰＰＤ标准溶液，按照样品测 定方法进样分析。１ ｄ内，相同实验条件下，每种浓度做 ６个平行样，测定日内精密度；相同实验条件下，每种浓 度做６个平行样，连续测定３ ｄ，测定日间精密度。日内 测定结果的相对标准偏差（ＲＳＤ）为３．２％一７．９％；日间 兄 为６．３％一１３．４％。 ［参考文献］ ［１］Ｌｉｎ ＣＣ，Ｈｏ ＣＴ，Ｈｕａｎｇ ＭＴ，ｅｔ ａ１．Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉ— ｔｏｒｙ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｄｉｂｅｎｚｏｙｌｍｅｔｈａｎｅ，ａ ｂｅｔａ—ｄｉｋｅｔｏｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ｏｆ ｃｕｒｃｕ ｍｉｎ，ｏｎ ７，１２一ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚ［ａ］ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｆｌ３ｎ— ｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｃｉｌ， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ．Ｐａｒｔ Ｂ，Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００１，２５（３）：１５８． ［２］Ａｎａｎｄ Ｐ，Ｓｕｎｇ Ｂ，ＫｕｎｎｕｍａｋｋａｒａＡＢ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｐｒｏ—ｉｎ． ｌｆａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ ｄｉｆｅｒｕｌｏｙｌｍｅｔｈａｎｅ（ｃｕｒｃｕ ｍｉｎ）ａｎｄ ｉｔｓ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｄｉｂｅｎｚｏｙｌｍｅｔｈａｎｅ，ｄｉｂｅｎｚｏｙｌｐｒｏｐａｎｅ，ａｎｄ ｄｉｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅａｃｅｔｏｎｅ：Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍｉｃｈａｅｌ ａｃｃｅｐｔｏｍ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ ｄｏｎｏ￣ ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１１，８２（１２）：１９０１—１９０９． ［３］贾凤兰，赵琦，张祝琴，等．１，３一二苯一１，３一丙二酮对四氯化碳 致小鼠急性肝损伤的保护作用［Ｊ］．中国新药杂志，２００６，１５（１）： ２６—２９． ［４］Ｔａｋａｎｏ Ｋ，Ｋｉｔａｏ Ｙ，Ｔａｂａｔａ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ａ ｄｉｂｅｎｚｏｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｄｏｐａ ｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂｏｔｈ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｅｎｄｏ— ｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，２９３ （６）：１８８４—１８９４． ［５］田寒梅，崔蓉，何月莹，等．高效液相色谱法测定小鼠血浆中１，３一 二苯一１，３一丙二酮及其药代动力学研究［Ｊ］．中国卫生检验杂 志，２ｏ１０，２ｏ（５）：９５３—９６２． ［６］Ｓｈｅｎ Ｇ，Ｈｏｎｇ ＪＬ，Ｋｏｎｇ ＡＮＴ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｂｅｎｚｏｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｉｎ ｒａｔ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｅ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏ－ ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００７，８５２（１—２）：５６—６１． ［７］田寒梅，崔蓉，何月莹，等．１，３～二苯一１，３一丙二酮在小鼠体内的 组织分布［Ｊ］．北京大学学报（医学版），２０１２，４４（３）：４３７—４４３． ［８］盛卫心，戎宗明，英徐根，等．基团贡献法分子设计研究的进展 ［Ｊ］．化学工业与工程，２００７，２４（５）：４５７—４６５． ［９］高保娇，薛永强．基团贡献法估算物性的进展［Ｊ］．山西化工， １９９７，４０（３）：２１—２５ ［１０］方开泰，马长兴．正交与均匀试验设计［Ｍ］．科学出版社，２００１， ３５—４Ｏ． ［１ １］倪家宝，任绳武．用溶解度参数进行单偶氮分散染料的分子设汁 和结构筛选［Ｊ］．华东化工学院学报，１９８１，７（１）：５５—７Ｏ． ［１２］韦晓瑜，陈世忠．姜黄素注射液在大鼠体内的药代动力学［Ｊ］．北 京大学学报（医学版），２００３，３５（３）：２３０． ［１３］Ｌｉｕ Ａ，Ｌｏｕ Ｈ，Ｚｈａｏ Ｌ．Ｖａｌｉｄａｔｅｄ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｕｒｃｕｍｉｎ ａｎｄ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｕｒｃｕｍｉｎ ｉｎ ｒａｔ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｈａｒｍａｅｏｋｉ・ ｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ＣＵｅｒＵ ｍｉｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎｌａ ｏｆ Ｐｈａｒ－ ｍａｃｅｕｔｉｅａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ．２００６，４０（３）：７２０—７２７ ［１４］朱霞石，张晓红，范国康，等．Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００微乳液体系中铁的萃 取与分离［Ｊ］．应用化学，ｌ８（２）：１４９—１５１． （收稿日期：２０１３—０２—１８）
