９８８ 实用医学杂志２０１４年第３０卷第６期 ＴＲＰＶ１：一个治疗急性肺损伤／急性呼吸窘迫综合征的新靶点 唐婧 肖继王德明 急性肺损伤（ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ， 觉神经纤维，尤其是无髓鞘的Ｃ类和 生ＡＬＩ严重威胁患者的生命，ＡＰＡＣＨＥ ＡＬＩ）在临床上以顽固性低氧血症、 部分少髓鞘的Ａ８类纤维［４ ３。所以，有 Ⅱ评分高，氧合指数低是疾病死亡的 弥漫性肺浸润和肺微血管通透性增 以上神经纤维支配的组织，几乎都有 危险因素［９］。其机制被认为是炎症介质 高引起的肺水肿为主要表现，最严 重阶段为急性呼吸窘迫综合征（ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．ＡＲＤＳ） 尽 管诊疗水平不断提高．但近年来ＡＬＩ／ ＡＲＤＳ患者的死亡率仍然居高不下…。 近年．科学家已注意到ＴＲＰＶ！激活后， 能改善脓毒症大鼠的低血压和器官 衰竭等相关症状，降低其病死率，减 轻肺损伤的氧化应激反应．有益于 ＡＬＩ／ＡＲＤＳ的预后。因此．本文就其特 征及其在ＡＬＩ／ＡＲＤＳ中的研究进展进 行综述。 １ ＴＲＰＶ１ １．１ ＴＲＰＶ１的结构及分布辣椒素受 体，即瞬态电压感受器阳离子通道。子 类Ｖ．成员１（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｖ，ｍｅｍｂｅｒｌ， ＴＲＰＶ１），属于瞬时感受器电位（ＴＲＰ） 通道家族成员，为一种非选择性阳离 子通道。ＴＲＰＶ１由六个跨膜区域组成， Ｎ一末端有三个锚蛋白重复序列．在第 五和第六个跨膜区域之间有一个ｌｏｏｐ 区。尽管ＴＲＰＶ１晶体结构全长仍未研 究清楚，但综合应用多种技术对其结 构进行分析 ，发现ＴＲＰＶ１是一个具 有篮样结构（ｂａｓｋｅｔ ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）的离 子通道，由四个具有Ｎ末端和胞内Ｃ 末端亚单位形成。在ＴＲＰＶ１胞内的Ｎ 末端锚蛋白重复序列凹面存在ＡＴＰ结 合表面，对通道的激活、功能起调节作 用，并能防止对香草类激动剂（如辣椒 素）的快速耐受 。 ＴＲＰＶ１广泛分布于哺乳动物的感 ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００６—５７２５．２０１４．０６．０５ ｌ 基金项目：湖南省自然科学基金资助 （编号：２０１３ＦＪ６００６）：国家自然科学青年基 金资助（编号：８１３０１６２５） 作者单位：４２】００ １ 南华大学附属第 二医院麻醉科 通信作者：王德明Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｅｂ＠ｎｈ２ｈ． ＴＲＰＶ１分布。包括中枢神经、外周神 经、呼吸、消化、心脑血管和泌尿等系 统 ＴＲＰｖ１也广泛分布于一些非神经 细胞上：如呼吸道平滑肌细胞、上皮细 胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞、炎症 细胞、肥大细胞、膀胱上皮细胞和泌尿 肌、皮肤角质细胞和脂肪组织等＿４＿ 。而 在非神经细胞中，ＴＲＰＶ１可能存在着 与神经细胞上不同的生理学病理学功 能，这引起广泛的研究兴趣。它也正成 为新一代抗炎和镇痛药物研发中一个 有希望的靶点。 １．２ ＴＲＰＶ１生物学特性ＴＲＰＶ１可以 被内源性、外源性香草醛类物质，热刺 激，炎症刺激和组织酸化等激活。主要 介导Ｎａ＋、Ｃａｚ＋进入细胞。到目前为止，发 现ＴＲＰＶ１主要具有以下生物学特性： （１）ＴＲＰＶ１被激活时，能引起Ｃａｎ、Ｍｇｚ 和Ｎａ＋等阳离子内流．但对ｃａｚ＋和Ｍｇ ＋ 有相对选择特异性，为其他阳离子的５ ～１０倍左右，ＴＲＰＶ１激活后使胞内阳离 子浓度升高，引起相应的生理和病理变 化，如疼痛等；（２）可以被多种理化因素 激活，如辣椒素和其他香草类化合物 （如大麻素等）、Ｈ （ｐＨ＜６．０）、机械和热 刺激（如温度＞４３℃）、乙醇、活性氧和 硫化氢等；（３）可以被多种神经炎症介 质和内源性炎症介质如缓激肽、Ｐ物质 （ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ，ＳＰ）、前列腺素、脂质过氧 化物、ＡＴＰ、神经生长因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）和降钙素基因相关肽 （ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｇｅｎｅ—ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＧＲＰ） 等直接或间接激活 ］。近来有研究表 明，ＴＲＰＶ１也有一定的抗炎作用 。 ２ ＴＲＰＶ１在脓毒症及ＡＬＩ／ＡＲＤＳ的 作用 尽管重症治疗有重大的进步，脓 毒症的死亡率仍居高不下 ，其特征 是激活免疫和炎症系统．最终导致多 重器官衰竭。肺往往是受累的第一个 器官，进展为Ａｕ或其严重的形式 ＡＲＤＳ［８］。临床研究发现，脓毒症患者发 的过度释放，肺部炎性级联反应，导致 ＡＬＩ／ＡＲＤＳ Ｅ 一 。因此，识别这些炎性分 子．可能对脓毒症相关的呼吸衰竭提 出新的治疗方法。 ２．１ ＴＲＰＶ１在脓毒症中的保护作用 感觉神经可以释放ＳＰ和ＣＧＲＰ，而这 两种神经肽也存在于巨噬细胞和白 细胞。最近的报道ｌ１］显示脓毒症的住 院患者血清中的ＣＧＲＰ和ｓＰ是增加 的．进一步激活ＴＲＰＶ１，发挥抗炎效 应。ｓＰ作为一种重要的感觉神经肽， 它的释放基于适度的刺激，是一种促 炎因子，但ｓＰ也可通过ＮＫ１受体激 活促进巨噬细胞的吞噬作用，介导 ＴＲＰＶ１的抗炎效应。而ＣＧＲＰ除了它 公认的心血管效应，在脓毒症中更是 一个监管角色，它可以调节抗原递 呈．吞噬作用以及细胞因子的产生。 事实上，炎性反应在ＣＧＲＰ缺陷的突 变小鼠中更严重，而在ＴＲＰＶ１基因敲 除的脓毒症小鼠中，血浆ＣＧＲＰ没有 增多效应。这种严重的炎症反应可能 是由于ＴＲＰＶ１敲除后失去ＣＧＲＰ的 释放造成的。 在脓毒症时．ＴＲＰＶ１基因敲除会 使ＴＮＦ一０【、ＩＬ一６和器官衰竭的循环标记 物增加。ＴＲＰＶ１基因的敲除，不仅增加 细胞因子的释放，减少活性氧（ＲＯＳ）， ＮＯ水平．促进细胞凋亡，同时减少在 ＬＰＳ诱导的腹膜巨噬细胞吞噬作用损 害和细菌清除障碍。巨噬细胞功能受 损使细菌的生存更容易，从而促进加 重全身炎症反应．加重ＬＰＳ诱导的低 血压和死亡率。ＴＲＰＶ１在免疫和炎症 反应中都起作用，ＴＲＰＶ１激活在保护 重要器官灌注和生存，控制感染和 ＳＩＲＳ中发挥重要作用［１１］。而其机制可 能是通过其抗炎作用而非血流动力学 的变化。在非脓毒症状态时，ＴＲＰＶ１并 不易被激活或抑制，这与脓毒症状态下 可出现炎症因子过度释放的变化不谋 而合［１ 。 实用医学杂志２０１４年第３０卷第６期 ９８９ ２．２ Ｈ。Ｓ通过ＴＲＰＶ１依赖途径诱发 少ＩＬ一１２、ｐ４０和ＩＬ一１Ｂ的释放。这些结 ［５］Ｌｕｏ ＸＪ，Ｐｅｎｇ Ｊ， “ＹＪ． Ｒｅｃｅｎｔ ＡＬＩ硫化氢（Ｈ２Ｓ）已被证明能够促进 果表明．ＴＲＰＶ１在肺部炎症能起到免 ＴＲＰＶ１介导的神经源性炎症。Ｈ２ｓ通过 疫调节和抗炎作用。在目前的研究中， ＴＲＰＶ１通道依赖机制．促进ＣＯＸ一２和 ＳＡ１３３５３在ＢＡＬＦ可呈剂量依赖减少 ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｃａｐｓａｉｃｉｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｃａｐｓｉｎｏｉｄｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ２０１１．６５Ｏ（１）：ｌ一７． Ｖａｎｉｌｌｏｉｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ６］Ｖｅｎｎｅｋｅｎｓ Ｒ，Ｏｗｓｉａｎｉｋ Ｇ，Ｎｉｌｉｉｕｓ Ｂ． ］。当ＴＲＰＶ１激活， ［ＰＧＥＭ产生，在脓毒症时诱发Ａｕ。 炎症细胞的数量Ｎ７ＣＯＸ一２抑制剂可以减少Ｈ２ｓ在肺部诱 一氧化碳合酶（ｅＮＯＳ）诱导产生ＮＯ。 导的ＰＧＥＭ的产生、嗜中性粒细胞浸 ＮＯ作为一个信使和宿主防御分子发 润、水肿及促炎细胞因子、趋化因子、 挥抗炎作用。因此，全身ＴＲＰＶ１受体激 ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｃｕｒｔ＂ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ，２００８，１４（１）：１８—３１． 黏附分子的释放，降低ＣＬＰ诱导的死 动剂可能会对临床治疗肺部炎症有 ［７］Ｒｕｓｓｅｌｌ ＪＡ，Ｂｏｙｄ Ｊ，Ｎａｋａｄａ Ｔ，ｅｔ ａ１． 亡率 。 效，如ＡＬＩ／ＡＲＤＳ和ＣＯＰＤ。 内源性Ｈ，Ｓ在脓毒症一Ａｕ通过上 ３ ＴＲＰＶ１在ＡＬＩ治疗中的前景及展望 调ＳＰ或通过激活ＥＲＫ１／２和ＮＦ—ＫＢ 研究证实．ＬＰＳ诱导ＩＫＢ—ｏｌ退化和 通路，来调节炎症反应。这也许存在着 磷酸化．继而导致ＮＦ—ＫＢ活化，然而辣 一种可能，Ｈ Ｓ可能通过 Ｓ—ＴＲＰＶ１一 椒素激活ＴＲＰＶ１受体，能抑制ＮＦ—ＫＢ ＳＰ—ＥＲＫ１／２一ＮＦ—ＫＢ—ＣＯＸ一２一ＰＧＥＭ信号 途径。从而产生抗炎效应ｌＩ８］。细胞识别 转导途径诱发ＡＬＩ。而使用辣椒卓平 ＬＰＳ后．ＴＬＲ４释放促炎细胞因子，可激 （Ｃａｐｓａｚｅｐｉｎ），选择性ＴＲＰＶ１拮抗剂， 活ＮＦ—ＫＢ，介导包括ＴＮＦ．仅、ＩＬ．６等众 可以阻断Ｈ２Ｓ通过ＴＲＰＶ１通道依赖机 多炎症因子的基因表达而导致炎症因 制上调ＣＯＸ一２和ＰＧＥＭ的作用。在感 子过度释放。这些过度释放的炎症因 染的肺部，抑制ＣＯＸ一２／ＰＧＥ，通路能明 子反过来又可以进一步激活ＮＦ—ＫＢ， 显改善炎症、损伤、和脓毒症相关的死 形成正反馈的级联放大效应．产生过 亡率，从而为预防和治疗ＡＬＩ提供一 度的炎症反应，引起肺脏组织和细胞 个潜在可行的方法［１３－１４１ 损害的发生［ 】。 ２．３ ＬＸＲ介导ＴＲＰＶ１的抗炎作用最 由此可见，ＴＲＰＶ１在感染部位激 新研究表明＿１５］在ＴＮＦ— 所诱导的炎症 活后，不仅能促进巨噬细胞杀死和吞 反应中，敲除肝ｘ受体（ＬＸＲ）可阻断 噬细菌的功能．而且阻止嗜中性粒细 ＴＲＰＶ １激活所产生的炎症保护作用。此 胞浸润，在减少炎症因子的分泌和抑 外．辣椒卓平预处理加剧了ＴＮＦ—ｏｔ诱导 制炎症反应过程中扮演着重要的角 的ＭＣＰ一１、ＩＬ一６和ＭＣＰ一２产生。反之，辣 色，从而对肺损伤起保护作用。虽然 椒素抑制ＴＮＦ ０【诱导ＭＣＰ一１、ＩＬ ６和 ＴＲＰＶ１抑制炎症基因表达的机制目前 ＭＣＰ一２产生，而辣椒素的抑制作用可以 尚不清楚。但至少有部分是通过抑制 被小干扰ＲＮＡ抑制ＬＸＲ激活所逆转。 ＮＦ—ＫＢ途径而发挥作用的。因此，针对 这些结果表明，在巨噬细胞 ＴＲＰＶ１的药物研究也将为ＡＬＩ的治疗 ＴＲＰＶ１受体激活后的抗炎作用可能需 带来新的前景。 要ＬＸＲ的介导 ４参考文献 ２．４ ＴＲＰＶ１激动剂能有效抑制肺部炎 ［１］Ｃｏｏｋｅ ＣＲ，Ｓｈａｈ ＣＶ，Ｇａｌｌｏｐ Ｒ，ｅｔ ａ１． 症 辣椒素，ＴＲＰＶ１受体的一种激动 Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｆｏｒ 剂，能改善脓毒症大鼠的低血压，降低 ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ａｃｕｔｅ 其病死率，能减轻ＡＬＩ的氧化应激反 ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，２００９， 应。辣椒素治疗能有效降低脓毒症 ３７（６）：１９１３－１９２０． 大鼠血浆ＩＬ．６、ＴＮＦ—ｏｔ、ＮＯｘ及丙二醛 ［２］ Ｍｏｉｓｅｅｎｋｏｖａ—Ｂｅｌｌ ＶＹ，Ｗｅｎｓｅｌ ＴＧ．Ｈｏｔ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｉｌ ｏｆ ＴＲＰ ｃｈａｎｎｅｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （ＭＤＡ）的水平，同时可以显著提高抗 炎因子ＩＬ—ｌ０的水平。而ＩＬ一６是使炎症 ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９，１３３（３）： ２３９—２４４． 因子放大的重要因子．是脓毒症肺损伤 的重要因素，可用于早期诊断评估ｌ】６］。 ［３］Ｌｉｓｈｋｏ ＰＶ，Ｐｒｏｃｋｏ Ｅ，Ｊｉｎ Ｘ，ｅｔ ａ１． Ｔｈｅ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔｓ ｏｆ ＴＲＰＶ１ ｂｉｎｄ 急性损伤时组织缺血．感染和炎症也 ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｃｈａｎｎｅｌ 都能引起局部高浓度的Ｈ＋环境，低 ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｎ，２００７，５４（６）： ｐＨ值在生理温度下敏化ＴＲＰＶ１。 ９０５—９１８． 在ＬＰＳ诱导肺损伤，ＳＡ１３３５３， ［４］ Ａｌａｗｉ Ｋ，Ｋｅｅｂｌｅ Ｊ．Ｔｈｅ ｐａｒａｄｏｘｉｃｌａ ｒｏｌｅ ＴＲＰＶ１的特异性激动剂，可以减少肺 ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ 部炎性细胞浸润．减少ＴＮＦ—ｏｔ和 ｖａｎｉｌｌｏｉｄ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ＣＩＮＣ １水平 而在过敏性气道炎症， ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ，２０１０，１２５（２）： ＳＡ１３３５３倾向于抑制白细胞浸润和减 １ ８１一】９５． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｅｐｓｉｓ［Ｊ］ Ｃｏｎｔｒｉｂ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１１，１７：４８—８５． ［８］Ｖａｒｉｓｅｏ ＢＭ．Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｓｅｐｓｉｓ［Ｊ］．Ａｄｖ Ｐｈａｒｍａ— ｃｏｌ Ｓｃｉ，２０１１，２０１１：２５４６１９． ［９］熊丽红，郑晓英，陈伟峰，等．脓毒 症患者并发急性肺损伤危险因素分 析［Ｊ］．实用医学杂志，２０１１，２７（８）： １４０１—１４０３． ［１０］Ｗｈｅｅｌｅｒ ＡＰ，Ｂｅｒｎａｒｄ ＧＲ．Ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ： ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ［Ｊ］． Ｌａｎｃｅｔ，２００７，３６９（９５７２）：１５５３－１５６４． ［】１ Ｊ Ｆｅｍａｎｄｅｓ ＥＳ，Ｌｉａｎｇ Ｌ，Ｓｍｉｌｌｉｅ ＳＪ，ｅｔ ａ１．ＴＲＰＶ１ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｌｏｃａｌ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｔｈｅ Ｏｎｓｅｔ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．Ｊ ｈｎｎｍｎｏｌ，２０１２，１８８ （１１）：５７４１—５７５１． ［１２］Ｗａｎｇ Ｙ，Ｗａｎｇ ＤＨ．ＴＲＰＶ１ ａｂｌａｔｉｏｎ ａｇｇｒａｖａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｄａｍａｇｅ ｄｕｒｉｎｇ ｅｎｄｏｔｏｘｉｃ ｓｈｏｃｋ ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３，２０ （７）：１００８—１０１５． ［１３］Ａｎｇ ＳＦ，Ｓｉｏ ＳＷ，Ｍｏｏｅｈｈａｌａ ＳＭ，ｅｔ ａ１．Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｓｕｌｆｉｄｅ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ一２ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｉｎ Ｓｅｐｓｉｓ—Ｅｖｏｋｅｄ Ａｃｕｔｅ Ｌｕｎｇ Ｉｎｊｕｒｙ ｖｉａ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｖａｎｉｌｌｏｉｄ Ｔｙｐｅ １ Ｃｈａｎｎｅｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１１，１８７ （９）：４７７８—４７８７． ［１４］Ｓｃｕｌｌｙ Ｍ，Ｇａｎｇ Ｃ，Ｃｏｎｄｒｏｎ Ｃ，ｅｔ ａ１． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ （ＣＯＸ）一２ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｌｉｐｏｘｉｎ Ａ４一ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔ ［Ｊ］．Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ，２０１２，１７５（１）：１７６— １８４． ［１５］Ｚｈａｏ ＪＦ，Ｃｈｉｎｇ ＬＣ，Ｋｏｕ ＹＲ，ｅｔ ａ１． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＲＰＶ１ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＯｘＬＤＬ— Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＴＮＦ－ ｄ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａ— ｇｅｓ：Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｘ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｏｔ．Ｍｅｄｉ・ ａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ『Ｊ］．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ， ２０１３，２０１３：９２５１７１． ［１６］陈晓彤，王寿平，邹子俊，等．Ｔｏｌｌ样 受体４单克隆抗体预处理对脂多糖 诱发小鼠急性肺损伤的影响［Ｊ］．中 ９９０ 实用医学杂志２０１４年第３０卷第６期 华急诊医学杂志，２０１ １，２０（１０）：１０５２一 ｌ０５５． ［１９］Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ Ｇ， Ｋｎｕｅｆｅｒｍａｎｎ Ｐ， Ｗｒｉｇｇｅ Ｈ．ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ ｒｅ— ｃｅｐｔｏｒ ４ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ［１７］Ｔｓｕｊｉ Ｆ，Ｍｕｒａｉ Ｍ，Ｏｋｉ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｅｌ－ ｏｃｔｓｆ ｏｆ ＳＡ１３３５３，ａ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｖａｎｉｌｌｏｉｄ １ Ａｇｏｎｉｓｔ， ｏｎ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ Ｇｒａｍ—ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｐｓｉｓ［Ｊ］． Ｅｕｒ Ｊ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ， ２００６，２３（１２）： １０４１—１０４８． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｉｎｆｉｌ￣ａｔｉｏｎ ｉｎ Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｅ— ｃｈａｆｉｄｅ—Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｃｕｔｅ Ｌｕｎｇ Ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ （收稿：２０１３一ｌ０—０８编辑：吴淑金） 亚硫酸氢盐修饰方法在ＤＮＡ甲基化检测中的研究进展 何纯刚 黄沁园 陈利生 吴鸿根 邓洪强 完成，基因表达的成为２１世纪分 阐述其原理及技术要点 尿素等化学方法变 子遗传学研究的热点领域。而作为基 １基于亚硫酸氢盐修饰的ＤＮＡ甲基 有热变性、碱变性、因表达的一个重要机制——表观 化检测原理 性，使双链ＤＮＡ解链为单链ＤＮＡ。由 刊～…～一 ¨似一． ｌ ～一加 ㈤ 一㈣ ～ 兰 一 ． 随着人类基因组测序工作的基本 氢盐修饰技术的文献，结合笔者经验． 合 。因此，进行亚硫酸氢盐修饰首先 要使ＤＮＡ完全变性。ＤＮＡ的变性方法 遗传学改变的研究倍受广大研究者的 早在１９７０年，Ｈａｙａｔｓｕ等［３］发现了 于高温下热变性容易造成ＤＮＡ的断 ０．３ 关注。ＤＮＡ甲基化在人类表观遗传、胚 胞嘧啶可以通过亚硫酸氢盐脱氨基且 裂或降解，因此往往采用碱变性，胎发育、基因印记、等位基因失活及肿 ５一甲基胞嘧啶通过亚硫酸氢盐脱氨基 ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ ３７℃２０ ａｉｒｎ水浴即可 Ａ ａ Ｂ １ 一 瘤发生等有着非常重要的作用…。ＤＮＡ 的速度远远比非甲基化的胞嘧啶慢。 达到变性目的［ ，也有研究［ｅ］提示为了 町ｓ 汕 ．“ 甲基化的研究也成为目前研究的热 这些研究结果提示亚硫酸盐使ＤＮＡ 使富含ＧＣ片段的ＤＮＡ保证完全变 点，然而制约其发展的仍然是技术与 中未发生甲基化的胞嘧啶（ｃ）脱氨基 性．可以达到４２℃水浴２０—３０ ａｉｒｎ 方法。目前检测ＤＮＡ甲基化的方法很 转变成尿嘧啶（ｕ）．而甲基化的胞嘧 有文献指出．尿素有防止ＤＮＡ的复性 多［：］：（１）以亚硫酸氢盐修饰ＤＮＡ为基 啶保持不变。由于尿嘧啶与胸腺嘧啶 及使ＤＮＡ变性的作用，在亚硫酸氢盐 础．并在此基础上发展出来的各种 （Ｔ）相似，在ＤＮＡ聚合反应过程中可 中加入尿素会加速亚硫酸氢盐对非甲 ＣｐＧ岛甲基化检测方法，如ＢＳＰ测序、 以作为胸腺嘧啶，根据修饰后的差异 基化胞嘧啶的转化作用Ｉｖ－ｓ］。但最近也 ＰＣＲ（ＭＳＰ、ｎＭＳＰ，Ｍｅｔｈｅｌｉｇｈｔ等）、芯片 ＤＮＡ设计ＰＣＲ引物，当进行ＰＣＲ反 有报道指出．尿素可能并不加速反应 技术（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。（２）以甲基化敏感的 应时，在扩增后的产物中变成胸腺嘧 过程，反而可能阻碍亚硫酸氢盐的转 性内切酶消化为基础的研究方 啶，而５一甲基胞嘧啶在亚硫酸氢盐处 化效率［ ］。 法。（３）其他的方法，如特异性识别甲 理过程中不发生改变，经ＰＣＲ扩增后 ２．２单链ＤＮＡ与亚硫酸氢盐反应脱 基化修饰ＤＮＡ的抗体或蛋白；质谱或 的产物仍为胞嘧啶，最后对ＰＣＲ产物 氨基的过程与修饰条件优化该过程 色谱等精密检测手段。其中亚硫酸氢 进行分析就可判断ＣｐＧ位点是否发生 分为三个步骤 ：第一步：ＨＳＯ３打开５， 盐修饰ＤＮＡ为基础的方法在研究 甲基化［ 。 ６双键并结合生成磺酸基一胞嘧啶 ＤＮＡ甲基化中成为最常用、应用最广 ２传统的亚硫酸氢盐修饰方法的原 ［Ｃ—ＳＯ，一］，为可逆反应；第二步：通过水 泛的方法。但很少有关这方面的文献 理解析与反应条件的改进 综述就其详细的技术要点及原理进行 解作用脱氨基：第三步：释放ＨＳＯ３－再 传统的亚硫酸氢盐修饰过程包括 次形成５，６双键，第三步为可逆的反 链的ＤＮＡ与亚硫酸氢盐反应脱氨基： 酸氢盐的反应过程中．亚硫酸氢盐的 （３）经亚硫酸氢盐处理后的ＤＮＡ脱盐 浓度、反应温度、反应持续时间、ｐＨ值 ｄｏｉ：ｌ０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００６—５７２５．２０１４．０６．０５２ 分析。因此，本文主要收集有关亚硫酸 以下步骤：（１）双链ＤＮＡ变性；（２）单 应，该步骤在脱盐纯化后进行。在亚硫 纯化，即将亚硫酸氢盐洗脱；（４）将纯 等是影响亚硫酸氢盐对非甲基化胞嘧 化的ＤＮＡ脱磺酸基：（５）ＤＮＡ纯化回 啶转化成功及转化效率最关键的影响 基金项目：国家自然科学基金资助项目 （３０７６０２４６，８１３６０３３４）；广西教育厅重点科 研项目（桂教２０１０１２ＭＳ０４３）；广西卫生厅科 研课题（Ｚ２０１２２４６） 收。在亚硫酸氢盐修饰过程中．非甲基 因素。第一步［Ｃ．ｓ０，一］的形成在中性 化胞嘧啶的成功转化与尽可能地避免 水溶液中不稳定，很容易重新生成 ＤＮＡ的降解及丢失成为亚硫酸氢盐修 ［Ｃ］，而［Ｃ—ＳＯ ］在酸性条件下则很稳 饰技术成功的关键，也是甲基化分析 定 ］。当亚硫酸氢盐／＞０．５ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值 民医院普外儿外科（何纯刚，吴鸿根，邓洪 ０的时候，［Ｃ］和［Ｃ．ＳＯ 一１的转换 强）；５３００２１广西医科大学护理学院（黄沁 方法的基础。下面主要介绍传统的亚 在７．作者单位：５３００２１广西壮族自治区人 园）；５３００２１ 广西医科大学结直肠肛门外 硫酸氢盐修饰反应步骤的原理与条件 很快就达到平衡。当亚硫酸氢盐浓度 科（陈利生） 优化的研究进展 Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｌｉｓｈｅｎｇ＠ ２．１双链ＤＮＡ变性为１ ｍｏｌ／Ｌ，ＰＨ值下降达到６．０的时 双链ＤＮＡ的螺 候，平衡反应向［Ｃ—ＳＯ，一］反应。第二步 通信作者：陈利生ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ 旋结构可以阻碍磺酸基与胞嘧啶相结 是整个过程最关键的一步，是『Ｃ—ＳＯ 一］
