激素性股骨头坏死早期股骨头局部ＴＧＦ－β1表达的实验研究
【摘要】目的 通过内毒素联合大剂量激素冲击，小剂量激素长期应用两种方法制备大鼠股骨头坏死模型，探讨生长因子在激素造成股骨头坏死中的变化情况。方法 选取Wister大鼠26只，随机分为三组，A组：6只，空白组；B组：10只，每只每次10μg/kg剂量于大鼠尾静脉注射内毒素1次，注射内毒素24小时后，腹腔注射醋酸强的松龙每20mg/kg.d,连续3天，每次间隔24小时。C组：10只，腹腔注射醋酸强的松龙6.7mg/kg，3次/周，连续三周。给药后8周将动物处死，进行免疫组化观察。结果 激素可以明显抑制股骨头内TGF-β1的表达。内毒素联合大剂量激素，小剂量激素长期应用两种方法均可成功的制备股骨头坏死模型。
【关键词】激素性股骨头坏死TGF-β1 实验研究
生长因子是由造血系统、免疫系统或炎症反应中的活化细胞产生的、高活性的多肽、蛋白质或糖蛋白，是细胞分化、增殖、基质合成和的重要信息物质，是具有刺激细胞生长作用的细胞因子，在股骨头坏死(ONFH)的发病和修复过程中有着重要的作用。其中转化生长因子-β、血管内皮细胞生长因子、骨形成蛋白与股骨头内的成骨活动、基质干细胞的转化及血管生成密切相关，而且均已经在临床使用，在ONFH的发病及治疗中具有重要作用。因此，本研究主要运用免疫组织化学染色的方法，定量分析激素性股骨头坏死过程中，TGF-β1变化情况，进而分析TGF-β1与股骨头坏死之间的联系。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wistar雄性成年大白鼠，26只，体重290±20g，由中国中医科学院实验动物中心提供，合格证号为SCXK(军)（2002-001）。实验前行一星期的适应性饲养。
1.2 方法与分组 选取Wister大鼠26只，随机分为三组，A组：6只，作为空白组，常规饲养；B组：10只，每只每次10μg/kg剂量于大鼠尾静脉注射内毒素1次，注射内毒素24小时后，腹腔注射醋酸强的松龙每20mg/kg.d,连续3天，每次间隔24小时。C组：10只，腹腔注射醋酸强的松龙6.7mg/kg，3次/周，连
续三周。
所有大鼠于造模后第9周的第一天，用0.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（1ml/100g），处死大鼠，取下大鼠右侧股骨头，用4%多聚甲醛（0.01MPBS液配制，PH值7.2～7.4）固定，待检。
1.3 免疫组织化学染色 切片常规脱蜡至水，双氧水封闭10分钟，蒸馏水冲洗，0.01MPBS浸洗3min×3；10%的正常山羊血清封闭，室温孵育10min，倾去血清勿洗；滴加GFAP工作液，37℃孵育2h，0.01MPBS浸洗3min×3；生物素标记羊抗兔IgG二抗工作液，37℃孵育15分钟，0.01MPBS浸洗3min×3；低价S-A/HRP工作液，37℃孵育15分钟，0.01MPBS浸洗3min×3；DAB溶液室温显色5min,自来水冲洗终止显色；脱水，二甲苯透明，树脂胶封片。
1.4 图像分析及统计学处理 用日本Nikon H8-202 AN科研显微镜对股骨头切片进行组织病理学观察和摄像；用美国MIS-2000 SP型3Y显微图象分析仪，测定股骨头切片各生长因子（TGF-β、VEGF、BMPs）阳性表达产物的平均光密度值（meanoptical density,OD）和阳性细胞计数 ，细胞中含有棕黄色颗粒者为阳性。其记数采用平均值， 即在每个样本按照“Z”字型，每条线上取一个点作为取图点，每个观察指标在同一张切片取3个视野的图像，计数每个视野的阳性细胞数，测定其OD值及阳性细胞数。
所得数据以均数±标准差表示，采用F检验及单因素方差分析，以上统计均用SPSS 11.0统计软件包完成，p＜0.05认为有显著统计学意义。
2 结果
转化生长因子(TGF-β1)：TGF-β1 表达主要在软骨细胞核和胞浆，成骨细胞内及胞外基质，有的骨细胞的胞核均有阳性着色。
3 讨论
李雄 袁浩［1］等发现激素的冲击疗法与长期应用都能促进股骨头坏死的发展。因此必须重视预防。王氏［2］发现大量激素的使用,可以造成血管内膜的炎症。Jones［3］认为,脂肪栓塞仅仅造成骨软化不可能成为导致骨坏死的最后途径,而认为脂肪的过量,血流瘀滞,游离脂肪酸(FFA)对血管内皮的损伤,导致血管内栓塞,特别是栓塞于毛细血管和血窦,以及继发纤溶是骨坏死的原因。Matsui［4］认为,血管的病变是股骨头坏死的关键。但是到目前为止，仍没有一种普遍满意的治疗股骨头坏死的疗法。
在体内,外源性TGF-β可以启动正常的,与骨折愈合过程一致的成骨过程。Beck［5］等的研究表明,外源性TGF-β注入到兔颅骨缺损内,能明显促进成骨细胞的增殖和骨基质的合成,其组织学结构与周围正常骨相同,已钙化骨的间隙中可见含细胞成分的骨髓腔。而不加TGF-β的为纤维愈合,仅有少量新生骨。本实验的研究结果表明：大剂量激素冲击与小剂量激素长期应用均可以抑制TGF-β1的生成。且小剂量激素长期应用后TGF-β1的表达较大剂量激素冲击应用明显降低，二者比较差异显著p＜0.05，说明小剂量激素长期应用更能抑制TGF-β1的生成。骨诱导、骨形成是一个由多种生长因子参与并调节的过程。生长因子能够促进骨形成和血管再生，因此就有可能成为改善股骨头坏死的新方法。本实验结果为进一步探讨激素性股骨头坏死的发病机理提供新的思路与途径，同时，也为临床治疗该病提供一个新思路，即若能提高坏死区局部TGF-β1的表达水平，其自身修复能力势必会明显提升，也许会成为一种有效的治疗方法。
参考文献
［1］ 李 雄,袁 浩,贝美莲,等.大剂量激素长期冲击应用与长期应用对股骨头坏死影响的动物实验［J］.骨与关节损伤杂志,1999,14(4)：241－244.
［2］ 王海彬,赵启爱,沈培芝,等.激素性股骨头缺血性坏死动物血管内皮的变化及中药作用［J］.中国中医骨伤科杂志,2000,8(3)：7－10.
［3］ Jones JP. Fat embolism, intravascular coagulateon and osteonecrisis［J］. Clini Orthop,1993,278：294-308.
［4］ Matsui M. Experimental steroid-induced osteonecrosis in adultrabbits with hypersensitivity vasculities［J］. Clin Orthop,1992,277:61.
［5］ Beck L S, Deguzman L, Lee W P, et al. Rapid publication. TGF-beta 1 induces bone closure of skull defects ［J］ .J Bone Miner Res 1991,6(11): 1257-65.
