原发性肝细胞癌组织miR-221表达变化及其对肿瘤侵袭和转移的影响

及其对肿瘤侵袭和转移的影响张海雄，彭亮，冯伟清（广东医科大学附属佛山禅城中心医院，广东佛山528000）摘要：目的 探讨原发性肝细胞癌（HCC）组织微小RNA-221 （miR-221）表达变化及其对肿瘤侵袭和转移的影

响。方法 采用RT-qPCR法检测74例份HCC组织及其配对的癌旁正常组织miR-221表达。以miR-221表达的均

数为截断值，将HCC组织分为miR-221高表达与miR-221低表达，分析不同miR-221表达与患者临床病理特征的 关系。体外传代培养高侵袭性HCC细胞MHCC97H、低侵袭性HCC细胞MHCC97L及正常肝细胞L02,采用RT-

qPCR 法检测各细胞miR-221表达，选择miR-221相对表达量最高的细胞系进行后续实验。将上述miR-221相对表

达量最高的细胞随机分为观察组和对照组，分别转染miR-221 inhibitor和NC inhibitor。转染24 h,收集细胞，采用 细胞-基质黏附实验分别检测Fibronectin或Matrigel胶包被时细胞黏附能力；采用Transwell侵袭和迁移实验检测 细胞侵袭和迁移能力。结果 HCC组织miR-221相对表达量明显高于癌旁正常组织（P ＜0.05）。74例份HCC组

织中，miR-221高表达39例份,miR-221低表达35例份。HCC组织miR-221高表达与Edmondson-Steiner分级、微血 管侵犯和临床分期有关（P均＜0. 05）,与性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤数目、肝硬化.HBV感染无关（P均＞0. 05 ）o

高侵袭性HCC细胞MHCC97H和低侵袭性HCC细胞MHCC97L miR-221相对表达量明显高于正常肝细胞L02,且 高侵袭性HCC细胞MHCC97H miR-221相对表达量明显高于低侵袭性HCC细胞MHCC97L（P均＜0. 05、，故以高 侵袭性HCC细胞MHCC97H进行后续实验。观察组无论是Fibronectin包被时还是Matrigel胶包被时细胞黏附能力 均明显低于对照组（P均＜0.05）。观察组细胞侵袭和迁移能力均明显低于对照组（P均＜0.05 ）o结论 HCC组

织miR-221表达明显升高，其高表达可促进肿瘤侵袭和转移;下调miR-221表达能够抑制HCC细胞的黏附、侵袭和 迁 力。关键词:肝细胞癌;微小RNA-221 ；细胞黏附;细胞侵袭;细胞迁移doi： 10. 3969/j. issn. 1002-266X. 2019.19. 004中图分类号:R735.7 文献标志码:A 文章编号：1002-266X（2019） 19-0014-05Expression of miR-221 in primary hepatocellular careinoma and its effect on invasion and metastasis of hepatocellular careinomaZHANG Haixiong, PENG Liang, FENG Weiqing（Foshan Chancheng Central Hospital Affiliated to Guangdong Medical University, Foshan 528000, China）Abstract: Objective To investigate the expression of miR-221 in the primary hepatocellular carcinoma （ HCC） and

its relationship with tumor progression. Methods The expression of miR-221 was detected by qRT-PCR in 74 HCC tissues

and their matched normal adjacent tissues. The mean expression of miR-221 in the HCC tissues was used as the cut-off val­ue. The patients were divided into high expression of miR-221 and low expression of miR-221 . The relationship between the

expression of miR-221 and the clinicopathological characteristics of patients was analyzed. High invasive HCC cells MH-

CC97H, low invasive HCC cells MHCC97L, and normal hepatocytes L02 were cultured in vitro. The expression of miR-221 was detected by qRT-PCR. The cell lines with the highest relative expression of miR-211 were selected for the subsequent

experiments. The cells with the highest relative expression of miR-211 were randomly divided into the observation group and

control group, and transfected with miR-221 inhibitor and NC-inhibitor for 24 h, respectively. Cell-matrix adhesion assay was used to detect the cell adhesion ability when they were coated by Fibronectin or Matrigel. Transwell invasion and migra­

tion assays were used to detect the cell invasion and migration. Results The relative expression of miR-221 in the HCC tis­

sues was significantly higher than that in the adjacent normal tissues （ P ＜0.05）. Among 74 cases of HCC tissues, 39 ca­ses had high expression of miR-221 and 35 cases had low expression of miR-221 . The high expression of miR-221 in the第一作者简介：张海雄(1982-)，男，主治医师，主要研究方向为肝胆外科基础与临床。E-mail： zhanghaixiong123@yeah.net

14山东医药2019年第59卷第19期HCC tissues was related to Edmondson-Steiner classification, microvascular invasion and clinical stage ( all P <0. 05) , but not to sex, age, tumor diameter, number of tumors, cirrhosis, or HBV infection (all P >0.05). Compared with the nor­mal hepatocyte line L02, the relative expression of miR-221 in the MHCC97H cells and MHCC97L cells was significantly higher； the relative expression of miR-221 in MHCC97H cells was significantly higher than that in MHCC97L cells ( all P

<0.05). Therefore, MHCC97H cells were used for the subsequent experiments. The cell adhesion ability of the observa­

tion group was significantly lower than that of the control group in both Fibronectin and Matrigel gel coatings (all P < 0. 05) . The cell invasion and migration abilities of the observation group were significantly lower than those of the control group (both P < 0. 05) . Conclusion The expression of miR-221 in the HCC tissues increases significantly， and its high

expression can promote the invasion and metastasis of tumors； down-regulation of miR-211 expression can inhibit the adhe-

sion， invasion， and migration of HCC cells.Key words： hepatocellular carcinoma； microRNA-221 ； cell adhesion； cell invasion； cell migration肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌中最常见的一 种类型，占原发性肝癌的70% -85%。目前，手术

切除仍是HCC的首选治疗方法，也是最有效的治疗 方法⑴。但HCC早期易侵袭和转移，患者术后5年

生存率较低皿。目前对HCC发生、发展的分子机

制尚不完全清楚。微小RNA (miRNA)是一类广泛 存在于真核生物体内的内源性非编码小分子RNA,

长度19 -25个核=酸，主要通过结合靶基因mRNA

的3'UTR区，参与基因转录后。已有研究证

实,miRNA可通过癌基因或抑癌基因表达，参

与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程。miR- 221 是近年发现的miRNA,属于miR-221/222基因

家族成员之一。有研究发现,在多种恶性肿瘤组织 中miR-221表达异常增高，并与肿瘤的发生、发展密 切相关⑷。但在HCC组织中miR-221表达变化的 报道较少，其能否参与HCC的发生、发展亦不十分 清楚。为此，本研究观察了原发性HCC组织miR-

221 表达变化,并探讨其表达变化对肿瘤侵袭和转

移的影响。现报告如下。1材料与方法1.1材料 选择2014年6月~2017年6月广东医

科大学附属佛山禅城中心医院手术切除的HCC组

织及其配对的癌旁正常组织(距肿瘤组织边缘=2 cm)各74例份。所有标本经组织病理学检查证实。

标本来源患者均为初诊原发性HCC,术前未接受任

何抗肿瘤治疗,且未合并其他组织或器官恶性肿瘤0 其中，男54例、女20例，年龄(52.4 ±12. 6)岁；合并

症:肝硬化48例，HBV感染60例；肿瘤直径：=5 cm 40例，＜5 cm 34例;肿瘤数量:单发58例，多发 16 例；Edmondson-Steiner 分级：I、II 级 48 例，皿、

W级26例；临床分期：I、n期45例，m、IV期29 例;有微血管侵犯30例,无微血管侵犯44例。本研

究经广东医科大学附属佛山禅城中心医院医学伦理

委员会批准，患者或其家属知情同意。高侵袭性HCC细胞株MHCC97H、低侵袭性

HCC细胞株MHCC97L及正常肝细胞株L02 (以下

分别称MHCC97H、MHCC97L、L02细胞)，购自中国

科学院上海生命科学研究院细胞资源中丿卜。Light- Cycler ® 96实时荧光定量PCR仪，瑞士 Roche公

司。miR-221抑制物(miR-221 inhibitor)及其阴性对 照物(NC inhibitor)，购自上海吉玛制药技术有限公

司;miR-221及内参U6引物序列，由广州市锐博生 物科技有限公司设计合成。TRIzol、LipofectamineTM 2000，美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒(Prime- Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser)、实时荧光

定量 PCR 试剂盒(SYBR ® Premix Ex TaqTM I ),日

本TaKaRa公司；纤维连接蛋白(Fibronectin )、四甲 基偶氮卩坐蓝(MTT )，美国Sigma公司；Transwell小

室，美国Corning公司；Matrigel胶，美国BD公司。1.2 HCC组织与癌旁正常组织miR-221表达检测采用RT-qPCR法。取手术切除的HCC组织及其

配对的癌旁正常组织，液氮中充分研磨，采用TRIzol 法提取组织总RNAo经紫外分光光度计鉴定,

OD260/OD280为1.8 ~ 2.0,表明提取的总RNA浓度

度 。 PrimeScript RT Reagent Kit with gD-

NA Eraser说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA

为模板，按SYBR ® Premix Ex TaqTM I说明进行

PCR扩增。弓I物序列:miR-221上游引物5'-CAAG- GAATCATGTATGCTGTAG-3',下游弓| 物 5'-AGGAT-

GACATTACACCTTATCTC-3'；U6 上游引物 5'-GCT- TCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ' ， 下 物 5'-

CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。PCR 反应体系

共25 pl： SYBR ® Premix Ex TaqTM I (2 x ) 12. 5

^L,cDNA2 pL,上下游引物各1 pL,无酶水8.5

pL；反应条件：95 °C预变性 10 min,95 °C 15 s、60 °C 1 min共40个循环。以U6为内参，采用2-AACt法计

算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

以miR-221表达的均数为截断值，将HCC组织分为15山东医药2019年第59卷第19期miR-221高表达与miR-221低表达，分析不同miR-

swell小室置于37 °C、5% CO?的细胞培养箱1 h,待

221表达与患者临床病理特征的关系。1.3Matrigel 。 收 两组转染 24 h ， 用 血清的DMEM培养液重悬，制成密度为1 x105个/mL

1.3. 1 细胞传代培养 将MHCC97H、MHCC97L、 L02细胞分别接种于含10% FBS、100 pg/mL链霉

的细胞悬液。取细胞悬液200 pL加入Transwell小 室上室，下室加入600 pL含10% FBS的DMEM培

养基,然后将Transwell小室置于37 C、5% CO?的

素、100 U/mL青霉素的DMEM培养基，置于37 C、 5% CO2的细胞培养箱中培养。每3 d更换1次新

细胞培养箱中继续培养。培养24 h,取出小室，用棉

签轻轻拭去上室未穿透细胞,4%多聚甲醛固定10 min,0.1%结晶紫染色，倒置显微镜下观察。随机取

的培养基。当细胞生长融合80% - 90%时，用 0.25%胰蛋白酶消化，每2 ~3 d按1：3传代1次。

取传3代、对数生长期、生长状态良好细胞进行后续5个200倍视野，计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数

。1.3.2 各细胞miR-221表达检测 采用RT-qPCR

法。取传3代、对数生长期、生长状态良好的MH- CC97H、MHCC97L、L02细胞，采用TRIzol法提取细

胞总RNA,按1. 2中的方法进行逆转录和PCR扩 增。以U6为内参，采用2-丽法计算目的基因相对

表达量。实验重复3次，取平均值。选择miR-221

相对表达量最高的细胞系进行后续实验。1.3.3细胞分组与转染 将上述miR-221相对表

达量最高的细胞接种于6孔板，随机分为观察组和

对照组，然后置于37 C、5% CO2的细胞培养箱中

。 当 长 60% ~ 80% ， Lipo-fectamineTM2000 说明，观察组加入 100 pmol miR-221 inhibitor 和 5 pL LipofectamineTM2000 转染试剂，对

照组加入 100 pmol NC inhibitor 和 5 pL Lipofectami- neTM2000转染试剂。转染24 h,收集细胞，采用RT-

qPCR 法检测miR-221表达,具体方法参照1.2。每

组设6个复孔，实验重复3次,取平均值。1.3.4细胞黏附能力检测 采用细胞-基质黏附。 96 分别用 Fibronectin Matrigel包被,37 C孵育过夜;次日，每孔加入2%牛血清白

蛋白75 pL,37 C孵育1 ho收集两组转染24 h细

胞，用含0.1%牛血清白蛋白的DMEM培养液重悬, 制成密度为5 x 105个/mL的细胞悬液。取细胞悬

液100 pL接种于已包被基质胶的96孔板中,37 C 孵育1 h；弃培养基,PBS彻底清洗，去除未黏附细 胞,然后每孔加入10 pL MTT,37 C孵育4 h；去除 孔内培养基，加入100 pL二甲基亚矶，充分溶解结

晶。酶标仪于490 nm波长处检测各孔的0D值。 以ODq°值表示细胞黏附能力。每组设5个复孔，实 重复 3 次， 取平均 。1.3.5细胞侵袭和迁移能力检测 ①细胞侵袭能

力检测： 采用 Transwell 。 Matrigel 4 C过夜融化,用不含血清的DMEM培养基按1：5稀释 后，包被Transwell小室上室的基底膜,然后将Tran-

16表示 力。 重复 3 次， 取平均②细胞迁移能力检测:采用Transwell迁移实验。除 了不用Matrigel胶包被Transwell小室上室的基底膜

外,其余同Transwell侵袭实验。1.4统计学方法 采用SPSS20. 0统计软件。计量

资料以x ± 5表示，多组间比较采用单因素方差分

析,进一步两两比较采用LSD-t检验;两组间比较采

用t检验。计数资料比较采用x2检测。P <0.05为 差异有统计学意义。2 结果2.1

HCC组织与癌旁正常组织miR-221表达比较HCC组织与癌旁正常组织miR-221相对表达量

分别 6.78 ±0.39,0.98 ±0.05，二者比较 P <0.05。2.2 HCC组织miR-221表达与患者临床病理特征

的关系74例份HCC组织中,miR-221高表达39

例份,miR-221低表达35例份。HCC组织miR-221

高表达与Edmondson-Steiner分级、微血管侵犯和临

床分期有关（P均<0.05 ），与性别、年龄、肿瘤直

径、肿瘤数目、肝硬化、HBV感染无关（P均> 0.05）o 见表 1o2. 3 MHCC97H、MHCC97L、L02 miR-221 表达比较 MHCC97H、MHCC97L、L02 细胞 miR-221 相

对表达量分别为 9.47 ±0.43,5.26 ±0.36,1.02 ±

0.06o MHCC97H、MHCC97L 细胞 miR-221 相对表

达量均明显高于L02细胞，且MHCC97H细胞miR-

221 相对表达量明显高于MHCC97L细胞（P均< 0. 05）。2.4两组miR-221表达比较 转染24 h,观察组与

对照组miR-221相对表达量分别0. 27 ±0. 09,1.05

±0.05,两组比较 P <0.05o2. 5 两组

力比较 用 Fibronectin时，观察组与对照组细胞黏附能力分别为0. 266 ± 0.021,0.398 ±0.032；用 Matrigel 胶包被时,观察组

与对照组细胞黏附能力分别为0. 295 ±0. 011、 0.423 ±0.023o 两组比较 P 均 <0.05。山东医药2019年第59卷第19期表1 HCC组织不同miR-221表达与患者临床病理特征的关系（例）临床病理特征性别n221在多种恶性肿瘤中具有癌基因作用，如胰腺

癌、结肠癌、卵巢癌等［~13］,可促进肿瘤细胞增殖、

2miR-221高表达低表达P侵袭和迁移等恶性生物学行为。但在HCC组织中 miR-221表达的报道较少，其能否参与HCC的发

生、发展亦不十分清楚。本研究结果发现,HCC组

542030240. 652男0. 419女年龄W50岁911织miR-221相对表达量明显高于癌旁正常组织，

且其高表达与Edmondson -Steiner分级、微血管侵

0. 2853218211421>50岁420. 595犯和临床分期有关。提k miR-221在HCC中亦具 有癌基因作用，可参与其发生、发展。本研究还观

肝硬化察了 MHCC97H、MHCC97L、L02 细胞 miR-221 表

有482820无2611151.7380. 187HBV感染有603327无14680. 6710. 413肿瘤直径工5 cm402218< 5 cm3417170. 1840. 668肿瘤单发582830多发161152. 1090. 146Edmondson-Steiner 分级I、U级4819299. 4330. 002叭IV级26206临床分期I、u期45172810.2610. 001叭V期29227微血管侵犯有30219无4418266. 0560. 0142.6两组细胞侵袭能力比较 观察组与对照组穿

膜细胞数分别（35 ±8 ）,（140 ±23、个，两组比较P

<0.05。2.7两组细胞迁移能力比较 观察组与对照组穿

膜细胞数分别（119 ±19）,（281 ±40、，两组比较P

<0.05。3讨论原发性肝癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤之

一,HCC是其最常见的类型。目前，手术切除仍是

HCC的首选治疗方法。由于HCC侵袭性强、恶性

程度高、进展速度快，早期易侵袭和转移，故其术后 5年生存率较低［,］。但目前对HCC侵袭和转移的

分子机制尚不十分清楚。miRNA是一类长度为19 ~25个核=酸的内

源性非编码小分子RNA,能够通过碱基配对的方

式结合到靶基因mRNA的3'UTR区，从而抑制靶

基因翻译，在机体生理或病理生理过程中发挥重 要作用［］。有研究证实,miRNA在HCC的发生、

发展过程中扮演重要角色⑻。miR-221是近年发

现的miRNA家族成员之一，属miR-221/222基因 家族，其染色体定位于Xp11.3。有研究证实,miR-达变化，结果发现,MHCC97H细胞和MHCC97L细 胞miR-221相对表达量明显高于L02细胞，与

miR-221在其他恶性肿瘤细胞中的表达一致，并且 MHCC97H细胞miR-221相对表达量明显高于

MHCC97L细胞。进一步说明,miR-221可能参与 HCC 的 、

。侵袭和转移是恶性肿瘤最基本的生物学特征,

也是影响患者预后的重要原因。肿瘤细胞与细胞外

基质黏附以及侵袭和迁移是肿瘤转移过程中的关键

环节。为了观察miR-221对HCC细胞与细胞外基 质黏附、侵袭和迁移能力的影响，我们通过脂质体转

染法将miR-221抑制物转染至MHCC97H细胞，成

功下调了 MHCC97H细胞miR-221表达，采用细

胞-基质黏附实验检测两组细胞黏附能力变化，结

果发现，无论采用Fibronectin包被还是采用Matrigel 胶包被，观察组细胞黏附能力均明显低于对照组。进

一步研究发现，观察组细胞侵袭和迁移能力均明显低

于对照组。提示下调miR-221表达有可能抑制HCC

细胞基质黏附、侵袭和迁移能力，这为HCC的分子靶

向治疗提供了依据。miRNA的功能主要取决于其所

的下游靶基因功能,，一个miRNA可能数十

个甚至上百个靶基因而一个靶基因可能收到数十个 甚至上百个miRNA的。目前研究较多的miR-

221 下游靶基因有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂

Cip/Kip家族成员p27Kip1 ［4］和抑癌基因 TP53INP1［5］、PTEN［6］以及碱性螺旋-环-螺旋转录

因子家族成员Twist2［17］等,这些靶基因的生物学功能

不同，也决定了 miR-221在不同疾病进展过程中的作

用不同。但miR-221HCC细胞侵袭和迁移的下

游靶基因尚不明确,仍需进一步研究探索。综上所述，HCC组织miR-221表达明显升高,

其高表达 进肿瘤的 转 。 下调 miR-221 表达 够抑制 HCC 的 、 迁 力

这为HCC的分子靶向治疗提供了依据。（下转第34页）17山东医药2019年第59卷第19期203-208.ting angiotensinogen： insights from animal studies [J ] . Biosci Rep, 2019,39(1 ).pii： BSR20180201.[]谢幸,孔北华，段涛，等•妇产科学[M].9版.北京:人民卫生出

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