狂犬病疫苗的研究及其进展

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狂犬病疫苗的研究及其进展

姜立民

庄昉成

狂犬病是一种由狂犬病毒引起的人兽共患病，该病是以侵犯中枢神经系统为主的急性传染病，一旦发病，死亡率高达１００％。尽管这是一个古老的疾病，但人类至今仍然无法消灭它，在我国曾一度得到有效控制，但近年来狂犬病疫情快速回升［１］，研制并推广使用安全高效的人用狂犬病疫苗是控制狂犬病疫情的有效手段。本文就狂犬病疫苗及其研究进展，特别是我国在狂犬病疫苗方面的发展探讨如下。

反应也较轻，不再出现变态性脑脊髓炎。但是也出现过一些免疫失败的病例，分析原因很大程度与疫苗未经浓缩抗原量偏低，疫苗效价也未能达到ＷＨＯ规定的２．５ＩＵ／剂的标准有关。因此卫生部在１９９３年决定生产效价≥２．５ＩＵ／剂的浓缩或浓缩纯化的铝佐剂疫苗取代未浓缩疫苗。但是未纯化的浓缩疫苗含有一定的杂蛋白，如在生产过程中加入异性小牛血清、含狂犬病毒的豚鼠脑组织和地鼠肾细胞蛋白等，常引起不良反应，如注射部位疼痛、大面积红肿、全身性荨麻疹、过敏性紫癜、血管神经性水肿等，个别出现休克，神志不清，并有危及生命者，严重不良反应发生率５％～１０％［５］。因此国家药品监督管理局决定生产和使用纯化的浓缩疫苗取代未纯化的浓缩疫苗。研究报导加铝佐剂的狂犬病疫苗虽然有提高免疫力的作用，但由于疫苗的作用缓慢，产生的中和抗体较迟，而狂犬病疫苗主要用于暴露后免疫，要求疫苗快速诱导中和抗体，发挥中和抑制病毒以达到保护的作用，否则就有可能造成免疫失败的严重后果；铝佐剂不能刺激Ｔｈ１的细胞活性，也不加强

１狂犬病疫苗回顾

１８８５年法国科学家巴斯德首次将狂犬

病病毒在兔脑连续传代和干燥减毒而制成的疫苗，奇迹般的救治了一名被疯狼严重咬伤的９岁小孩，开辟了人用狂犬病疫苗的新纪元［２］。１００多年以来，特别是近二三十年现代细胞培养技术和分子生物学的发展，狂犬病疫苗取得了重大进展。

我国在上世纪８０年代前所用的狂犬病疫苗都是粗制的羊脑组织狂犬病疫苗，这种疫苗不但免疫效果不理想，而且副反应大，尤其是脑组织引起的变态性脑脊髓炎。因此在１９６５年开始，由卫生部武汉生物制品研究所等多家单位合作用狂犬病固定毒北京株通过原代地鼠肾细胞适应传代，研制成功原代地鼠肾细胞培养的灭活疫苗［３］。该疫苗是经灭活加Ａｌ（ＯＨ）３制成，于１９８０年获得生产证书并开始生产和应用，取代了羊脑疫苗。该疫苗总的预防效果是肯定的，

ＣＤ８＋细胞毒性Ｔ细胞（ＣＴＬ）的活性，即不能增

强细胞免疫，另外铝佐剂是引起副反应的重要原因，如硬结、红肿等［５－９］。鉴于此国家食品药品监督管理局局决定生产和使用无铝佐剂的狂犬病疫苗代替含铝佐剂疫苗。目前已研制成功二种类型的细胞培养的无铝佐剂的狂犬病疫苗，一种是地鼠肾细胞纯化疫苗，另一

作者单位：３１００１３，杭州，浙江省医学科学院病毒病研究所

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种是Ｖｅｒｏ细胞纯化疫苗。

浙江省医学科学院学报２００６年１２月（总第６７期）

狂犬病疫苗。用国产（辽宁成大生物技术有限公司生产）无佐剂纯化Ｖｅｒｏ细胞狂犬病疫苗与相同细胞基质的无佐剂纯化进口疫苗

２２．１

我国狂犬病疫苗现状

无佐剂纯化原代地鼠肾细胞狂犬病疫无佐剂纯化浓缩原代地鼠肾细胞狂犬

苗（ＰＨＫＣＶ）

病疫苗［３，９－１１］在纯化浓缩地鼠肾细胞佐剂狂犬病疫苗基础上，产生工艺与后者相似，毒种也是狂犬病固定毒北京株通过在原代地鼠肾细胞适应传代的ａＧ株，在原代地鼠肾细

７．０胞的病毒滴度可达１０６．０～ＬＤ５０／ｍＬ，病毒经福

［即法万特巴斯德疫苗（维尔博）］进行的

疫苗人体副反应和免疫效果观察比较［１３］：所有接种对象均未发生即时反应，在接种国产疫苗组的５０２人中，局部反应以接种部位搔痒、疼痛为主，反应率０．６５％，在接种进口疫苗组的１００人中，反应率０．４３％，两组差异无

２

显著意义（χ＝０．６０５４，Ｐ＞０．０５）。全身反应观

尔马林灭活，纯化工艺用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ柱层析，杂蛋白的去除率在９９％以上，但最后不加Ａｌ（ＯＨ）３佐剂，加适当稳定剂制成。用河南普新生物工程有限公司生产的无佐剂疫苗和佐剂疫苗各１批（效价均为４．２ＩＵ／ｍＬ）进行疫苗人体副反应和免疫效果观察比较，在接种无佐剂疫苗的２７０人中，无发热反应，无硬结、红肿等局部反应，仅１６人主诉注射部位疼痛；在接种佐剂疫苗的３９人中亦无发热反应，但有５名于第１、２、３针时发现硬结，均于４８ｈ消失，疼痛和硬结人数共１４名。两种疫苗的抗体应答，所有志愿者在接种前抗体均为阴性，在首次免后７天，佐剂疫苗３７人中仅有３人抗体阳转（≥０．５ＩＵ），阳转率８．１％；而无佐剂疫苗３１人中抗体阳转

察，仅在首针接种后有少数人出现３７．１～

３８．５℃的一过性体温升高，经７２ｈ观察，反应

消失，在整个观察过程中均未发现异常反应和中、重度副反应。两种疫苗的抗体应答，国产疫苗组检测５０人，进口疫苗组检测３５人，首针免疫后ｌ４、４５天，２组血清抗体阳转率均为ｌ００％。前者免疫后１４天抗体效价为

０．８～ｌ１．９ＩＵ／ｍＬ，抗体几何均值为５．２ＩＵ／ｍＬ；

免疫后４５天抗体效价为２．７～９．２ＩＵ／ｍＬ，抗体几何均值为９．５ＩＵ／ｍＬ。后者免疫后１４天抗体效价为０．９～ｌ２．７ＩＵ／ｍＬ，抗体几何均值为

５．６ＩＵ／ｍＬ；免疫后４５天抗体效价为１．５～２５．４ＩＵ／ｍＬ，抗体几何均值为９．８ＩＵ／ｍＬ，两组

抗体阳转率和抗体几何平均滴度差异无显著意义。因此，我国研制纯化Ｖｅｒｏ细胞狂犬病疫苗的质量已达国际先进水平。

１４人，阳转率４５．２％。在免后４５天，无佐剂

疫苗和佐剂疫苗阳转率均为１００％，几何平均滴度（ＧＭＴ）分别为１６．５ＩＵ和１７．５ＩＵ。以上

结果显示无佐剂疫苗副反应很轻，局部反应低于佐剂疫苗；另外无佐剂疫苗具有快速产生中和抗体的优点，可使人更早获得保护。

３狂犬病疫苗研究进展

３．１纯化浓缩人二倍体细胞疫苗

目前用于我国狂犬病疫苗生产的细胞基质为原代地鼠肾细胞或Ｖｅｒｏ细胞，前者存在动物容易受细菌、病毒、寄生虫等外源物质污染，且需要建设相应动物房，大量处死动物不符合等缺点；而后者由“动物伦理学”于是传代细胞系，有一定的致瘤性，细胞残余ＤＮＡ必须达到标准。人二倍体细胞恰恰没有上述缺点，理应研制开发。

美国Ｗｉｓｔａｒ研究所Ｗｉｋｔｏｒ等首先进行狂犬病固定毒在人二倍体细胞上的适应传代研究，后法国和德国等国先后进行了人二

２．２无佐剂纯化浓缩Ｖｅｒｏ细胞狂犬病疫苗

（ＰＶＲＶ）

我国已研制和生产应用Ｖｅｒｏ细胞的无佐剂狂犬病疫苗，毒种为ａＧ株、巴斯德ＰＶ２０６１株或ＣＴＮ－１株，Ｖｅｒｏ细胞从美国ＡＴＣＣ引进。病毒在Ｖｅｒｏ细胞上接种后培养

７．５

液的病毒滴度一般在１０７．０～ＬＤ５０／ｍＬ，并可以

多次收获［１２］，经浓缩、灭活、纯化，制成无佐剂

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坛株［１７］。经皮下或肌肉注射免疫家兔、小鼠、犬等动物可诱导高滴度中和抗体的产生，并能抵抗致死剂量的多株狂犬病病毒的攻击。

倍体细胞疫苗（ＨＤＣＶ）开发研究，并分别在

１９７４年、１９７８年获生产许可证。该疫苗已在

欧洲、北美以及世界各国应用二三十年，证实是安全且高效的，但由于其病毒繁殖滴度

７．０

较低（收获液病毒滴度一般在１０６．０～ＬＤ５０／ｍＬ），

１９９３年赵卫国等组建了表达狂犬病病毒Ｎ

蛋白的痘苗病毒重组体［１８］。１９９５年又在此基础上组建了共表达ＣＶＳ株Ｇ和Ｎ蛋白的痘苗病毒天坛株重组体，并证明接种小鼠后可产生高滴度的中和抗体并抵抗致死剂量狂犬病病毒ＣＶＳ株的攻击［１９］。１９９６年娄元梅等报道载体系统研究出现了非复制载体或称复制缺失载体系统，该类载体病毒在接受免疫的机体里不会复制后代，但可表达外源基因，从而诱导机体免疫［２０］。朱家鸿等［２１］已成功构建了单表达狂犬病病毒糖蛋白和双表达狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白两系非复制痘苗重组狂犬病疫苗，其安全性比复制型痘苗重组狂犬病疫苗更好，并保留了狂犬病病毒原有的免疫原性。本疫苗经动物试验表明疫苗对乳鼠脑注射不发病，而对照复制型重组病毒会发病，免疫动物可１００％诱生狂犬病毒中和抗体及保护狂犬病病毒的攻击。据此，非复制痘苗重组狂犬病疫苗比复制型更安全，且保留了免疫原性，期待开发成疫苗。

加上生产工艺复杂，因此疫苗的成本高，价格贵，较难在发展中国家推广。我国科学家致力于研制安全、高效、经济的人二倍体细胞疫苗。中国药品生物制品检定所严子林等［１４］将狂犬病病毒ＣＴＮ株鼠脑固定毒在人二倍体细胞（ＫＭＢ－１７）连续传代，在４０代后增殖达到较高的滴度，大部分都在１０６．０～７．０ＬＤ５０／

ｍＬ之间，从而获得人二倍体细胞适应株（ＣＴＮ－１株）。对ＣＴＮ－１株生物学性质研究，

免疫原性较好，致病力低，表明适合用于人用狂犬病人二倍体细胞灭活疫苗的制备。

３．２狂犬病重组活载体疫苗

研究证明，狂犬病病毒颗粒中糖蛋白和

核蛋白是诱导机体产生抗狂犬病毒体液和细胞免疫的主要保护性抗原。１９８４年首先将狂犬病病毒ＥＲＡ的糖蛋白基因重组到痘苗病毒Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株中（ＶＲＧ），后来Ｅｐｏｓｉｔｏ等则将接近衔毒的ＣＶＳ株的糖蛋白基因重组到毒力更弱的痘苗病毒ＮＹＢＨ株中。用

３．３ＤＮＡ疫苗

近年来，核酸疫苗已成为国际疫苗研究领域最热门的课题之一。其独到之处在于：直接将编码某种蛋白的外源基因（ＲＮＡ或

ＶＲＧ进行了广泛的动物实验和野生动物实验，显示服用滴度为１０７ＴＣＩＤ５０时，可使成年狐获得１００％的抗狂犬病毒的保护，免疫期１２～１８个月；安全性方面，证明其对受免

疫动物均无致病性，而且不存在水平传播现象。该疫苗已经生产，并在北美和欧洲野生动物展开使用［１５，１６］。由于发现狂犬病毒核蛋白具有介导动物机体对狂犬病病毒的细胞免疫的作用，Ｓｕｍｍｅｒ等构建了表达核蛋白基因的痘苗病毒Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株重组体，证明可诱导小鼠和犬对狂犬病病毒的免疫并能获得对致死剂量病毒攻击的部分保护。

我国在狂犬病重组活载体疫苗也进行了大量的研究。１９９２年林枫等报道将狂犬病病毒ＣＶＳ株Ｇ蛋白基因重组到痘苗病毒天

ＤＮＡ）注入宿主体内，使之在体细胞中表达，

这种外源蛋白能被机体的免疫系统识别而激发免疫反应。１９９４年Ｘｉａｎｇ等［２２］首先将编码狂犬病病毒糖蛋白的ｃＤＮＡ插入到质粒

ＤＮＡ中，将构建的质粒注射到小鼠腓肠肌

内，其后小鼠产生了抗狂犬病病毒中和抗体、抗狂犬病病毒特性性ＣＴＬ和分泌淋巴因子的Ｔ辅助（Ｔｈ）细胞，并能保护狂犬病病毒我国在狂犬病ＤＮＡ疫苗方面ＣＶＳ株的攻击。

也作了一些研究，卫生部武汉生物制品研究所李萍等［２３］报道构建了含有狂犬病毒ＣＶＳ株糖蛋白（ＧＰ）基因的重组质粒ｐＣＭＶＣＶＳＲＧ，

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证明可在ＮＩＨ３Ｔ３细胞中表达，然后免疫小鼠，可诱生低水平的中和抗体和记忆性Ｂ淋巴细胞，并能保护小鼠抵抗狂犬病病毒ＣＶＳ株的攻击。李宇辉等［２４］将ＳＲＶ９株和ＣＴＮ株的狂犬病毒糖蛋白部分表位的基因，构建含融合Ｇ蛋白基因的ＤＮＡ疫苗质粒ＶＲ１０５５－

浙江省医学科学院学报２００６年１２月（总第６７期）

免疫效果影响的研究表明，ＣｐＧ－ＯＤＮ可以提高狂犬病疫苗的免疫效果，与铝佐剂联合使用效果更好［３０］。

以上两种新型佐剂疫苗，目前还需进行质控研究，以及进一步对疫苗进行人体副反应和免疫效果的观察研究。

ＳＲＶ９ＣＴＮ，在ＮＩＨ试验也取得了很好的免疫效果。ＤＮＡ疫苗制作简单，成本低，仅一次免

疫可诱生抗体应答和明确的细胞免疫，极有发展前途，但由于其安全问题尚未解决，以及缺乏实践考验，目前尚无法取代其他狂犬病疫苗。

４结语

虽然我国狂犬病疫苗经过几十年的发

展，已经研制成功安全有效且纯化浓缩的组织细胞狂犬病疫苗，疫苗质量已接近或达到国际先进水平，但其中还存在一些不尽如人意的方面，特别是近年来狂犬病疫情快速回升，这应与狂犬病疫苗质量有一定关系，我们应在加强疫苗质量及流通领域监管，同时考虑研制新一代安全、高效、经济的狂犬病疫苗：人二倍体细胞疫苗在国外已经有长期的免疫史，证明是安全的、高效的，我国也已经有较好的研究基础，加上近年来新型佐剂的研究，因此开发安全的、高效的、经济的新型佐剂狂犬病疫苗应该有很好的前途；另外近几年来高新技术在狂犬病疫苗研究广泛应用，狂犬病重组活载体疫苗与ＤＮＡ疫苗动物试验均证明安全有效，期待进一步开发。

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３．４新型佐剂疫苗

佐剂能增强机体对疫苗病毒的免疫应

答，现有的人体疫苗中因加入的铝佐剂的一些缺陷而大多不含有任何佐剂。林海祥等［２５］研究用聚肌胞（ＰｌｏｙＩ：Ｃ）的衍生物，叫聚肌胞卡那霉素钙（Ｐｉｃｋｃａ）作为佐剂的皮卡地鼠肾细胞疫苗。聚肌胞本身是一种无毒、高效干扰素诱生剂，有很强的促进机体免疫应答（体液免疫和细胞免疫）的作用。皮卡狂犬病疫苗的实验观察表明［２６］，皮卡佐剂疫苗明显优于

Ａｌ（ＯＨ）３，能明显促进免疫细胞的增殖，促进ＩＬ－２的生成，免疫可提高疫苗效价５～１０倍，并能显著提高ＩｇＧ和中和抗体滴度。

近年研究发现细菌ＤＮＡ和合成的寡脱

氧核苷酸具有免疫刺激活性，序列中都含有未甲基化５’ＣｐＧ３’二核苷酸，因此统称为

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