细胞超低温生物学的基本问题

西北民族学院学报（自攘科学版）　１９９６，１７（２）　Ｊ．ＮＯＲＴＵＷ￣Ｔ　ＭＩＮＯＲＩＴＩＥＳ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（Ｎａｔｕｍｌ　Ｓｄｃｎ。ｅ）　细胞超低温生物学的基本问题＊　８　。Ｉ　Ｄ　摘要进行了论述：　关键词细胞　——’卜一　徐大康　（西北民族学院动物科学系．兰ｌ州，７３０９３０）　２　就国内外最新资料和笔者多年的教学科研经验．对细胞超低温生物学的基本问题从三十方面　问　生　７ｊＩ　曰胞　超低温（一１９６℃）与性细胞的关系越来越密切，已引起国内外专家学者的极大重视。冷冻　胚胎也好、冷冻精液也好、冷冻卵细胞也好都在飞速的发展着。关键在于超低温的环境能长期　延长性细胞的生存时间，英国利用保存　１３年的冻精，解冻给母牛配种后产育ｒ两头小牛犊，　生长发育良好。　那么，细胞超低温生物学存在的基本问题是什么呢？问题并不在于细胞能否长期耐受低　温；而在于二次跨越危险温度区（一０．６ｔ；～一６０℃）时如何最大限度的减少性细胞的死亡率．　这是当前超低温生物学研究的中心问题。据国外资料报导：虽经世界科学家４５年的潜心研究　（指哺乳动物精子冷冻保存，１９５０年首次获得成功），冻制方法多次改进，现有技术条件二次跨　越危险温度区，但仍损失５０％　上的精子。如何将损失率５０％减少到４０％、３０％甚至更少．　这已成为冷冻领域内研究的热门课题。据理论上推断．如果能将０℃水，以每秒钟５０００１７的高　建度骤降则可以防止冰晶的发生，使精子安全度过危险温度区，直接到达玻璃态，避免冰品对　精子的损伤，但在当前条件下还达不到这种程度。　既然现在还达不到８０％或全部存活的水平．那么如何提高存活率的问题，就成为当今研　究的重点。多年研究结果证明，存活率高低主要取决于以下三个因素：　细胞的大小　、者易冻透，细胞还来不及形成结晶核已达到玻璃态，存活率就高；太者　相反　二、二次跨越危险温度区的速度问题：关于降温速度问题，世界上尚有争议　应该说绝大　多数国家，都倾向或基本上公认快速降温和快速解冻，迅速跨越危险温度区．最ｌ尢限度的防止　冰晶发生，即所谓“玻璃化学说”的冷冻原理。并且为牛的冷冻精液所证实是成功的是有效的。　第二种观点是“微晶说”，５０年代有人提出“漫速降温”（加人防冻剂）、分段降温的方法，也获得　了成功的效果。第三种观点　苏联学者Ｃ￣ｐｎｏＢ（斯米勒诺夫）提出被冷冻细胞．膜外为微晶　的，膜内为玻璃态。我们国家倾向“玻璃化学说”，“全国牛冻精标准化”主持＾杨学时研究员，　已在“牛冻精国家标准化文件中”肯定了这一基础理论　三、加人防冻剂的浓度和种类：　１９９５年１１月２３日收稿　＊校庆４５周年学术报告稿　维普资讯 http://www.cqvip.com

防冻剂当前多选用甘油或二甲基亚砜，甘油亲水性很强，可和干扰水分子的品格排列，阻　抑水形成冰晶．使水处于过冷状态．从危险温度区的上限缩短危险温度区；当甘油被精细胞吸　收后，多集聚精子膜周围吸附水分，防止水分外渗，使精子不发生严重脱永现象。防冻剂浓度　对存活率也有影响，对小鼠胚胎反复试验证明．１．２Ｍ为最适浓度。小于１Ｍ或大于１　２Ｍ都　对冷冻胚胎不利　综上所述，细胞大小、冷冻速度、防冻剂的加入均涉及到“冰晶的形成问题”　众所周知，物质有三种形态：气态、液态和固态。当水由液态向固态转化时，即可形成结晶　态（冰晶：分子呈几何学图式排列。）也可形成玻璃态（分子没有规律性排列）。　在此特别指出的是结晶（冰晶），它是冷冻过程中对精子最大最大的危害因素，可是冰晶的　出现与否是有条件的，它随降温的速度不同而不同。一般认为：冷冻过程中，缓慢降温形成大　冰晶；较快降温形成小冰晶；更快降温还来不及形成冰晶，就直接形成玻璃态。所谓冻精就是　利用快速降温的方法，最大限度地防止冰晶的发生．从而提高其存活率的。从牛的颗粒冻精制　作充分体现　这一原则，采集的牛精液经过２～４小时的平衡后，由Ｏ℃～５℃在４～５秒钟内　要降低到负１９ＣＣ．降温速度为４０℃－５０＂Ｃ／秒其间仍会出现少部分冰晶，敞现在市场上应用　的冻精只能达到３Ｏ％～４０％的存活率。　那么，为什么冰晶会损伤精子呢？精液在一０．６℃以下保存时，首先精清中的水分开始结　冰．并把其溶质排除到尚未结冰的那一部分精清中，使其形成高渗溶液。此刻精子内部细胞液　尚未结冰处于过冷状态，由于精子质膜内，外浓度差的关系，【　及冰和水表面蒸气压差的关系．　造成精子失水。降温越缓慢，精子失水越多，导至原生质变干精子死亡，是一种不可逆反应；再　者冻结到何种程度能使细胞死亡，取决于形成冰晶的数量和冰晶的大小，快速降温形成的冰晶　数量少而且小，对细胞危害不大。反之．形成大的冰晶．可刺伤精子的细胞膜．并进入精子内，　破坏精子的内部结构，造成精子死亡；另外，结晶态分子，呈现一定几何学图式排列　破坏了原　生质分子的正常结构，造成不可逆反应，相反，如果直接形成玻璃态，分子无次序排列，不破坏　原生质的正常结构，当快速解冰时，发生可逆性反应，精子又可复苏，并且能使母畜配种后受　胎。　所以，冷冰精液的关键就在于最大限度的防止冰晶的发生，冰晶发生的温度区为一Ｏ．６℃　６０℃通常称之为危险温度区．（一１５℃～一２５℃称之为最危险温度区）。　精液冷冻过程和懈冰过程，要二次通过危险温度区。冷冻时从Ｏ～５℃在４～５秒内到达　１９６℃；解冰时先备好４Ｏ加温水由一１９６℃４～５秒内达到零上３８℃左右，迅速地通过危险温　度区。　当今的冷源（液氨或干冰——固体Ｃ　）还不能完全杜绝冰晶的发生，故常加人防冻荆甘　油．保护精子迅速跨越危险温度区。减少精子的死亡率。　总之，采用何种方法降低冷冻过程中细胞死亡率，已成为当今超低温生物学研究的中心问　题。准能找到每秒降温５０００℃的方法，将是一大贡献。展望超低温生物学发展之神速，相信　不久的将来就会从根本上解决冰晶的出现问题。　（　回顾细胞冷冻研究史．在没有发现冷源液氮之前，连每秒降温４Ｏ℃～５Ｏ℃速度都是不可　能的，丽当今已成为现实。更高速度降温的冷源，尚未被人类发现和认识，这正象没有发现铀　以前，人类对原子的潜在能量毫无认识，但现在已经成为人们的常识。