构建甲烷氧化工程菌降解甲烷的研究进展
摘要：对国内外甲烷氧化菌的研究现状、甲烷氧化菌的分布、分类及其作用机理、
运用DNA基因重组技术构建甲烷氧化工程菌等方面进行了简述，并对运用甲烷氧化工程菌降解甲烷的前景进行了展望、提出现阶段存在的问题和未来研究的方向。
关键词：甲烷氧化工程菌；甲烷单加氧酶；降解甲烷； 1引言
甲烷是重要的化工原料和化学能源，在人类的生产生活中扮演着重要的角色。但甲烷同时也是一种温室气体,它引起的温室效应是同等质量二氧化碳的20-30倍，由于甲烷排放的增加, 近200 年来其在大气中的含量以每年1%的速度急剧上升,而大气中甲烷含量的不断增加，主要是由于甲烷排放源的增加和甲烷汇的减少,80％～90％的甲烷来源于生物活动，而甲烷的唯一生物汇为土壤里甲烷氧化细菌的氧化作用。如果能够合理有效地运用基因工程技术构建甲烷氧化工程菌并用其降解甲烷，不仅可以降低温室效应从而保护环境，又可以产生巨大的商业价值，无疑有很重要的意义和很广阔的应用前景。
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2国内外甲烷氧化菌的研究现状
甲烷氧化菌的研究一直受到科学工作者的关注，国内外已有很多科学工作者对甲烷氧化菌进行了比较深入的研究。其中包括对甲烷氧化菌的分类与分布、生理生化结构、催化作用机理以及甲烷氧化菌的特征酶甲烷单氧化菌（MMOs)的生化结构与功能、基因技术构建等方面的研究。West 等人
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就使用T7 聚合酶表达系统使来自于M.
capsulatus Bath 的sMMO的蛋白B 和还原酶C 在大肠杆菌内得到了活性表达，但是羟化酶组分却表达不出活性。韩冰等通过选用不同的启动子和宿主细胞探索表达pMMO 的可能性, 结果得到了具有氧化甲烷活性的重组菌,但该重组菌的pMMO 活性不稳定,很多重组菌检测到pMMO 蛋白的表达, 但没有催化活性。
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3甲烷氧化菌的分布、分类及其作用机理
甲烷氧化菌是一类能够以甲烷作为唯一碳源和能源生长的革兰氏阴性菌，广泛存在
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于泥土、沼泽、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中, 通常生存温度为20-45 0C，基于甲烷氧化菌细胞形态、代谢类型不同, 甲烷氧化菌可以分为I型甲烷氧化菌和II型甲烷氧化菌。其中I型甲烷氧化菌采取的是戊糖磷酸途径, 而II型甲烷氧化菌采取的是丝氨酸途径 。
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3.1甲烷氧化菌降解甲烷的作用机理
甲烷氧化菌能够以CH4 作为能源和碳源，氧气为电子受体，通过甲烷单加氧酶将甲烷氧化为甲醇。1984 年Daiton 等人
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首先证实了甲烷单加氧酶（MMOs）的催化机
理，即羟基化酶是MMO催化中心，它和甲烷、分子氧结合，使之活化。还原酶可以接受电子给体还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的电子，进而为羟基化酶提供电子，调节蛋白B在还原酶和羟基化酶之间的电子传递过程中起调节作用。催化反应如下： CH4 + O2 + H+ NADH → CH3OH + H2O + NAD
+
+
3.2 甲烷氧化菌的特征酶
甲烷单加氧酶（MMO）是甲烷氧化菌的特征酶，目前已知存在2种不同的类型即可溶 性甲烷单加氧酶（sMMO）和颗粒状或膜结合甲烷单加氧酶（pMMO）。虽然这2种类型的甲烷单加氧酶在细菌内具有相似的功能，但两者的基因和结构都存在差异性。
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3.2.1 sMMO的生化性质
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sMMO存在于细胞质中,不含卟啉铁,许多的烃类化合物和芳香族化合物都能被其氧
化。sMMO比pMMO具有更宽的底物专一性,能催化很多C8以下长链烷、烯、芳香族化合物氧化. 而且sMMO 降解部分环境污染物的能力比pMMO强, 如sMMO催化氧化三氯乙烯的速率是pMMO 的250倍。因此sMMO在清除有机污染物和生物催化合成方面具有更大的应用潜力。
3.2.2 pMMO的生化性质
[8-9]
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pMMO一般存在于细胞膜上，相对分子质量为94kDa。基本上所有的甲烷营养菌中
都含有pMMO,仅能催化甲烷和一系列短链烃的氧化,对少于五个碳的烷烃和烯烃具有更好的选择性,其可以利用多种电子供体,甲烷氧化可以在更低的浓度下高效进行,其催化甲烷氧化的速度比sMMO 高60%左右，是自然界甲烷氧化反应的主要酶系。相对于sMMO
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而言, pMMO的表达不会受环境中的Cu抑制, 更适合于工业应用。
2+
4 应用基因技术构建甲烷氧化工程菌
虽然甲烷氧化菌具有重要的降解甲烷的工业应用潜力,但由于一些瓶颈问题,比如其只能以甲烷为唯一碳源进行代谢,由于甲烷氧化菌生长所需底物甲烷和氧气均为气体, 两者在水中溶解度很低, 严重了细胞利用底物的速度，因此在通常的培养条件下甲烷氧化生长缓慢、细胞密度低、培养困难、发酵周期长。再就是已有的甲烷氧化菌种类有限和MMO在甲烷氧化菌内的表达量有限导致其浓度和反应速度无法满足工业生物催化的要求等等，了甲烷氧化菌及MMO的工业应用
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。通过基因工程的手
段，构建具有降解甲烷能力的MMO基因的载体，导入可利用包括甲烷在内的有机物快速生长的宿主细胞中，进而构建高效降解甲烷超表达甲烷氧化工程菌，实现利用异源宿主表达MMO的工程菌株进行甲烷的生物催化。提高甲烷氧化菌的生长速度、细胞量及MMO的表达量，从而解决甲烷氧化菌通常的培养条件下生长缓慢、细胞密度低、MMO在甲烷氧化菌内的表达量有限等问题，为甲烷氧化菌降解甲烷的工业应用提供新的方法。
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4.1 构建甲烷氧化工程菌的基本过程
⑴ 从甲烷氧化菌细胞中分离出控制降解甲烷的基因组DNA（即MMO的基因），用性核酸内切酶分别将外源基因和载体分子切开。
⑵ 用DNA连接酶将含有控制降解甲烷的DNA片段接到载体分子上，构成DNA重组分子。 ⑶ 借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入可利用包括甲烷在内的有机物快速生长的宿主细胞中。
⑷ 短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到宿主细胞的基因组中。 ⑸ 筛选和鉴定经转化处理的细胞，获得控制降解甲烷的基因高效稳定表达的宿主细胞，这就是成功构建的甲烷氧化工程菌。
5 甲烷氧化工程菌降解甲烷的前景、现存在问题和未来研究方向
5.1 对甲烷氧化工程菌降解甲烷发展前景的展望
⑴ 可以想象，如果甲烷氧化工程菌降解甲烷的技术能够走出实验室，并能广泛应用于实际的降解甲烷的话，那将是一个有多么重大意义的事情。甲烷氧化工程菌以其高效、专一、快速降解、无二次污染等优势一定能够在降解甲烷等方面大展身手。该技
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术可以运用于降解城市垃圾填埋场厌氧发酵产生的甲烷，从源头上减少甲烷向大气的排放，从而缓解全球的温室效应。
⑵ 矿井中瓦斯的含量过高而导致的矿难一直是一个严重的问题，而瓦斯的主要成分是甲烷，如果在煤层开采时在开采的煤层投放甲烷氧化工程菌，利用其高效快速氧化矿井中的瓦斯能力,降低矿井中的瓦斯浓度，有助于从根本上防治煤矿瓦斯灾害。 ⑶ 与传统的通过甲烷转化为甲醇的工业合成的高耗能、成本高、效率低的特点相比，甲烷氧化工程菌降解甲烷技术生产甲醇反应条件温和, 低成本、催化高度专一,在工业生产甲醇中利用该技术前景十分广阔。这些仅仅是未来甲烷氧化工程菌降解甲烷在实际应用的几个方向，将来亦可以将其运用于治理土壤、地下水等等，未来的社会足以为它提供保护自然环境，为人类服务和展示自己的舞台。
5.2现阶段存在的问题
虽然科学家们在构建甲烷氧化工程菌降解甲烷的研究上已经取得一些进展，但不能否认现在想让甲烷氧化工程菌成功地应用于实际环境治理中和工业生产中还有很多的问题需要人们去解决。在甲烷单加氧酶的分离提纯中，酶很容易失活；构建的宿主细胞中，甲烷单加氧酶的活性很低、不稳定，有的根本就没有催化活性。这些问题都需要今后的进一步的研究。还有就是实际的自然环境不像实验室中的实验环境那样具有可控性，其变化多端，环境恶劣，在实验室中成功构建的有很好的降解能力的工程菌能否在自然环境中也能够正常地生长繁殖和发挥其降解能力呢？甲烷氧化工程菌会不会对环境存在其他现在还无法估价的影响？会不会通过食物链进入人体而产生对人体有害的物质？这些问题暂时还不能很清楚地知道答案，都还需要人们今后不断地研究和探索才能得到解决。
5.3 未来研究的方向
若想让工程化甲烷氧化菌降解甲烷的技术真正使用在工业生产上，提高工程菌MMO的活性和其对环境中其他影响因子的耐受性是关键，因此在未来还要对工程菌里面MMO的催化活性、其对自然环境的适应性以及基因工程的安全性问题等方面进行深入研究。 在未来的研究中，可以用电脑程序设计出模拟实际自然环境的实验环境，让工程菌在模拟的实验环境中生长、繁殖和降解甲烷。观察并研究在实验室中有很好的降解能力的甲烷氧化工程菌能否在模拟的自然环境中也能够正常地生长繁殖和发挥其降解能力，从而加于改造并筛选出在实际的工业生产环境中能有很好的降解效果的工程菌。
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在未来的另一个研究方向是研究能否用DNA基因重组技术把一段有自杀功能的基因整合工程菌中，控制其在有甲烷的地方可以生存、繁殖并降解甲烷，一旦降解甲烷污染完成之后就启动自身的自杀基因而自我毁灭，若能成功，DNA重组的工程菌运用于实际的甲烷治理中可能存在的基因安全性问题将得以有效解决。 相信随着科技的不断发展和人们对甲烷氧化工程菌与环境关系的研究的不断深入，甲烷氧化工程菌将在降解甲烷和其他工业生产方面发挥其重要的作用，并不断为人类造福。
参考文献
[1] 梁战备,史奕,岳进. 甲烷氧化菌研究进展[J].生态学杂志.2004，23（5）： 198-205 [2] West CA, Salmond GPC, Dalton H, et al. Functional expression in Escherichia coli of proteins B and C from soluble methane monooxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath). J Gen Microbiol, 1992, 138:1301-1307.
[3]韩冰,苏涛,杨程等.颗粒状甲烷单加氧酶异源表达方法[J].生物工程学报.2009,25(8)1151-1159
[4]崔树军,张建云等.甲烷氧化菌的生态学研究方法[J].安徽农业科学.2010, 38( 16): 8609 - 8611
[5]任占冬,陈樑,杨天宇.甲烷单加氧酶催化反应机理和化学模拟研究进展[J].化学时刊.2003 年第17卷第9期
[6]WoodIand M P，DaIton H. J. BioI. Chem，1984，（259）：53-59
[7]吴军华.甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的研究进展[J].中国酿造.2011年第9 期 总第234期
[8] 辛嘉英，阎明飞，周琦琼等.甲烷氧化细菌的铜捕获机理[J].分子催化.第23卷第5期 2009年10月
[9]an Beilen JB, Funhoff E G. Appl. M icrobio. Biotechnol. [J] ,2007,1:13-21 [10]罗亚玲,张 雷,宗敏华.甲烷单加氧酶催化机理的研究进展[J].广州化学.第31卷第2期2006 年6 月
[11]韩冰,苏涛,李信,邢新会.甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的研究进展[J].生物工程学报.2008,24(9): 1511-1519
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