生物技术引论与实践教材

农业大学农学院生物技术系

2011年8月

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生物技术引论与实践

前 言

现代生物技术是以生命科学为基础，利用生物（或生物组织、细胞及其他组成部分）的特性和功能，设计、构建具有预期性能的新物质或新品系，以及与工程原理相结合，加工生产产品或提供服务的综合性技术。包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术、发酵工程等。这门技术内涵十分丰富它涉及到：对生物的遗传基因进行改造或重组，并使重组基因在细胞内表达，产生人类需要的新物质的基因操作技术（如―克隆技术‖）；从简单普通的原料出发，设计最佳路线，选择适当的酶，合成所需功能产品的生物分子工程技术：利用生物细胞大量加工、制造产品的生物生产技术等等。

从生物技术的发展来看现在已经深入到我们社会生产和生活的很多领域里，这是生物学发展的必然趋势。现代生物技术日益应用到社会生产的各行业中，农业生产中的繁殖控制技术、动、植物育种、农作物病虫害的综合防治、动物疫病的控制、绿色食品的生产；工业生产中生物催化制造、生物技术药物和疫苗生产等都广泛的采用了现代生物技术。所以，现代生物技术的范围已经覆盖了生物类专业的各个领域，对于生命科学类专业的学生，掌握现代生物技术的原理和实践，具有现代生物技术应用必备的专业理论知识和较熟练的综合技能，才能成为适应生物技术生产、技术服务及相关专业第一线需要的高技能人才。

本教材正是在上述背景下编写的，旨在提高生命科学类专业学生的生物技术理论知识和实践技能。本教材以现代生物技术的核心―基因工程技术‖为主要内容；以试验设计的整体性，连贯性为主要出发点；各试验之间即又相互联系，前一个实验的结果又是后一个实验的材料，使学生在掌握基础理论和技术的同时，树立全面、整体的试验观念。其中实验一到实验十二是核心实验内容，包括了以大肠杆菌为代表的微生物实验技术、基因克隆技术、基因表达技术和蛋白质研究技术，且各实验相互连续，构成一个整体。后续的实验是现代生物技术的相关技术，包括动、植物转基因技术，分子标记技术、分子检测技术以及生物信息学研究方法，可根据专业不同选择开设。

本教材是由农业大学多年从事植物生物技术、动物生物技术的教师共同编写而成，所有参与教材编写的老师都认真负责的编写各自的章节，为教材保质保量的完成做出了重要贡献，在此深表感谢。由于现代生物技术的发展十分迅速，编者虽尽力吸收各方面的研究材料，但限于作者水平，纰漏之处在所难免，希望读者不吝惠予指正。

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目 录

（实验教材编写分工）

实验一：大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基制备 顾爱星 实验二：大肠杆菌工程菌平板培养 顾爱星 实验三：PCR扩增目的基因片段 葛 杰 实验四：回收目的基因片段与载体连接 张 桦 实验五：大肠杆菌液体培养 罗 明 实验六：大肠杆菌感受态细胞制备及转化 实验七：筛选重组转化菌落 实验八：菌液PCR分析 实验九：提取大肠杆菌重组质粒DNA和酶切分析 实验十：培养工程菌诱导外源基因表达 实验十一：蛋白质分离纯化技术 实验十二：SDS-PAGE检测外源基因的表达

罗 明 张 桦 葛 杰 张 桦 王希东 王希东 王希东 3

实验一 大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基制备

一、实验目的

1．了解培养基制备的基本原理，掌握培养基制备的方法和步骤。 2．了解灭菌的基本原理，学习并掌握实验室常用的灭菌方法。

二、实验原理

1．培养基按物理状态分为：液体、固体、半固体三种。 （1）液体培养基：不含任何凝固剂。

（2）固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂，通常1.5～2.0％琼脂，从海藻（石花菜）中提取得到的多糖，融化温度95℃，凝固温度45℃。

（3）半固体培养基：0.2～0.7％琼脂，一般观察细菌运动。 2．培养基按成分分为：

（1）复合（天然）培养基：以天然有机物质为主要成分的培养基。采用动植物组织或微生物细胞或它们的提取物或粗消化产物配制而成。如牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基。

（2）合成培养基：用化学纯的营养物质配制而成。确切知道其中所含营养成分的化学性质和数量。如高氏1号培养基、察氏培养基。

（3）半合成培养基：用纯化学试剂和天然有机物质配制而成。如马铃薯蔗糖培养基，马丁氏培养基。

3．灭菌（sterilization）：采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌。

4．高压蒸汽灭菌：在密闭的高压蒸汽灭菌器（锅）中进行。其原理是将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气驱尽后将锅密闭，再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121℃（压力为0.1MPa），时间维持在15~30min。此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构和发酵工厂中对培养基及多种器材、物品的灭菌。

5．火焰灭菌：微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，可直接在酒精灯火焰上灼烧灭菌。此外，接种过程中，试管或三角瓶口等，也可通过火焰灼烧灭菌。

6．干热灭菌：用干燥热空气杀死微生物的方法。通常将灭菌物品置于鼓风干燥箱内，在160~170℃加热1~2h。玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡不适合用其他方法灭菌而又能耐高温的物品都可用此法灭菌。但是，培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热

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灭菌。

三、实验内容

1．配制LB液体培养基、LB固体培养基、氨苄青霉素(ampicillin)溶液。 2．准备无菌培养皿、注射器、针头。 3．培养基及器皿的高压蒸汽灭菌。

四、实验试剂、耗材和用具

双蒸馏水、胰蛋白胨、NaCl 、酵母提取物（bacto-yeast extract）、琼脂粉、氨苄青霉素钠盐。

试管、三角瓶、培养皿、刻度搪瓷杯、量筒、pH试纸、天平、记号笔、牛皮纸、硅胶塞、注射器、针头、不锈钢饭盒、纱布、线绳等。

托盘天平、不锈钢锅、电磁炉、煤气灶、铁架、分液漏斗、高压蒸汽灭菌锅。

五、操作步骤

（一）培养基配制

培养基配制的大体流程如下：

药品称量→加水溶解→定容→调pH值→分装→塞棉塞→包扎→灭菌 LB（Luria-Bertani）培养基的配方：

双蒸馏水1000mL，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物（bacto-yeast extract）5g，调pH值7.0。固体培养基需加入琼脂粉15~20g。

原料称量根据培养基配方，按实际用量计算后，称取各种试剂放入容器（常用烧杯或不锈钢锅）中。

1．加热溶解：在容器中加入所需要的水量，然后加热，同时用玻璃棒搅拌至沸腾，将火调小，至药品完全溶解。在加热过程中应不断搅拌，以防琼脂粉沉淀糊底烧焦，并应控制火力，以免培养基起泡而溢出容器。待琼脂粉完全融化后，再用热水补足因蒸发而损失的水分。

2．调节pH：检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加 1mol/L NaCl（约1mL），边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。

3．过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布过滤。

4．分装：将配制的固体培养基分装入三角瓶中，每瓶100mL，将液体培养基分装入试管（液体培养基）中，每管5mL。分装时用三角漏斗连接软橡皮管和玻璃管，以免培养基沾在瓶口或管口上而造成污染。

5．加棉塞：三角瓶口塞上用普通棉花（非）脱脂棉制作的棉塞，试管口塞上硅胶塞，起

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到防止杂菌侵入和有利通气的作用。

6．包扎：加塞后，管装培养基可若干支扎成一捆，将管口或三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。

在制备培养基的过程中，应注意以下事项：

1．注意培养基分装时避免其沾污三角瓶口、试管口。

2．严格按照高压蒸汽灭菌的灭菌指标（温度、压力、时间）对培养基、器皿灭菌，确保灭菌彻底。

（二）准备无菌培养皿、注射器、针头

将每6个培养皿同一方向，摞成一叠，用报纸包扎。灭菌后即成无菌培养皿。 用不锈钢饭盒装注射器和针头。

（三）灭菌：将上述培养基和培养皿、注射器、针头于121℃高压蒸汽灭菌20min。如延误时间，则可能因杂菌繁殖孳生，导致培养基变质而不能使用。若确实不能立即灭菌，可将培养基暂放在4℃冰箱或冰柜中，但时间也不宜过久。

（四）氨苄青霉素溶液制备

溶1g的氨苄青霉素钠盐于足量的双蒸馏水中，最后定容至10mL。分装成小份于-20℃贮存。常以25μg/mL~50μg/mL的终浓度添加于生长培养基。

灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长1/2。

无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃温箱培养24~48h，无菌生长即可使用。保存时放在低温、低湿、阴暗而洁净的地方。

六、思考题

1．培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？ 2．在配置培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？

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实验二 大肠杆菌工程菌平板培养

一、实验目的

1.学习掌握微生物培养的原理和方法。

2.建立纯培养技术中的“无菌”概念，学习掌握无菌接种技术。

二、实验原理

消毒（disinfection）：是用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物，主要是病原微生物和有害微生物的营养细胞。

微生物接种技术：是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。包括斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等操作，目的是获得生长良好的纯种微生物。

无菌操作：是微生物接种技术的关键。常使用超净工作台（紫外线杀菌、过滤除菌）、酒精灯（火焰灼烧灭菌）、75%酒精（化学药剂消毒）。

三、实验内容

1.观察、比较、识别大肠杆菌在液体培养基中的特征。

2.每小组制备LB琼脂培养基平板1个（无抗生素）、LB琼脂培养基平板（含氨苄青霉素）2个、LB液体培养基5mL/支试管（无抗生素）、LB液体培养基5mL/支试管（含氨苄青霉素）。

3.每人采用平板划线法，培养大肠杆菌单菌落。

四、实验材料和用具

大肠杆菌液体培养物DH5菌种、LB固体培养基、无菌培养皿、超净工作台、75%消毒酒精、无菌注射器、无菌针头、0.2μm微孔滤膜、冰箱、接种环、记号笔、打火机、酒精灯、恒温培养箱

五、操作步骤

（一）大肠杆菌液体培养物观察

观察大肠杆菌液体培养物的颜色、液体表面、透明度、是否沉淀等。 （二）大肠杆菌平板培养

1.制备平板：蘸取75%酒精的棉球仔细擦手，待干后，将已灭菌、熔化的瓶装LB固体培养基冷却至55℃左右，右手握瓶，在靠近火焰处用左手拔下瓶塞，瓶口通过火焰2~3次（以烧去可能附着于瓶口的微生物）后稍微离开火焰，但保持在火焰上方的无菌区域内。左手将瓶塞夹在右手小指与无名指间（塞进瓶口的一端朝外）。然后左手取平皿，无名指和小指托住皿底，大拇指和中指夹住皿盖，在火焰上方无菌区内启开皿盖，迅速注入培养基15mL左右，

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立即合上皿盖并使皿底均匀铺满培养基。平皿静置于桌上，冷凝即成平板。室温下放置，使平板表面干燥无水膜，以利于形成单菌落。

2.制备含氨苄青霉素的培养基：使用无菌注射器吸取氨苄青霉素溶液，将一张0.2μm微孔滤膜装入无菌注射器，加上无菌针头，火焰旁打开无菌培养皿盖，加入皿底（使终浓度50μg/mL），迅速注入培养基15mL左右，立即合上皿盖并慢速转动使氨苄青霉素溶液和培养基混合均匀。平皿静置于桌上，冷凝即成平板。

将氨苄青霉素溶液加入LB液体培养基试管，使终浓度50μg/mL。

3.画线：画线的方式很多，其目的都是使平板上菌体逐渐变稀，最终能形成单菌落。常见的有下列两种：

（1）连续画线法：接种环或针头稍弯的接种针火焰灭菌并冷却后，取大肠杆菌菌液，在平板上作连续画线。

（2）分区画线法：接种环（或针）取样品后，在靠*皿边缘处的平板上，用接种环前缘或针尖的弯曲部位接触平板，接种棒与平板成30°~40°角，画3~4条平行线。然后转动平皿约50°角，灼烧接种环（针），冷却后，通过前一区划2~3条平行线，并继续画2~3条不通过前一区的平行线。再转动平皿••••••，如此画4~5区。

4.培养：室温放置1~2h，待接种菌液被培养基吸收后，倒置于37℃恒温培养箱培养16~20h。

5.检验：观察微生物菌落，注意选择孤立的菌落，仔细观察菌落的形状、大小、颜色、光泽、湿润度、隆起度、透明度、边沿形状等特征，抓住微生物的主要特征进行识别。

划线分离时，挑菌量要小，严格无菌操作，避免环境中的杂菌污染。

六、思考题

1．比较各种灭菌、消毒方法的原理及适用范围。

2．使用分区画线法时，为何每次画线后要烧接种环（针）？

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实验三 PCR扩增目的基因片段

一、实验目的

1.掌握PCR扩增DNA的技术及原理。 2.学习PCR扩增仪的使用。

二、实验原理

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外DNA扩增技术，1985年由Mullis等人创立。该技术能在几小时的实验操作中，将人为选定的一段DNA扩增几百万倍，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点，目前已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段，另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。 PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA为模板，从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA，假设PCR的效率为100%,反复n周期后，理论上就能扩增2n倍。PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。

三、实验内容

常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95℃，复性温度为37℃～55℃，延伸合成温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），反应循环数为30。

四、实验材料

1.实验器材

PCR扩增仪，台式高速离心机，移液器，经高压灭菌后的Eppendorf管，电泳仪。 2.实验试剂

（1）模板DNA（0.1µg/µl）：用牙签挑取单菌落悬浮到50µl的裂解液中（裂解液1%TritonX-100，20mmol/l Tris-HCl PH 8.2, 2mmol/l EDTA），95℃温浴10分钟，10000rpm离心5分钟，取2µl上清液用于总体积50µl的PCR反应。

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（2）TaqDNA聚合酶（5U/µl），10×扩增缓冲液，dNTP（1mmol/L）：购买 （3）引物（100pmol/L）：设计并合成与目的DNA两侧互补的引物内。

五、操作步骤

1．准备PCR反应溶液

（1）按以下次序，将下列成分在0.2ml灭菌Eppendorf管内混合： 10×扩增缓冲液 5µl 4×dNTPs(包括四种dNTP) 4µl 引物1 1µl 引物2 1µl 模板DNA 1µl (10ng) Taq DNA聚合酶 1µl (2.5U) 加水至终体积 50µl

（2）用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。

2．PCR扩增反应

将加好样品的Eppendorf管置于PCR扩增仪内，94℃5分钟，使模板DNA完全变性。然后按94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸45秒，重复循环35次，循环结束后72℃延伸10分钟。反应完毕，将样品取出置-4℃待用。 3.实验结果观察

取出样品，进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳，溴化乙锭(EB)染色，观察DNA条带。

注意事项：

1.PCR体系所加成分的实际用量，应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液浓度进行核算。

2.加样时要认真,吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。

3.Taq聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深，酶量不能过多。

六、讨论与作业

1．PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有必要进一步优化反应条件，包括改变退火温度和时间，调整Mg2+浓度等。

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2．PCR反应特异性强，引物浓度、TaqDNA聚合酶和dNTP的量不宜过多。

3．引物设计要合理。一般引物长度为18个~30个核苷酸；引物间的G + C含量应为40%～60%，而且避免引物内部产生二级结构；引物3ˊ端不应该互补，避免在PCR反应过程中产生引物二聚体；避免引物3ˊ端出现3个连续的G或C；理想的情况下，成对引物的G、C含量应相似以便以相近的退火温度与互补的模板链相结合，此外，引物5ˊ端序列对于后续操作也是十分有用的，例如，对PCR产物进行克隆时，可以考虑在引物5ˊ端引入性酶切位点。

思考题：

影响PCR的因素有哪些？

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实验四 回收目的基因与载体连接

第一部分 目的基因片段的回收

一、实验目的

1.了解回收DNA片段的几种方法及其优缺点 2.掌握胶回收和柱回收法回收目的基因片段

二、实验原理

DNA片段的分离和回收是一项重要的技术，可收集特定PCR产物片段或酶切片段用于克隆、制备探针等工作。在DNA片段回收实验中有两个最重要的技术指标：一是产物的纯度，未达标则严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；二是产物的回收率，回收率低增大前期的工作量。回收DNA片段的方法很多，理想回收方法应满足以下要求：（1）回收片段的纯度高，不可带有凝胶；回收过程中加入的物质也要除净；无DNA酶污染等。（2）可用于大小不同的DNA片段回收。（3）较高的回收效率。（4）操作技术方便、快捷，不需昂贵的试剂和特殊的仪器设备。目前已有20余种原始或衍生的方法可供选择，纤维素膜电泳回收法、透析袋电洗脱法、冻融法、玻璃粉法、琼脂糖凝胶法等方法，但还是缺乏高效回收不同大小DNA的普遍实用方法。实验室一般根据回收片段的大小、现有的试剂与器材、以及后处理的难易等选择合适的回收方法。很多生物公司开发了不用DNA片段的回收试剂盒，现在大部分的实验室都采用试剂盒来进行回收。在这些试剂盒中多利用特殊硅基质材料，在一定高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，快速高效回收DNA片段。

三、材料与方法

（一）材料 1、实验材料

PCR产物或酶切DNA片段 2、实验试剂

试剂盒，TAE电泳缓冲液，琼脂糖， 3、仪器设备

电泳仪，电泳槽，高速离心机，紫外分析仪，凝胶成像分析系统，微量移液器 （二）方法 1、凝胶回收法

凝胶回收的产率在40%-80%之间, 如果目的片段较少, 则可能导致回收产物很少。（基本

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过程见图示）

图：柱回收过程示意图

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，按TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行凝胶回收。使用前请仔细阅读说明书，以产品说明书为准。

（1）向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μL平衡液BL，12000 rpm离心1 min。倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（2）紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，放入干净的离心管中，称取重量。向胶块中加入3倍体积的溶胶液PN，50℃水浴放置10 min。

（3）将所得溶液加入吸附柱CA2中，室温放置2 min，12000 rpm离心45 s，倒掉废液。 （4）向吸附柱CA2中加入700 μL漂洗液PW（加入无水乙醇），12000 rpm离心45 s，倒掉废液。

（5）向吸附柱CA2中加入500 μL漂洗液PW，12000 rpm离心45 s，倒掉废液。12000 rpm离心2 min，除尽漂洗液PW。

（6）室温放置2 min，晾干。

（7）将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入适量洗脱缓冲液EB或无菌水，室温放置2 min，12000 rpm离心2 min收集DNA溶液。可重复一次。

（8）回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。

注意事项：

（1）点样后最好等待1分钟，让样品在加样孔中均匀分散。

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（2）紫外灯下切下目的带。胶块要尽可能小，尽量控制在100uL，否则影响回收率！ （3）将回收的凝胶切成尽可能小的块，放入EP管中，做好标记。 （4）50℃水浴溶胶，其间偶尔摇动，至胶完全溶解，熔胶要充分。 （5）洗脱时如用水洗脱，要保证其pH值在7.5-8.0之间。 2、PCR产物直接回收法

如果PCR产物只有一条带，可以不用凝胶回收，还直接从PCR反应液回收，这样可以避免跑胶过程中损失部分PCR产物。

按TIANGEN普通型PCR产物回收试剂盒说明书进行凝胶回收。使用前请仔细阅读说明书，以产品说明书为准。

（1）柱平衡：向吸附柱（吸附柱放入收集管中）CB2中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。

（2）按PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。

（3）所有溶液加入平衡好的吸附柱CB2中，室温放置2分钟，12000rpm离心30-60秒。弃废液。

（4）向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（已加无水乙醇），12000rpm离心30-60秒，弃废液。

（5）重复上述步骤一次。

（6）将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm离心2分钟后，将吸附柱CB2置于室温放置数分钟后，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

（7）将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置滴加30-50μL洗脱液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟收集DNA溶液。可重复此步骤一次，每次体积不少于30μL。

（8）回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。 3、冻融法胶回收DNA片段

此法是利用冻融这一过程破坏凝胶结构，使DNA被释放出来。再用无水乙醇沉淀DNA。 （1）紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心管中；

（2）加入等体积的Tris-HCl饱和酚（pH 7.6），振荡混匀； （3）-20℃放置5-10min；

（4）12000rpm 离心5min，上层液转移置另一离心管中； （5）加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；

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（6）-20℃，放置5-10min；

（7）12000rpm 离心5min，合并上清液；

（8）用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；

（9）加入1/10体积3M NaAc（pH 5.2）、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀； （10）-20℃，静置30min；

（11）12000rpm，离心10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干； （12）加适量H2O或TE溶解沉淀。

（13）回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。

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第二部分 目的基因片段与载体连接

一、实验目的：

1.学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。

2.掌握利用T载体克隆PCR产物的方法；复习连接实验流程。

二、实验原理：

普通Taq酶会在3´末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3´端均有一个单链状态的A；T载体是线状DNA片段，在DNA双链的3´端均有一个单链状态的T；二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。如图所示。

图：pMD18－T 载体的结构

此种连接方法是根据普通Taq酶会在3´末端加一个A的原理发明的；注意不同的酶的性能不同，保真性强的Taq酶会自动切除末端的A，所以，这种酶的扩增产物需要补加A后再连接。生物公司的T载体试剂盒里附有全套T载体连接转化的说明，基本上按说明书要求进行即可。

三、材料与方法

（一）材料 1、实验材料

PCR产物或酶切DNA片段 2、实验试剂

T－Vector KIT试剂盒（TAKARA公司），无菌水

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3、仪器设备

低温水浴或连接仪，离心机， （二）方法

（1）在0.5mlEppendorf 管加入以下试剂： 目的片段（0.1ug/ul） 3μl T载体DNA（0.1ug/ul） 1μl 水 1μl SolutionⅠ(含连接酶和缓冲液) 5μl 总体积10μl

（2）瞬时离心，混合均匀。16℃连接4—16 小时，-20储存或直接用于转化。

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实验五 大肠杆菌液体培养

一、实验目的

1、学习细菌液体培养的方法，了解大肠杆菌的生长特性。 2、为制备大肠杆菌感受态细胞作准备。

二、实验内容

1、掌握无菌操作、接种技术的基本环节。 2、培养获得处于对数生长期的大肠杆菌菌液。

三、实验材料及用具

1、仪器、用品

高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、分光光度计、-70 ℃ 冰箱、机接种环、移液器及吸头、接种环、酒精灯、试管、培养皿、硅胶塞、封口膜等。

2、菌种、试剂

经活化的大肠杆菌（E. coil）DH5单菌落（实验二）、已灭菌的LB液体培养基5mL/支试管（无抗生素）和LB液体培养基100mL（无抗生素）、75%酒精等。

四、实验步骤

1.操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。

2.将长有活化的大肠杆菌（E. coil）DH5单菌落的培养皿平板握在左手，使有菌种的一面向上，并处于水平位置。

3.左手拿接种环（如握钢笔一样），在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火焰灭菌，此过程重复2次。

4.将灼烧过的接种环伸入培养皿内，接种环在内壁或未长菌落的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻挑取一个单菌落，再从培养皿内抽出接种环。

5.迅速将沾有菌种的接种环伸入LB液体培养基（5mL/支试管）中，使接种环和管内壁磨擦几下以利洗下环上菌体。接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。

6.将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。

7.将接种后的液体培养基试管置于恒温摇床上，120r/min震荡培养过夜。

8.取1mL培养液加到100mL LB液体培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养（250r/min）至OD600＝0.5～0.6（约2.5-3小时）；立即取出冰浴10-15min。

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注意事项

1、接种环节应严格进行无菌操作。

2、实验中要注意细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞。一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml。OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同。密度过高或不足均会使转化率下降。菌体密度与震荡培养的转速密切相关，根据测定的菌液OD值调整培养时间。

3、接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明菌种、日期、组别、姓名等。

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实验六 大肠杆菌感受态细胞制备及转化

一、实验目的

1.学习感受态细胞的基本原理和技术方法。 2.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。

3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

二、实验内容

1. 氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。 2. 将外源目的基因导入到大肠杆菌受体菌中。

三、实验材料及用具

1.仪器、用品

超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温培养箱、恒温水浴锅、分光光度计、-70 ℃ 冰箱、机等。

移液器及吸头（ 50uL 、200uL 、1000 uL）、接种环、Ep离心管、涂布器、试管、培养皿、硅胶塞、封口膜等。

2. 菌种、试剂

大肠杆菌（E. coil）DH5对数期菌液（实验五）、外源基因（实验四）、氨苄青霉素溶液、0.1mol/L CaCl2溶液、甘油、LB液体培养基5mL/支试管（加氨苄青霉素）等。

四、 实验步骤

1.将大肠杆菌（E. coil）DH5对数期菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作。

2.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却15 min。 3.4℃下3000g冷冻离心5分钟。

4.弃去上清，加入100l预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，用移液轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰上放置20 min。

5.4℃下3000 g冷冻离心5分钟；弃去上清，加入100l预冷0.1 mol/L的预冷CaCl2溶液，用移液轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮。

6.将细胞悬液200L分装到Ep管中，可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

7.取目的DNA10L加入以上感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上放置30min。 对照组设置：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作相同。

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8.将感受态细胞于42℃水浴中热休克90S后迅速在冰上放置2min。 9.加入800μlLB液体培养基（含氨苄青霉素），37℃，100-150 r/min摇 菌培养40～60 min.

五、注意事项

1.所有操作均应在无菌条件和冰上进行。

2.所使用的器皿必须经过灭菌。并且要防止迹量的去污剂或其它化学物质、杂菌、DNA酶或杂DNA所污染，否则会大大降低细菌的转化效率。

3.注意转化的质粒 DNA 的质量和浓度。转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍。

4.实验所用的溶液最好用3次蒸馏水配制。

六、实验报告

1.试述制备感受态细胞的原理和方法。 2.本实验成功的关键是什么？

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实验七 筛选重组转化菌落

一、实验目的：

掌握蓝白斑筛选重组转化菌落的原理和方法。

二、实验原理：

阳性克隆的筛选和鉴定可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同的层次水平进行。可以利用载体本身的一些特性，如抗生素抗性基因、插入失活，插入表达、显色法等对重组子进行初筛。显色法中常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则非重组质粒在含有x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而重组质粒得到的转化子是白色菌落。如图所示：

图：蓝白斑筛选

也就是说质粒载体编码β-半乳糖苷酶N端序列，细菌宿主编码β-半乳糖苷酶C端序列。当将些质粒转化此细菌里，可发生α-互补，在IPTG 存在下，表达出完整β-半乳糖苷酶活性，从而使5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal）形成蓝色菌落，而当质粒载体的多克隆位点上插入外源基因片段，则不能表达β-半乳糖苷酶N端序列，从而在转向细菌后不具有β-半乳糖苷酶活性，就不能生成蓝色菌落，表现为大肠杆菌本身的菌落，称为白色菌落。

三、材料与方法

（一）材料 1、实验材料

转化重组质粒的宿主菌: E.coli DH5α，或JM系列等具有α-互补能力的菌株。 2、实验试剂

X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑

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纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。

IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。

含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。

LB培养基或SOB培养基 3、设备和仪器

恒温培养箱、恒温摇床，低温冰箱，超净工作台 （二）方法

（1）每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。

（2）倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。

（3）放于4℃数小时,使显色完全。

（4）用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。

注意事项：

（1）在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。不是一开始就4℃，是等菌长出来之后。一般菌长出来就会有蓝色的了，4℃之后会进一步显色。

（2）当出现蓝斑较大，白斑很小附在周围，还有蓝白镶嵌的斑即卫星菌落的时候，大都是因为中间菌落的生长可能消耗了培养基周围的Amp，导致了卫星菌落的出现，可以小心挑取中间的那个菌落，有可能是阳性克隆。要注意培养时间不宜过长，出现阳性菌落就及时处理，以12-16小时为宜。培养基中加抗生素的时候，温度不能高了，不烫手为宜，防止抗生素失效。

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实验八 菌液PCR分析

一、实验目的

掌握菌液PCR分析的技术及原理

二、实验原理

聚合酶链式反应（PCR）是一种体外核酸扩增系统，原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

三、实验材料

1.仪器：摇床、PCR仪、台式离心机、移液器及吸头、PCR薄壁管、电泳仪等 2.试剂：10×PCR 缓冲液配制（部分随Taq酶提供）：

250～500 mmol/L KCl；100～500 mmol/L Tris-Cl（pH8.4）；15～20 mmol/L MgCl2；0.5% Tween-20；1mg/L BSA

其它试剂：模板DNA、dNTP 混合液、Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、琼脂糖凝胶等。

四、实验操作

1.PCR引物的选择。

选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物。 2.菌落的处理。

挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中，37℃200rpm摇床摇2-4小时以上。用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基；

3.菌液的处理。

用经灭菌的10μl头（不用牙签）挑去白色菌落，取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15min。

4.PCR体系：无特殊要求一般使用25ul或50ul体系。 按以下次序，将下列成分在0.5ml灭菌Eppendorf管内混合： 10×扩增缓冲液 5µl 4×dNTPs(包括四种dNTP) 4µl 引物1 1µl 引物2 1µl 模板DNA 1µl (10ng)

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Taq DNA聚合酶 0.5µl (2.5U) 加水至终体积 50µl PCR反应程序

(1) 94℃变性5min，(2) 94℃变性1min， (3) 55 ℃退火1min，(4) 72 ℃延伸1min。(5) 重复(2)-(4)30次。（6）72 ℃ 延伸90s。反应完毕，将样品取出置-4℃ 待用。

五、实验结果

取出样品5μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，观察DNA条带。

说明：

影响PCR的主要因素 1.模板DNA

单链、双链DNA均可作为PCR的模板，DNA样品尽量纯净，不能有核酸酶、蛋白水解酶等的污染。模板用量依具体实验而定，一般为100ul反应液有105-106个目标分子。PCR反应时模板变性要充分。

2. PCR引物

PCR引物设计是否成功是能否获得高质量PCR产物最关键的因素之一。在设计和应用时，需注意以下重要环节：

（1）PCR引物的长度约为15～30个核苷酸，并且成对引物间的G＋C含量应相似。以使它们在相近的温度下与其互补序列结合。G+C含量应为45%～55%之间。碱基分布是随机的，应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3，端出现3个连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。引物3，端碱基最好选用A、G、C,尽可能地避免选用T ,尤其应避免连续出现2个以上T。

（2）一般来说，PCR产物≤500bp时，引物长度选择16-18bp；PCR产物≥5kb时，引物长度选择24bp左右为宜。

（3）要避免引物分子自身序列互补，否则会形成发夹样二级结构。两个PCR引物相互之间的3，末端序列不能有明显的互补性，以免形成引物二聚体。

（4）引物的熔点温度（Tm值）要适当。Tm值与引物的碱基组成和长度有关；PCR引物的GC/AT应与要扩增的模板DNA相当或略高些。一般熔点温度以大于55℃为宜。

（5）引物的3，末端必须与模板严格互补，而5，末端的要求可灵活些。

（6）目前在引物选择中已广泛应用计算机软件，从EMBL或Genebank中查找有关基因序列，并对设计的引物在引物二聚体形成、自身互补性及特异性等方面进行分析评价。

（7）用于亚克隆的引物，常在引物的5，端加上性内切酶位点。为了保证内切酶有

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效酶切扩增产物，一般在酶切位点的5，端再加上几个额外的碱基。

（8）引物的浓度，在终浓度为0.2～1.0 umol/L的范围内产量基本相同，低于0.2 umol/L时会影响产量。但过高时一乃不经济，二则会出现非特异扩增及增加引物二聚体的产生。

3. 热稳定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）

一般用量为2.5 U/100uL 反应体积。酶量过多易导致非特异性产物的产生。该类酶的最适温度为75℃，在低温下仍保留相当高的活性，易引起不完全配对的引物-模板的非特异延伸及引物二聚体的扩增延伸，所以应注意防止非特异性产物的出现。

4. dNTPs

PCR常用的dNTP浓度在50-200umol/L。四种dNTPs应等当量。浓度低则反应速度下降，过高则特异性下降，可根据具体实验来确定最适的dNTP浓度。

5. PCR缓冲液

因PCR反应中的dNTP能与Mg2+结合，影响反应液中游离Mg2+的浓度，所以应按不同条件，确定合适的Mg2+浓度。一般在标准的PCR反应中（dNTP浓度200umol/L），Mg2+浓度约为1.5mmol/L。Mg2+离子浓度可显著影响PCR的产量及产物特异性。浓度高则出现非特异扩增，过低则酶活性显著下降。应用无核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%～0.1%)及5mmol的二硫苏糖醇（DTT）对酶有一定的保护作用。

思考题

菌液PCR的注意事项有哪些？

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实验九 取大肠杆菌重组质粒DNA和酶切分析

第一部分 大肠杆菌质粒DNA提取

一、实验目的

掌握大肠杆菌质粒DNA提取的方法。

二、实验原理

质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，质粒DNA的提取经常用碱裂解法、煮沸法、SDS法、Triton－溶菌酶法等，其中以碱裂解法最为常用。本方法有质粒DNA产量高、快速等优点。其原理为：在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大量蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可以用RNA酶清除。再用酚/氯仿处理，可以除去残留的蛋白质。

三、材料与方法

（一）材料 1、实验材料

带质粒的大肠杆菌培养液 2、实验试剂：STE

溶液I(50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)， 溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，

溶液III（每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H2O)，TE，氯仿/酚，无水乙醇。

3、仪器设备

高速离心机，低温冰箱，微量移液器 （二）方法

碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下：

(1)取1.5ml过夜细菌培养液于1.5ml离心管中,于台式高速离心机中以15 000rpm,常温离心30秒,弃去上清液并将离心管倒扣在滤纸上。(4管/组)

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(2)在离心管中加入100ml溶液I悬浮菌体,涡旋振荡，以充分悬浮菌体成均匀悬浮液。 (3)加入200ml溶液II,扣上离心管盖,立即轻轻混匀(来回颠倒数次),至溶液几乎澄清,成淡黄色透明粘液状。

(4)打开离心管盖,加入150ml溶液III,轻轻混匀(来回颠倒数次),看到淡黄色消失,有大量白色沉淀生成,然后离心。

(5)常温15 000rpm离心10分钟,小心吸取上清液于另一离心管中。注意,不要把白色絮状物混入上清液中。

(6)清液中加入等体积的苯酚饱和溶液:氯仿混合溶液(1:1)(各200ml),充分混匀,常温15 000rpm离心10分钟,小心将上清液转移至另一离心管.注意不要将下层有机相混入上清液中。

(7)在上清液中加入-20℃冷冻的异丙醇600ml,充分混匀,常温15 000 rpm离心10分钟。 (8)小心倾去上清液,注意避免把离心管底的白色DNA沉淀也随同上清倒掉.加入400ml 75%的冰乙醇,再15000rpm离心1min,倾去上清,倒扣离心管于滤纸上,稍许凉干。

(9)加入100ml无菌重蒸水溶解质粒DNA,可在37℃保温5~10分钟。(100ml/管,4管) (10)合并于一管,加入2ml RNase,37℃保温30分钟,取5ml电泳检查消化彻底否。(以电泳前端无RNA条带为准)

(11)RNase消化完全后加入等体积的苯酚饱和溶液:氯仿混合溶液(1:1)(各300ml),充分混匀,4℃,15 000rpm离心15分钟,将上清液转移至另一离心管。

(12)在上清液中加入0.1倍溶液体积的3M, pH5.5 KAc(约40ml),400ml的–20℃冷冻的异丙醇,充分混匀,4℃,15 000 rpm离心20分钟。

(13)用400ml 75%的冰乙醇洗涤一次,再15000rpm离心1min,倾去上清,倒扣离心管于滤纸上,稍许凉干,待用。

(14)如需定量或检测制备的质粒DNA的质量,可取适量质粒DNA进行适当稀释,测定OD260nm和OD280nm值,计算OD260nm/OD280nm的比值。质粒双链DNA量可以1 OD260nm=50mg/ml计算。OD260nm/OD280nm应为1.8左右。

现在，很多实验室已经采用试剂盒来提取质粒DNA，大部分质粒提取试剂盒的原理与碱裂解法相同。以TIANGEN质粒小提试剂盒为例。

（1）向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500 µL的平衡液BL，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（2）取3 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000 rpm离心1 min，尽量吸除上清。 （3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250 µL溶液P1（含有RNase），使用移液器彻底悬浮细菌沉淀。

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（4）向离心管中加入250 µL溶液P2，温和的上下翻转8次使菌体充解。 （5）向离心管中加入350 µL溶液P3，立即温和的上下翻转8次，充分混匀，出现白色絮状沉淀。

（6）12000 rpm离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀，将收集的上清液用移液管转移到吸附柱CP3中。

（7）12000 rpm离心45 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 （8）向吸附柱CP3中加入700 µL漂洗液PW，12000 rpm离心45 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

（9）向吸附柱CP3中加入500 µL漂洗液PW，12000 rpm离心45 s，倒掉收集管中的废液。将吸附柱CP3放入收集管中。

（10）12000 rpm离心2 min。

（11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50 µL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min，将质粒溶液收集到离心管中。

第二部分 酶切分析

一、实验目的

1、了解性内切酶的特点。 2、掌握酶切分析的方法。

二、实验原理

性内切酶 (restriction endonuclease，RE)是由细菌自己产生的能识别双链 DNA 分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅱ型酶就是通常所指的 RE，Ⅱ类中的性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA 的基础。绝大多数Ⅱ类酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')；有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

DNA 纯度、缓冲液、温度条件及性内切酶本身都会影响性内切酶的活性。大部分性内切酶不受RNA 或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水

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解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1 倍体积3mol/L NaAc 和2 倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。

DNA 性内切酶酶切图谱又称DNA 的物理图谱，在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA 用量约为0.5-1μg。性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA 酶切反应而言, 性内切酶用量可按标准体系1μg DNA 加1 单位酶,消化1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。

三、材料与方法

（一）材料 1、实验材料：质粒 2、实验试剂

EcoRI 酶及其酶切缓冲液； HindⅢ酶及其酶切缓冲液；琼脂糖(Agarose)；TAE电泳缓冲液。

3、设备仪器

水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液, 微波炉，凝胶成像分析系统

（二）方法 1、酶切实验

（1）将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.5ml)编号，用微量移液分别加入下列试剂：（双酶切反应）

ddH2O 7.8 µL 10×Buffer Tango 4.0 µL DNA 7.0 µL EcoRⅠ 0.6 µL HindⅢ 0.6 µL 总体积 20 µL （单酶切反应）

ddH2O 8.0 µL 10×Buffer Tango 4.0 µL

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DNA 7.0 µL EcoRⅠ或HindⅢ 1.0µL 总体积 20 µL 37℃培养箱中反应2h以上 2、电泳分析

（1）配制1%琼脂糖凝胶。

（2）酶切反应液加上样缓冲液上样。 （3）电泳

（4）紫外下观察结果。

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实验十 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

一、实验目的

1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。 2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。

二、实验原理

1.外源基因在原核细胞中的表达

蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。蛋白质的表达一般都要经过原核细胞表达系统进行功能验证，主要使用大肠杆菌。大肠杆菌表达系统具有生物学特性和遗传背景清楚、易于操作、有较多克隆载体可供选择、易获得大量的外源蛋白等的特点。外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在细胞质中聚集，形成均一密度的不溶性包涵体，可以保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。

在基因工程中，原核表达系统通常采用可的强启动子。常用的原核启动子为异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的lac启动子，也有由3-吲哚乙酸（IAA）诱导的trp启动子，由温度诱导的PL和PR启动子等。噬菌体 T7 RNA聚合酶启动子是一个很强的启动子，近年来在原核表达中得到广泛应用。

外源基因在原核细胞中可以以非融合蛋白、融合蛋白和分泌型表达等不同形式进行表达，大多采用融合蛋白的形式进行表达。 融合蛋白指的是在表达产物的N端或C端具有非目的蛋白的氨基酸残基。融合蛋白使用的外源基因，融合蛋白在大肠杆菌内较稳定，不易被降解，而且融合蛋白易于通过亲和层析的方法加以纯化，也可以用作标签（tag）检测目的基因的表达。

2.乳糖操纵子的调节机制

操纵子是原核细胞功能相近的基因组合在一起形成的协调单位，包括调节基因、启动子、操纵基因和结构基因几个部分，是原核细胞特有的一种基因表达方式。乳糖操纵子是最常见的操纵子形式之一，由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成（如图1），三个结构基因Z、Y、A的编码产物分别是β-半乳糖苷酶、透酶 和乙酰基转移酶。

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乳糖操纵子的诱导表达

当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列O基因结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因不能转录，也就不能翻译出目的蛋白。（如图2）。

当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3′端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。（如图3）。

乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。

本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。使用的表达载体p32a-eGFP上

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含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因表达的是带6×His（组氨酸标签）的重组绿色荧光蛋白。在IPTG的诱导下，融合蛋白表达可增强105倍，并且可用金属鳌合亲和层析分离纯化，最终获得纯的重组绿色荧光蛋白。

三、试剂与器材

（一）试剂

1.LB 液体培养基 2L 2.10mg/mL氨苄青霉素溶液 10mL

3.IPTG储液(100mM): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。

（二）器材

超净工作台、恒温振荡器、台式高速离心机、高速冷冻离心机、低温摇床、恒温培养箱、无菌玻璃棒、培养皿、封口膜、紫外可见分光光度计。

（三）菌株

工程菌BL21(DE3)pET-32a,工程菌BL21(DE3)p32a-eGFP(购于Novagen)。

四、操作方法

1. 分别挑取工程菌BL21(DE3)pET-32a和BL21(DE3)p32a-eGFP的单菌落接种到5mL LB液体培养基（含卡那霉素，终浓度为0.1mg/mL，以下同）。

2. 于37℃、250r/min培养过夜（12h－14h）。

3. 将上述培养物转接入10mL LB液体培养基(含卡那霉素）的灭菌试管或三角瓶中。 4. 37℃、250r/min培养约2h－3h，使其OD值为0.6-0.8。

5. 取6支摇菌管，做标记，各加入1ml上述培养的LB培养液；并分别加入IPTG诱导剂，使每支摇菌管中IPTG诱导剂的终浓度分别达到0、0.2、0.5、1、1.5、2毫摩尔每升。

6. 37℃,220转每分钟,恒温摇床培养3小时。

7. 3小时后，8000转每分钟,离心10 分钟,收集菌体，弃上清，加入50-200μL的双蒸水溶解菌体。

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实验十一 融合蛋白质的亲和层析分离

一、实验目的

1．学习亲和层析的原理。

2．掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。

二、试剂与器材

（一）试剂

1. 0.05mol/L EDTA—0.5mol/L ，NaCL溶液100mL 2. 2mol/L NaCL 溶液 50mL 3. 1mol/L NaOH溶液 50mL 4. 0.2mol/L NiSO4溶液 50mL

5. 平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，pH7.0 500mL 6. Ni2＋ Chelating Sepharose Fast Flow 5-10 mL

7. 重组GFP质粒大肠杆菌工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白样品 20-50ml 8. 洗涤液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaC,pH 7.0 9. 洗脱液：300mmol/L咪唑， 50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL.pH7.0 10．20% 乙醇溶液50ml （二）器材

1.5cm × 50cm层析柱；蠕动泵；紫外检测仪；自动收集器；记录仪；电泳仪及电泳槽；微量进样器。

三、操作方法

1. 样品的制备

细胞的培养及荧光蛋白表达见外源基因在大肠杆菌中的诱导表达，细胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25 ℃用细胞培养液，8000r/min，离心5min，去上清液，菌体用平衡缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积的平衡缓冲液充分悬浮，冰浴下进行高压破菌处理。然后8000r/min。离心30min，取上清液。放冰箱备用。

2. 亲和层析柱的安装

把层析柱固定在铁支架上，保持竖直，拧下层析柱上端的柱头，下端出口用夹子封闭。加入少量的无离子水，观察水面是否处于水平，排出下端的气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶5－10mL到烧杯中，加入适量的无离子水制成稀糊状（不能太稠，否则易在搅拌过程中产生气泡），沿玻璃棒贴紧层析柱柱内壁的把糊状凝胶灌进柱内，打开下端的排水口，让亲和

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凝胶剂随水流自然沉下。然后，将上端的柱头拧紧，并将顶端和下端用软管连接封闭备用。

3. 层析系统的安装、调试

（1）调节蠕动泵的的转速，使其流速保持在2ml/min左右，将软管充满去离子水。 （2）系统的连接：将蠕动泵的出水管与层析柱上端管相连，层析柱的下端管与紫外检测仪的进样端连接，将紫外检测仪的输出端与自动收集器相连。

（3）调节紫外检测器到适宜的灵敏度范围，并将输出信号端与记录仪连接。 （4）设置自动收集器为2 min收集一管。 4. 层析柱的使用前处理：

（1）用5×柱床体积去离子水清洗乙醇封存的Ni 2＋-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱，去除乙醇。

（2）用2×柱床体积的0.2M NiSO4过柱，注意观察现象。

（3）用10×柱床体积的去离子水清洗，用5×柱床体积平衡缓冲液平衡柱子。 5. 上样：

样品以每分钟2 mL的流速上层析柱，分部收集流出液，每管4 mL（记录的紫外吸收峰为穿流峰，收集最高峰对应的溶液做电泳分析，标记为样品1）。用平衡缓冲液过层析柱，直到紫外吸收峰不再下降（达到平台期为止）。

6. 洗涤：

用含50 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液25 mL冼脱，分部收集洗脱液，每管4 mL，取紫外吸收最高的一管用于电泳。

7. 洗脱：

用含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液10 mL洗脱，自动收集洗脱液。每管收4 mL，当紫外吸收达最高峰时取样用于电泳及Western blotting实验。

8. 层析柱的后处理及封存：

（1）用2×去离子水清洗柱子。（2）用10×0.5M NaCl，50mM EDTA (pH 8.0) 洗去结合的镍离子。 （3）用10×去离子水清洗柱子。 （4）用10×1M NaOH洗柱，去残留蛋白。 （5）用大约10×去离子水清洗柱，去除NaOH，直到pH值低于9。（6）用大约2×柱床体积乙醇过柱，拆除柱子，保存柱料于20％乙醇中。

9. 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：

分别取50μL穿流峰流出液、50mmol/L咪唑缓冲液洗涤的流出液和300mmol/L咪唑缓冲液洗脱的流出液。外加一个上柱前的样品液和蛋白Marker作比较。进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和层析分离纯化的结果。

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实验十二：SDS-PAGE检测外源基因的表达

一、实验目的

学习SDS-PAGE的基本操作，学会用SDS-PAGE检测蛋白。

二、实验原理

蛋白质与SDS结合后，均带有负电荷，在电场下，按相对分子质量大小在板状胶上排列。

三、实验材料及用具

(一) 仪器

1．平板电泳槽及配套的玻璃板，胶条，梳子 2．普通恒压恒流电泳仪 (二) 试剂

1．1.5 mol/L Tris-Cl PH 8.8 (4℃存放) 2．0.5 mol/L Tris-Cl PH 6.8 (4℃存放) 3．10% SDS(室温存放)

4．30% Acr/Bis 29.2 g Acr + 0.8 g Bis，用双蒸水定容至100 mL，过滤备用，4℃存放 5．10% Aps(-20℃存放)

6．2×上样缓冲液(室温存放)(总体积10 mL) 0.5 mol/L Tris.HCl pH 6.8 2 mL 甘油 2 mL 20% (W／V)SDS 2 mL 0.1% 溴酚蓝 0.5 mL 2-β-巯基乙醇 1.0 mL 双蒸水 2.5 mL 室温存放备用。

7．5× 电泳缓冲液(室温存放)

Tris 7.5 g 、Gly 36 g 、SDS 2.5 g 双蒸水溶解，定容至500 mL，使用时稀释5倍使用。 8．染色液：0.2g考马斯亮蓝R250 + 84 mL 95% 乙醇 + 20 mL冰醋酸，定容至200 mL，过滤

9．脱色液: 工业酒精:冰醋酸:水= 4:1:5(V:V:V)

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三、操作方法

（一）诱导物收集：

1.收集诱导物，8000rpm，离心10min 2. 用ddH2O（50-200ul）悬浮菌体 3. 加入等体积SDS-PAGE电泳上样缓冲液 4. 100℃, 沸水浴10-20min

5. 冷却3分钟，上样品10-15ul（一致） （二）凝胶的制备

1．凝胶的制备（不连续凝胶）： （1）分离胶的制备：

按如下表格比例将M液、N液、水、10%的过硫酸铵及TEMED 5种溶液充分混匀，制成12%的分离胶液，加入已固定好的凝胶板之间的间隙，至凝胶板2/3处，用细头滴管在已经加好的分离胶表面加水，隔离空气中的氧，并消除分离胶表面的曲度，使其平整。

12%分离胶的配制 L液(ml） 2.5

N液(ml） 4.0 H2O（ml） 3.35 TEMED（μl） 过硫酸铵（μl） 5 50 （2）浓缩胶的制备：

等分离胶完全聚合后，倒去缝隙中的水，用滤纸条吸干多余的水；同时，按一定的比例混匀浓缩胶液，将浓缩胶液加入凝胶板之间剩余的间隙，并立即插入样品梳。注意观察凝胶的聚合过程，观察梳齿附近凝胶中呈现光线折射的波纹时，即表明聚合反应已经完成。

浓缩胶配方

H2O（ml） 4.5

N液(ml） 1.15 M液(ml） 1.9 TEMED（μl） 过硫酸铵（μl） 5 50 2．装槽、上样

（1）装槽：将聚合的凝胶板装入电泳槽中，向上槽和下槽中加入电极缓冲液，拔下样品梳，准备上样。

（2）上样：在样品液中加入等体积含有SDS的上样缓冲液，混匀，沸水浴15分钟左右，冷却至常温, 吸取适量，加入样品孔中。

3．电泳：

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上样后，接好电源线以10伏每厘米的稳定电压电泳，待染料下行到距胶末端1-2cm处，即可停止电泳。

4．剥胶：

电泳结束后，从电泳装置上卸下制胶模具，取下制胶板中的短玻璃板，用样品梳慢慢的将凝胶剥下。一般剥胶方向是从浓缩胶端开始。（注意：剥胶时不要损伤凝胶表面。）

5．染色：

将凝胶置于染色盒中，倒入考马斯亮蓝染色液，摇染1小时。 6．脱色：

将染色的凝胶放入脱色液中，脱色，经常更换新溶液，直到染料不再洗出，背景几乎无色为止。

7．观察现象

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