1、概述
为了符合2010年版GMP的要求，为了确保生产检验出符合预定治疗用途的产品，确保产品质量控制合格，保证用药的有效性，本报告针对地龙冻干粉效价测定方法学进行验证。 2、验证目的
建立地龙冻干粉效价的测定方法，确认该方法适合于该品种的效价检查。 3、适用范围
本标准适用于地龙冻干粉效价测定方法学的验证。 4、验证领导小组成员及职责 部门及职务 验证工作中职务 职责 负责领导验证工作，负责验证方案及报告的批准。 负责协调领导验证工作，负责验证方案审核、验证报告的审核等各项工作。 验证方案、验证数据的审查、验证工作协调安排。 负责取样及提供验证所需检测数据。 负责收集各项验证、实验记录，并对试验结果进行分析。 验证过程监督检查，确保结果可靠性。 负责仪器、设备、仪表、量具等的校正。 负责试药、试剂、设备、对照品的购买。 公司副总经理 验证领导小组组长 质监部经理 验证小组组长 QC主管 QC QC QA 设备员 采购员 5、验证进度计划
组员 组员 组员 组员 组员 组员 验证小组提出完整的验证计划，经批准后实施。 从 年 月 日至 年 月 日 6、相关文件
国家食品药品监督管理局标准（蚓激酶）；国家食品药品监督管理局标准WS3-361（Z-047）-2003（Z）；2010年版药典一部附录ⅩⅧA中药质量标准分析方法验证指导原则；实验室控制系统GMP实施指南第11章分析方法的验证和确认；药品生产验证指南第三篇第一章检验方法验证；药品生产质量管理规范（2010
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年修订）第四章第四节分析方法验证。 7、验证内容
7.1为了确保验证数据的准确可靠，采取以下几个先行保障措施 仪器：已经过校正并在有效期内
人员：均经过培训，熟悉方法及使用的仪器 对照品：均购自中国食品药品鉴定研究院
材料：所用材料，包括试剂、实验用容器等，均符合检验要求，不给实验带来污染、误差。
检查人： 日期： 确认人： 日期： 7.2验证方法 7.2.1效价测定方法 7.2.1.1试剂配制
①磷酸盐缓冲液（PH7.8）
取磷酸氢二钠21.4g,氯化钠5.26g,加水900ml，用1mol/L盐酸调节PH值至7.8，再加水至1000ml。
②（牛）纤维蛋白原溶液
取70u纤维蛋白原，加磷酸盐缓冲液（PH7.8）20ml，水浴微热使溶解。用时取20ml。
③（牛）纤维蛋白溶酶原
取12u纤维蛋白溶酶原，加磷酸盐缓冲液（PH7.8）12ml使溶解，制成每1ml含1酪蛋白单位的溶液，用时取3ml。
④(牛)凝血酶溶液
取70u凝血酶，加磷酸盐缓冲液（PH7.8）7ml使溶解，用时取3ml。 ⑤琼脂糖溶液
取琼脂糖330mg，加磷酸盐缓冲液（PH7.8）25ml，加热使溶后体积为20ml，置55℃水浴中恒温待用。 7.2.1.2纤维蛋白板的制作
将②、⑤、③、④按顺序依次加入混匀，迅速倒入水平放置的平皿（8.5cm×23.5cm）中，若有气泡，可在未凝固之前，用小钢铲将气泡赶走，待其凝固后，盖上盖，放4℃冰箱保存1小时后，取出，此板即为标准纤维蛋白板。
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7.2.1.3检测
取地龙冻干粉约10mg，加水制成每1ml含1mg的溶液作为供试品溶液。取蚓激酶标准品，制成浓度分别为每1ml中含10000和8000蚓激酶单位的溶液。用直径约为3mm的不锈钢小管，在纤维蛋白板上打若干个小孔，精密量取蚓激酶标准品溶液和供试品溶液10µl，分别点在小孔中，将板水平放入37℃恒温箱中保温18个小时后，取出，测得各溶圈直径并计算出溶圈面积。以蚓激酶标准品单位数与溶圈面积的比值为计算系数，乘以供试品的溶圈面积，计算供试品效价单位数。标准品与供试品应各作两点，以平均值计算。 7.2.2耐用性试验
7.2.2.1不同琼脂糖对试验结果的影响
按照效价测定方法测定 ， 批地龙冻干粉的效价，分别用2个批号的琼脂糖铺板。 a、
干扰较小
b、验证实施记录和结论
表1 不同琼脂糖的检测结果
琼脂糖批号 结论：
检验人： 日期： 复核人： 日期： 7.2.2.2不同纤维蛋白溶酶原对试验结果的影响
按照效价测定方法测定 ， 批地龙冻干粉的效价，分别用2个批号的纤维蛋白原。 a、可接受标准 干扰较小
b、验证实施记录和结论
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可接受标准
样品 效价（u） 样品 效价（u） 表2 不同纤维蛋白原的检测结果 纤维蛋白溶酶原批号 结论：
检验人： 日期： 复核人： 日期： 7.2.3准确度试验
取蚓激酶对照品加水, 制成每1ml含蚓激酶分别为10000, 8000, 5000u的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液8µl点样，每个浓度各分别点样3次。按效价测定方法检测并计算回收率。 7.2.3.1可接受标准
回收率为95.0-105.0%，回收率RSD≤5.0% 7.2.3.2验证实施记录及结论
表3 蚓激酶加样回收率
对照品浓度（u/ml） 点样次数 1 10000 2 3 1 8000 2 3 1 5000 2 3 结论：
检验人： 日期： 复核人： 日期：
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样品 效价（u） 样品 效价（u） 理论效价（u） 测得效价（u） 回收率（%） RSD（%） 7.2.4重复性和中间精密度试验
取供试品溶液（批号 ），由两位检测人员按照效价测定方法，测定样品中蚓激酶的效价。每人检测6次记录检测结果。将各6组数据进行对比求出平均值，再求出重复性RSD值，将两人的检测结果进行对比求出12组数据的平均值，再求出中间精密度RSD值。 7.2.4.1可接受标准
重复性RSD≤5.0%，中间精密度RSD≤5.0%。 7.2.4.2验证实施记录及结论
表4 效价检测结果
次数 1 2 3 4 5 6 平均值（u） 重复性RSD值（%） 总平均值（u） 中间精密度RSD值（%） 结论：
检验人： 日期： 复核人： 日期： 7.2.5专属性试验
阴性对照溶液：水溶液10μl
对照品溶液：10000u/ml的蚓激酶溶液10μl
空白回收溶液：水溶液10μl+10000u/ml的蚓激酶溶液10μl 7.2.5.1可接受标准 阴性对照无干扰。 7.2.5.2结论
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检测结果1（u） 检测结果2（u）
检验人： 日期： 复核人： 日期： 7.2.6线性范围
取蚓激酶对照品加水, 制成每1ml含蚓激酶分别为10000, 8000, 5000u的对照品溶液。分别精密吸取上述10000u/ml对照品溶液9µl, 8µl,和上述8000u/ml对照品溶液9µl,8µl,以及上述5000u/ml对照品溶液10µl，8µl，6µl点样，测定溶圈直径，并计算出溶圈面积。以点样量( u )为横坐标, 溶圈面积（mm2）为纵坐标求得回归方程。 7.2.6.1 可接受标准
相关系数r≥0.980 7.2.6.2 验证实施记录及结论
表5 线性范围检验结果
点样量(u) 溶圈面积(mm2) 图1 点样量与溶圈面积关系的线性关系图
结论：
检验人： 日期： 复核人： 日期：
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1 2 3 4 5 6 7 8、偏差分析
在验证过程中，应严格按照验证方案进行操作和判定。 8.1指标全部符合标准，无偏差。
8.2当出现偏差时，应按偏差处理操作规程（SOP-ZL-00-009）进行处理：针对偏差应展开调查分析，对于确认是因操作不当等自身原因造成，应重新进行测试。 序号 1 2 3 偏差 处理办法 确认结果是否达到标准 是 否 检查人： 日 期： 9、验证结论
结论人： 日期： 10、再验证
10.1 当分析方法发生较大变更需要再验证； 10.2 在日常监测中发现分析方法异常需进行再验证；
10.3 再验证时应按照前期验证采用的方法对地龙冻干粉效价测定方法学进行再验证，或根据实际情况修订补充验证方案后进行再验证。
确认人： 日 期： 7 / 7
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