同时检测牛轮状病毒、冠状病毒和病毒性腹泻病毒的三重荧光定量PCR

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112760421 A(43)申请公布日 2021.05.07

(21)申请号 202110182882.8(22)申请日 2021.02.10

(71)申请人 北京三元集团畜牧兽医总站

地址 100020 北京市朝阳区洼里乡苍营村

南6号(72)发明人 陈华林　张丹　刘邓　

(74)专利代理机构 北京汇智英财专利代理事务

所(普通合伙) 11301

代理人 张玮玮(51)Int.Cl.

C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)

权利要求书2页 说明书15页

序列表2页 附图6页

(54)发明名称

同时检测牛轮状病毒、冠状病毒和病毒性腹泻病毒的三重荧光定量PCR试剂盒及应用方法(57)摘要

本发明提供了一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重荧光定量PCR试剂盒及应用，属于病毒检测技术领域，包括针对牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒的三组特异性引物和三个相应的探针。本发明用于检测三种病毒的引物和探针具有特异性强、反应效率高的优点；该三重实时荧光定量PCR试剂盒具有扩增效率高、特异性强、检测效果稳定，重复性好的特点，适用于奶牛腹泻致病原检测、定期监测，以及奶牛腹泻流行病学调查等；应用本发明的试剂盒在一个实时荧光定量PCR反应体系中能够同时检测三种奶牛腹泻致病原，节约了检测时间、降低了检测成本，且能同时检测多个样本，检测效率高。

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1.一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括针对牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒的三组特异性引物和三个相应的探针。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述针对牛轮状病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，对应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述针对牛冠状病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，对应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述针对牛病毒性腹泻病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，对应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述三个探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述荧光报告基团选自NED、FAM和JOE，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

5.根据权利要求1所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的反应体系包括荧光定量PCR反应液、逆转录酶、TaqDNA聚合酶、标准阳性RNA模板。

6.根据权利要求5所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述标准阳性RNA模板是采用T7体外转录试剂盒制备得到的牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒的标准RNA。

7.根据权利要求5所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述反应体系所需各物质的量为：12.5μL的荧光定量PCR反应液，1μL的逆转录酶，1.5μL的TaqDNA聚合酶，牛轮状病毒的特异性上游引物、特异性下游引物、特异性荧光探针各1μL，牛冠状病毒的特异性上游引物、特异性下游引物、特异性荧光探针各1μL，牛病毒性腹泻病毒的特异性上游引物、特异性下游引物、特异性荧光探针各1μL，阴性对照1μL，标准阳性RNA模板1μL。

8.一种权利要求1‑7任一项所述的同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒的应用方法，其特征在于：所述试剂盒用于奶牛腹泻致病原检测，牛场腹泻病原定期监测，以及奶牛腹泻流行病学调查；所述奶牛腹泻致病原为牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒这三种。

9.根据权利要求8所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒的应用方法，其特征在于：包括如下检测步骤：

S1选取待测样品，提取RNA备用；所述待测样品为牛的粪便或血液；S2取试剂盒，按照每个PCR扩增体系中加入1μL步骤S1得到的样品RNA进行扩增反应；PCR扩增反应条件为42℃ 30min，95℃预变性1min；95℃15s，53℃40s，40个循环；

S3记录检测结果，根据检测结果判断牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的有无及含量。

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10.根据权利要求9所述的一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒的应用方法，其特征在于：所述试剂盒RNA的检测范围为101‑109拷贝/μL。

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同时检测牛轮状病毒、冠状病毒和病毒性腹泻病毒的三重荧

光定量PCR试剂盒及应用方法

技术领域

[0001]本发明涉及一种牛腹泻病原体检测试剂盒，尤其涉及一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，属于病毒检测技术领域。背景技术

[0002]牛轮状病毒、冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒是引起牛病毒性腹泻的重要病原。随着我国奶牛养殖业规模化，集约化高度发展，牛腹泻，尤其是新生犊牛腹泻成为困扰奶牛养殖业的重要疾病之一，严重危害牛群健康并阻碍我国奶牛养殖业的发展。[0003]牛轮状病毒((Bovine Rotavirus,BRV)病是由轮状病毒引起的多种幼龄动物和婴幼儿的急性胃肠道传染病，以精神委顿、厌食、呕吐、腹泻、脱水为主要特征。本病病原为轮状病毒，病毒粒子呈圆形，似车轮状。病毒对外界因素的抵抗力较强，在粪便和不含抗体的乳汁中，经半年仍有感染性。患者及隐性感染者的粪便内含有大量的轮状病毒，并可经消化道传染给易感人畜。在人和各种动物间有一定交互感染作用，只要病毒在人或一种动物中持续存在，就有可能造成本病在自然界中长期传播。本病主要发生在犊牛，发病日龄主要为15～90天。春、秋两季发病较多。病毒存在于肠道，随粪便排出体外，经消化道感染。[0004]牛冠状病毒(Bovine coronavirus，BCV)是引起新生犊牛腹泻的一种重要的病原，还可引起牛的呼吸道感染和成年牛的冬季血痢。自从1973年美国Mebus等人首次报道该病原以来，随后证明BCV在世界范围内广泛分布，在许多国家和地区牛群中流行。1987年，国内有学者报道在我国牛群中也流行该病。BCV引起的犊牛腹泻仅次于轮状病毒，并且可导致人的腹泻。

[0005]牛病毒性腹泻性病毒((Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)，属于黄病毒科瘟病毒属，病牛的分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒，以直接接触或间接接触方式传播。

[0006]牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛腹泻性病毒是引起犊牛腹泻的重要病原，三种病毒引起的腹泻临床症状相似、发病急、易混合感染；实际生产中牧场因为病原不确定，无鉴别诊断或诊断不及时等因素，对犊牛腹泻不能采取对症治疗，致使犊牛腹泻发病率达70％，死亡率高达50％，给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。解决我国牧场犊牛腹泻防控困境的关键是快速有效的对症治疗和针对性预防措施的有效结合，因此建立针对牛轮状病毒、冠状病毒和牛腹泻性病毒的实验室快速鉴别诊断方法，特别是快速确定传染性病原方法，为牛场进行快速准确的对症治疗和精准采取预防性措施是当前紧迫需求。[0007]目前，分别检测牛轮状病毒、冠状病毒和牛腹泻性病毒的技术一般来说有三类，血清学诊断技术、生物学试验和分子生物学诊断技术。包括病毒分离、中和试验、电镜观察、ELISA、RT‑PCR、免疫荧光、荧光定量PCR等。[0008]血清学诊断技术包括补体结合试验、中和试验、免疫扩散、免疫电泳技术、免疫荧光、免疫电镜技术和ELISA。在这些技术中,ELISA方法用于高通量实验室检测，但是检测灵

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敏性低于荧光定量PCR，而且只能定性不能定量。其他检测方法，由于试验时间长、材料多、检测具有明显滞后性而且重复性差，多用于科研很少用于实际生产中检测。[0009]生物学试验包括病毒细胞培养和动物试验。这种检测方法敏感性低、成本高、周期长，主要用于科研特殊需要，基本不用于生产中病原检测。[0010]分子生物学诊断技术包括核酸杂交、聚丙烯酰胺凝胶电泳、RT‑PCR、nano‑PCR、荧光定量PCR等。其中核酸杂交和聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测技术操作复杂、成本高，不适用于临床检测。RT‑PCR、nano‑PCR、荧光定量PCR等检测技术特异性好、检测灵敏度好，可以针对组织、血液、粪便等样本进行检测；但是由于RT‑PCR和nano‑PCR不适用批量检测，在生产中应用还受；同时RT‑PCR方法检测后需要电泳检测，检测灵敏度低，在快速检测中逐步被实时荧光定量PCR取代。

[0011]荧光定量PCR方法是一种快速、准确、高通量病毒检测技术，近年来广泛应用于丙肝、艾滋病等病原的快速诊断；但是现有的针对牛轮状病毒、冠状病毒、或者牛病毒性腹泻病毒的检测方法都是单重荧光定量PCR检测，在实际生产应用中单重荧光定量PCR检测技术不能满足临床快速、准确、高通量对引起犊牛腹泻的多种病毒性病原鉴别诊断的需求。发明内容

[0012]针对上述问题，本发明提供一种能同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重荧光定量PCR试剂盒以及利用该试剂盒检测上述三种病毒的方法。[0013]为实现上述目的，本发明的技术方案内容为：[0014]一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，包括针对牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒的三组特异性引物和三个相应的探针。

[0015]进一步的，所述针对牛轮状病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，对应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述针对牛冠状病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，对应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述针对牛病毒性腹泻病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，对应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。[0016]进一步的，所述三个探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。

[0017]进一步的，所述荧光报告基团选自NED、FAM和JOE，所述荧光淬灭基团为BHQ1。[0018]进一步的，所述试剂盒的反应体系包括荧光定量PCR反应液、逆转录酶、TaqDNA聚合酶、标准阳性RNA模板。[0019]进一步的，所述标准阳性RNA模板是采用T7体外转录试剂盒制备得到的牛轮状病

牛病毒性腹泻病毒的标准RNA。毒、牛冠状病毒、

[0020]进一步的，所述反应体系所需各物质的量为：12.5μL的荧光定量PCR反应液，1μL的逆转录酶，1.5μL的TaqDNA聚合酶，牛轮状病毒的特异性上游引物、特异性下游引物、特异性荧光探针各1μL，牛冠状病毒的特异性上游引物、特异性下游引物、特异性荧光探针各1μL，牛病毒性腹泻病毒的特异性上游引物、特异性下游引物、特异性荧光探针各1μL，阴性对照1

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μL，标准阳性RNA模板1μL。

[0021]一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒的应用方法，所述试剂盒用于奶牛腹泻致病原检测，牛场腹泻病原定期监测，以及奶牛腹泻流行病学调查；所述奶牛腹泻致病原为牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒这三种。[0022]进一步的，包括如下检测步骤：[0023]S1选取待测样品，提取RNA备用；所述待测样品为牛的粪便或血液；[0024]S2取试剂盒，按照每个PCR扩增体系中加入1μL步骤S1得到的样品RNA进行扩增反应；PCR扩增反应条件为42℃30min，95℃预变性1min；95℃15s，53℃40s，40个循环；[0025]S3记录检测结果，根据检测结果判断牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的有无及含量。[0026]进一步的，所述试剂盒RNA的检测范围为101‑109拷贝/μL。[0027]本发明的有益效果为：

[0028]本发明是实时检测三种病毒轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病的三重荧光定量PCR方法，用于检测三种病毒的引物和探针具有特异性强、反应效率高的优点，荧光定量PCR反应条件具有扩增效率高、特异性强、检测效率稳定的优点，应用本发明的试剂盒在一个实时荧光PCR反应体系中能够同时检测三种奶牛腹泻致病原，节约了检测时间、降低了检测成本，且能同时检测多个样本，检测效率高。[0029]本发明的试剂盒以RNA为模板，采用一步法荧光定量PCR检测代替常规的两步法荧光定量PCR，因此简化了检测步骤、降低检测人员操作误差，同时实现高通量检测。附图说明

[0030]图1为本发明实施例1中三重FQ‑RT‑PCR标准曲线图；[0031]图2为对比例1中BCV退火温度电泳图；[0032]图3为对比例1中BCV扩增曲线图；

[0033]图4为对比例1中BVDV目的基因扩增电泳图(第一批引物)；[0034]图5为对比例1中BVDV目的基因扩增电泳图(第二批引物)；[0035]图6为对比例1中BVDV扩增曲线图；

[0036]图7为对比例1中BRV目的基因扩增电泳图(第一批引物)；[0037]图8为对比例1中BRV‑VP6‑1预实验扩增曲线；

[0038]图9为对比例1中BRV目的基因扩增电泳图(第一批引物)；[0039]图10为对比例1中BRV‑1、BRV‑2扩增曲线图；[0040]图11为对比例1中BVDV、BCV双重FQ‑RT‑PCR扩增曲线图；

[0041]图12为实施例1中三对引物与对比例1中三对引物的三重FQ‑RT‑PCR扩增曲线比对图。

具体实施方式

[0042]下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以

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采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的。[0043]一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，包括针对牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒的三组特异性引物和三个相应的探针。

[0044]其中，所述针对牛轮状病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，对应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述针对牛冠状病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，对应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述针对牛病毒性腹泻病毒的特异性引物上游核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，对应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。其中核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3分别是牛轮状病毒特异性上游引物序列BRV‑1(F)、牛轮状病毒特异性下游引物序列BRV‑1(R)和牛轮状病毒特异性荧光探针序列BRV‑1probe；其中核苷酸序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6分别是牛冠状病毒特异性上游引物序列BCV‑3(F)、牛冠状病毒特异性下游引物序列BCV‑3(R)和牛冠状病毒特异性荧光探针序列BCV‑3probe；其中核苷酸序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9分别是牛病毒性腹泻病毒特异性上游引物序列BVDV‑2(F)、牛病毒性腹泻病毒特异性下游引物序列BVDV‑2(R)和牛病毒性腹泻病毒特异性荧光探针序列BVDV‑2probe。[0045]上述三个探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团，优选的荧光报告基团选自NED、FAM和JOE，所述荧光淬灭基团为BHQ1。[0046]上述试剂盒的反应体系包括荧光定量PCR反应液、逆转录酶、TaqDNA聚合酶、标准阳性RNA模板；其中，所述标准阳性RNA模板是采用T7体外转录试剂盒制备得到的牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒的标准RNA。制备过程是选择牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒这三种病毒基因序列的特异性引物组合所在的序列位置设计合成T7体外转录用引物，再扩增目的基因，电泳后切胶纯化，连接到T载体并转化入感受态细胞，划板培养挑出阳性克隆并进行PCR验证；然后以阳性克隆为模板扩增T7体外转录用模板，利用T7体外转录试剂盒，制备出标准品RNA并纯化，测浓度和纯度，计算出拷贝数，然后10倍稀释作为标准品备用。

[0047]上述试剂盒的反应体系所需各物质的量为：12.5μL的荧光定量PCR反应液，1μL的逆转录酶，1.5μL的TaqDNA聚合酶，牛轮状病毒的特异性上游引物、特异性下游引物、特异性荧光探针各1μL，牛冠状病毒的特异性上游引物、特异性下游引物、特异性荧光探针各1μL，牛病毒性腹泻病毒的特异性上游引物、特异性下游引物、特异性荧光探针各1μL，阴性对照1μL，标准阳性RNA模板1μL。

[0048]一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒的应用方法，所述试剂盒用于奶牛腹泻致病原检测，牛场腹泻病原定期监测，以及奶牛腹泻流行病学调查；所述奶牛腹泻致病原为牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒这三种。

[0049]包括如下检测步骤：[0050]S1选取待测样品，提取RNA备用；所述待测样品为牛的粪便或血液；

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S2取试剂盒，按照每个PCR扩增体系中加入1μL步骤S1得到的样品RNA进行扩增反

应；PCR扩增反应条件为42℃30min，95℃预变性1min；95℃15s，53℃40s，40个循环；[0052]S3记录检测结果，根据检测结果判断牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的有无及含量。

[0053]本发明所述试剂盒RNA的检测范围为101‑109拷贝/μL。[0054]实施例1同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒组成及反应条件

[0055]一种同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重荧光定量PCR试剂盒，包括引物和探针、逆转录酶、标准阳性RNA模板、TaqDNA聚合酶、荧光定量PCR反应液；[0056](1)荧光定量PCR试剂盒各成分含量‑反应体系如表1。[0057]表1

[0058]

[0059][0060][0061]

 μL/反应PCR反应液12.5反转录酶1DNA聚合酶(5u/μL)1.5BRV‑1引物和探针3(包含上下游引物及探针)BVDV‑2引物和探针3(包含上下游引物及探针)BCV‑3引物和探针3(包含上下游引物及探针)待检样品1阴对照1阳对照(标准RNA模板)1合计25(2)引物和探针的序列如下表2。表2

引物名称BRV‑1(F)BRV‑1(R)BRV‑1probeBVDV‑2(F)BVDV‑2(R)BVDV‑2probeBCV‑3(F)BCV‑3(R)BCV‑3probe

引物探针序列

5'TTACATTTCATAGACCAAACA3'5'CACATGAATAGTCRAATCCA3'

5'(NED)CCGCATTGAGCCACATCG(BHQ1)3'5'TACGAATACAGCCTGATAG3'5'GTTTGTATGTTTTGTATAAAAGTTC3'5'AATTGCTAGTCTTGTTCTG 3'5'GCCACCAAAATTCTGATT 3'

N个反应

101010101010////体积(μL)1251015303030 ///

起始位点472615559309424300703025630100

长度(bp)144  116  187  5'(FAM)TTGYRATCAACTCCATGTGCCAT(BHQ1)3'397

5'(JOE)CAAGGATGCCACTAAGCCACA(BHQ1)3'

[0062]

(3)荧光定量PCR试剂盒反应条件具体如表3所示，三重荧光定量PCR反应设置在每

个循环的第二步结束进行荧光检测。[0063]表3

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(4)反应体系中需要提前制备的标准RNA模板的制备过程为：

[0066]上述的标准RNA模板的制备过程为：根据三重FQ‑RT‑PCR预实验结果，选择BVDV2、BRV1和BCV3此组合所在的序列位置设计合成T7体外转录用引物，扩增目的基因，电泳后切胶纯化，连接到T载体并转化入感受态细胞，划板培养挑出阳性克隆并PCR验证。以阳性克隆为模板大量扩增T7体外转录用模板，利用T7体外转录试剂盒，制备出标准品RNA并纯化，测其浓度(利用分光光度计测定OD260/280的值)和纯度(见表4)，并计算出其拷贝数，然后10倍稀释作为标准品备用。[0067]表4

[0065]

标准品OD260/280浓度(微克/毫升)拷贝数(拷贝/微升)BVDV‑T7‑21.8216302.28×1012

12BRV‑T7‑11.878559.62.55×10BCV‑T7‑32.086860.63.65×1012

[0069](5)三重FQ‑RT‑PCR标准曲线的建立，具体为：[0070]以10倍稀释的RNA标准品(取104、105、106、107、108和109拷贝/微升6个稀释度)为模板进行扩增，同时设置阴性对照，得到扩增曲线，软件分析其相关系数R2分别为：0.992(BEDV)、0.996(BRV)、0.994(BCV)，具有很好的线性关系，符合标准曲线的要求(R2>0.99)，建立的标准曲线如图1所示。[0071](6)三重FQ‑RT‑PCR敏感性实验与阈值，具体为：[0072]把制备的RNA标准品进行10倍稀释，以100‑108拷贝/微升的RNA为模板同时设置阴阳性对照进行FQ‑RT‑PCR，得出动力学曲线，当模板为101拷贝/μL时，其CT值仍在可检测范

1

μl的RNA样本(BVDV‑T7‑围内(352、BRV‑T7‑1、BCV‑T7‑3)。当样本检测Ct值>40时，样本目的RNA含量<101拷贝/μL，在定性检测中判定样本为阴性；当样本检测35102拷贝/μL，在定性检测中判定样本为阳性。[0073]表5样本浓度与CT值对应表

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[0074]

实施例2荧光定量试剂盒重复性和稳定性检测

[0076]本实施例为检测实施例1中的同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重荧光定量PCR试剂盒的稳定性和重复性。以已知模板浓度的RNA标准品为模板，设置2个浓度梯度PI和P2，同时设置阴性对照，进行批内及批间重复性实验。方法是：选取2019年6、9和11月份三个批次的引物和探针，命名为2019‑Ⅰ、2019‑Ⅱ和2019‑Ⅲ，每批试剂对2个不同浓度的模板检测3次，同一次实验同一试剂同一个模板浓度设置7个重复，所获得CT值利用数据分析得出其批内以及批间误差。原则上来说只有同一样品批内、批间CT值变异系数CV≤10％时，从统计意义上说变异系数在此范围内数据可信。[0077]表6三批试剂批内、批间重复性实验结果

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由表6可知，三批试剂对2个稀释度的样品进行重复性检测，同一批次试剂、同次检

测结果的CV值最大值为2.60％，满足CV≤10％的条件，说明所建立的方法同批试剂同时检测具有很好的重复性。

[0081]表7同一批次试剂批内重复试验结果

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由表7可知，同一批号试剂、三次检测结果之间的C.V值最大为2.93％，满足CV≤

10％的条件，说明该方法：同批试剂不同次检测同样具有很好的重复性。[0085]表8不同批次试剂批间重复试验结果

[0086]

由表8知，3批试剂、3次检测结果的CV值最大为2.76％，满足CV≤10％的条件，说明

该方法：不同批次试剂不同次检测仍具有很好的重复性。[0088]实施例3同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒在检测犊牛腹泻样本中的应用

[00]本实施例为将实施例1中的同时检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒的三重荧光定量PCR试剂盒用于牛场犊牛腹泻样本病原体检测。具体的检测过程及结果如下：[0090](1)提取和纯化样本RNA。100微升腹泻样本用磁珠法提取RNA，溶于50微升无核酸酶水中。[0091](2)按照表9准备反应体系。

[0092]表9临床腹泻样本检测荧光定量PCR反应体系

[0087]

[0093]

(3)荧光定量PCR试剂盒反应条件设置如下表所示，三重荧光定量PCR反应设置在

每个循环的第二步结束进行荧光检测。[0095]表10试剂盒荧光定量PCR反应条件

[0094]

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[0096]

(4)临床腹泻样本检测结果

[0098]用建立的牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒三重实时荧光定量PCR试剂盒对3个牧场犊牛腹泻31个样本检测。阳性对照3个重复和阴性对照3个重复均成立，31个腹泻样本，检测出轮状病毒阳性16个，冠状病毒阳性21个，BVDV阳性1个；其中轮状病毒和冠[0097]

状病毒双阳性样本13个。

[0099]表11犊牛腹泻样本检测结果

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[0100]

[0101]

对比例1

[0103]对比例1是将本发明研究过程中设计的其他针对牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒的特异性引物和及探针进行如实施例1相似的研究试验，具体试验过程如下：[0104]1‑1BCV引物探针合成及退火温度优化[0105]利用Beacon Designer 7软件在BCV N基因保守区设计了三对引物和探针，以BCV病毒全基因为模板进行温度梯度RT‑PCR，最终确定其最优退火温度为53℃、54℃、55℃，其电泳图谱如图2(其中M为500bp，1‑7分别为53℃‑59℃)所示，符合要求的引物探针见表12。[0106]表12

[0102]

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[0107]

使用上述引物和探针进行一步法FQ‑RT‑PCR预实验，扩增曲线均较为理想，如图3

(其中1‑3分别为BCV1、BCV2、BCV3)所示。

[0109]1‑2BVDV引物探针的设计与合成以及反应条件优化[0110]利用Beacon Designer 7软件在BVDV保守区5’‑UTR设计引物和探针，由于第一批两对引物均未扩增出目的基因(见图4，其中M为500bp，1‑6分别为53℃‑58℃)，又重新设计合成了第二批两对引物和探针，其碱基变异区用通用碱基进行代替，合成后进行温度梯度RT‑PCR扩增，电泳结果如图5(其中M为500bp，1‑6分别为49℃‑54℃)所示，其退火温度在50℃、51℃、52℃、53℃、54℃时均理想，继而进行了FQ‑RT‑PCR预实验，扩增曲线均较为理想(如图6)，符合要求的引物探针见表13。[0111]表13

[0108]

[0112]

1‑3BRV引物探针的设计与合成以及反应条件优化

[0114]利用Beacon Designer 7软件在BRV相对保守区VP6和VP7基因设计引物和探针。第一批总共设计合成了三组引物和探针，在进行温度梯度PCR时只有BRV‑VP6‑1有目的基因扩增出(如图7，其中M为500bp，1‑6分别为53℃‑58℃)，但是此组引物探针在进行FQ‑RT‑PCR时无扩增曲线(如图8)，电泳时有目的基因，因此这三组引物探针均弃用。第二批在VP6基因上设计合成了两组引物探针，变异碱基采用兼并碱基代替(见表14)，进行温度梯度PCR，电泳结果显示两组引物退火温度在52℃、53℃、54℃、55℃时较为理想(如图9，其中M为500bp，1‑6分别为50℃‑55℃)，结合BVDV及BCV退火温度，以53℃为退火温度进行FQ‑RT‑PCR预实验，其扩增曲线如图10所示。[0115]表14

[0113]

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[0116]

[0117][0118]

1‑4BVDV和BCV双重FQ‑RT‑PCR预实验

[0119]BCV三组引物探针同BVDV两组引物探针互相配对进行双重FQ‑RT‑PCR，预实验结果显示BCV‑1、BCV‑3分别同BVDV‑1、BVDV‑2组合扩增曲线较为理想(如图11)。[0120]1‑5实施例1中三对引物与本对比例选定的三对引物(BRV‑2、BCV‑2和BVDV‑1)进行三重FQ‑RT‑PCR扩增，其扩增曲线如图12所示，上述引物均是对应病毒的特异性引物，但三重FQ‑RT‑PCR扩增曲线却存在明显的差异。

[0121]1‑6用实施例1中的引物探针和对比例1中的引物探针(具体为BRV‑2、BCV‑2和BVDV‑1三对引物)分别检测临床犊牛腹泻8份样品，同时设置阳性对照(已知病毒)和阴性对照。

[0122]检测结果如下表15所示[0123]表15

[0124]

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[0125]

由表15可知，通过对8份样品分别用第一组引物和探针、第二组引物和探针进行检

测，结果(1)第一组3对引物和探针组合扩增效率明显高于第二组的3对引物和探针组合(第一组三对引物和探针检测平均CT值小于第二组28.02<30.32，30.10<30.95，35.52<36.32)。(2)对于临界值样本(例如，样品7号)由于两组引物和探针组合检测灵敏度差异，检测结果不同。第二组引物和探针组合检测判定7号样品为BRV可疑，BCV和BVDV阴性；而第一组引物和探针组合检测判定为BRV阳性，BCV和BVDV阴性。所以综合以上两点，本发明选定的第一组引物和探针组合具有较高的检测灵敏度，能保证检测结果的准确性。[0127]显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0126]

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序　列　表

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序列表<110> 北京三元集团畜牧兽医总站<120> 同时检测牛轮状病毒、冠状病毒和病毒性腹泻病毒的三重荧光定量PCR试剂盒及应用方法

<160> 9<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 21<212> DNA<213> BRV‑1（F）<400> 1<210> 2<211> 20<212> DNA<213> BRV‑1（R ）<400> 2<210> 3<211> 18<212> DNA<213> BRV‑1 probe<400> 3<210> 4<211> 19<212> DNA<213> BCV‑3（F）<400> 4<210> 5<211> 18<212> DNA<213> BCV‑3（R）<400> 5<210> 6<211> 21<212> DNA<213> BCV‑3 probe<400> 6<210> 7<211> 21

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<212> DNA<213> BVDV‑2（F）<400> 7<210> 8<211> 25<212> DNA<213> BVDV‑2（R）<400> 8<210> 9<211> 23<212> DNA<213> BVDV‑2 probe

<400>

 9序　列　表

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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图3

图4

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图5

图6

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图7

图8

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图9

图10

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图11

图12

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