２０１１第６期 养猪ＳＷＩＮＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ 应用套式ＲＴ—ＰＣＲ检测猪瘟制品中 牛病毒性腹泻病毒污染的研究 祖立闯 ，魏凤 ，苗立中 ，沈志强 ， （１．山东绿都生物科技有限公司，山东滨州２５６６００；２．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州２５６６０Ｃ） 中图分类号：￥８５８．２８２．６５ ｌ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１９５７（２０１１）０６一Ｏ０９７—０４ 摘 要：为建立猪瘟制品中牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）污染的诊断方法，本研究根据ＧｅｎＢａｎｋ公布 的ＢＶＤＶ全基因组序列，选择ＢＶＤＶ保守性比较高的５ 非编码区，利用Ｏｌｉｇｃ６．０软件设计了２对特 异性引物，建立了检测ＢＶＤＶ的套式ＲＴ－ＰＣＲ方法。该方法极大提高了常规ＲＴ－ＦＣＲ检测方法的特 异性和敏感性，重复性好、特异性强、敏感性高，可以准确快速检测出极低含量的ＢＶＤＶ，为动物与疫 苗生物制品原辅料中ＢＶＤＶ的快速低含量检测提供了一种简单、特异、敏感、快速的检测方法。 关键词：猪瘟；牛病毒性腹泻病毒；ＲＴ－．－ＰＣＲ；检测 Ｒｅｓｅａｒｃｈ ０ｆ ａ ｎｅｓｔ ＲＴ—ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏ ｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ０ｆ ｂｏｖｉｎｅ ｔ ａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ＺＵ Ｌｉｃｈｕａｎｇ ，ＷＥＩ Ｆｅｎｇ２，ＭＩＡＯ Ｌｉｚｈｏｎｇ１，ＳＨＥＮ Ｚｈｉｑｉａｎｇ ＇ （１．Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｌｖｄｕ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｌｄ．，Ｂｉｎｚｈｏｕ ２５６６００．，Ｃｈｉｎａ； ２＿Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｂｉｎｚｈｏｕ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｃａｄｅｍｙ，，Ｂｉｎｚｈｏｕ ２５６６００。Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｄ Ｅｌｌ Ｇ，ｅｎＢａｎｋ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ＢＶＤＶ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．，ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｔｈｅ ＢＶＤＶ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｑｕｉｔｅ ｈｉｇｈ ５ ｎｏｎ—ｃｏｄｅ ａｒｅａ．，ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｕｓｉｎｇ Ｏｌｉｇｏ６．０ ｂｉｏｌｏｇｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ．ａ ｎｅｓｔ ＲＴ—ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｅｓｔ ａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｈａ ｓ ｇｏｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｉｃｉｆｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｍ ａｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｌｏｗ ｃｏｎｔｅｎｔ ＢＶＤＶ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ａｎｄ ｒａｐｉｄｌｙ，．ｗｈｉｃｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＲＴ—ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｓｐｅｃｉｆｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｎｏｒｍｏｕｓｌｙ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｉｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｎｅｓｔ ＲＴ—ＰＣＲ ｍｅｔｈＬｏｄｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ．ｑｕｉｃｋｌｙ。ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌｓ．ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆａ：Ｌｓｔ ｌｏｗ一．１ｅｖｅｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＢＶＤＶ． Ｋｅｖ ｗ０ｒｄｓ：ｃｌａｓｓｉｃａ１ ｓｗｉｎｅ ｒｅ，ｖｅｒ ｖｉｒｕｓ；ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａ１ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ；ＲＴ．一ＰＣＲ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 牛病毒性腹泻（Ｂ０ｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａ￣ｒｒｈｅａ，ＢＶＤ）又称 黏膜病（Ｍｕｃｃ，ｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ，ＭＤ），是由牛病毒性腹泻病 毒（Ｂ０ｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｉａｒｄｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ，ＢＶＤＶ）引起的以牛发 热、黏膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母 牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病ｒ１１。 牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）又称黏膜病病毒（Ｍｕ— ｃｏｓａｌ ｉｓｅａｓｄｅ ｖｉｒｕｓ，ＭＤｒ），与猪瘟病毒（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｒｅ＇￣ｖｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＣＳＦＶ）、绵羊边界病病毒（ｂｏｒｄｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ，ＢＤＶ）同属于黄病毒科（ＦＬａｖｉｖｉｒ＇ｉｄａｅ）瘟病毒属 （Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ），是黄病毒科瘟病毒属的代表种，与猪瘟 病毒和绵羊边界病病毒在血清学上有交叉反应㈣。 ＢＶＤＶ各毒株间存在明显的基因多型性、抗原多变 收稿日期：２０１１—１０—１７ 基金项目：山东省自主创新成果转ｎ锺大专项计划（２ｏ０８ｚＨＺＸ１Ａ１１０３） 作者简介：祖立闯（１９８１一），男，黑龙江宾县人，助理研究员，硕士，主 要从事动物生物制品学研究．Ｅ一－ｍａｉｌ：ｚｕｌｉｃｈｕａｎｇ２００８＠１２６．．ＣＯｌ［Ｉｌ 通讯作者：沈志强，研究员，博士，研究方向为预防兽医学与生物 制品学．Ｅ．－ｍａｉｌ＇ｂｚｓｈｅｎｚｑ＠１６３．ｃ０ｍ 性和生物学特性差异，根据抗原性的不同和５ 端非 翻译区核酸序列不同，ＢＶＤＶ可分为基因Ｉ型和基 因Ⅱ型。国内流行的ＢＶＤＶ毒株主要为ＢＶＤＶ Ｉ 型，近年来也有分离到ＢＶＤＶⅡ型的报道 。 该病是牛的主要疾病之一，呈世界范围流行，给 养牛业造成重大的经济损失。同时，也给猪瘟疫苗 的正常生产带来干扰。据报道，猪瘟疫苗中污染 ＢＶＤＶ后，猪瘟疫苗有效免疫原量减少，致使临床使 用后发生猪瘟免疫失败。同时，ＢＶＤＶ可引起猪只发 生类似猪瘟的疫病，导致疫苗接种猪发病，因此，研 制用于猪瘟疫苗生产中半成品和成品ＢＶＤＶ污染 检测的新技术具有重大经济价值和社会意义。目前， ＢＶＤＶ的检测技术主要有琼脂扩散试验、病毒分离 技术、病毒中和试验（ＶＮＴ）、免疫荧光技术（ＩＦＡ）、免 疫过氧化物酶ｑＰ）技术、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ） 等＿６ 目，这些检测方法存在试验周期长、检出率低等 缺点。本研究的目的就是建立一种特异性强、敏感 ９８ 养猪ＳＷＩＮＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ（６） ２０１１ 性高、快速、简便的检测ＢＶＤＶ病原的方法，为猪瘟 疫苗生产用的种毒及原辅料的快速ＢＶＤＶ检测提 供一种有效、快速的检测方法。 １材料和方法 １．１病毒与细胞 ＢＶＤＶ ＢＡ株病毒、牛传染性鼻气管炎病毒 Ｒｖ）、 猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）、猪伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）、猪繁殖 与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）均由山东滨州预防兽 医学与动物生物技术重点开放实验室保存。牛肾细 胞ＭＤＢＫ由山东滨州预防兽医学与动物生物技术 重点开放实验室保存。 １．２主要试剂 度分别取５０℃、５３℃、５５ ｃｃ、５７℃、６０℃，对扩增产 物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳退火温度。 １．５．３ ＰＣＲ扩增反应 （１）第１轮ＰＣＲ扩增反应。ＰＣＲ反应按５０ Ｌ 体系进行，根据上述试验确定的最适模板用量为１０ Ｌ， 最适引物浓度为０．５“Ｌ（２０ ｐＩＴＩＯ１／ Ｌ），最适退火温 度为５７ ｏ【＝，确定ＰＣＲ反应体系为：０．５ ＬＬＬ Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／ＩｘＬ）、５ ＬＬＬ １０ ｘＥｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、５ ＩｘＬ ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）、上下游引物Ｐ１和Ｐ２（２０ ｐｍｏｌ／ｔｘＬ）各０．５ Ｍ—ＭＬＶ反转录酶、Ｒｉｂ０ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｅｘ Ｔａｕ酶．ｐＭＤ１８一Ｔ克隆载体及其它性内切酶均 购自宝生物工程（大连）有限公司；Ｔｒｉｚｏｌ、质粒ＤＮＡ 提取试剂盒与胶回收试剂盒购自生工生物工程（上 海）有限公司。 １．３引物设计与合成 根据已发表的ＢＶＤＶ标准毒株ＮＡＤＬ、Ｏｓｌｏｓｓ等 毒株的全序列，选择ＢＶＤＶ保守性比较强的５ 非编码 １．６扩增产物的检测及鉴定 首先取扩增产物５ ＬＬＬ在１％的琼脂糖凝胶上电 区域，利用计算机辅助软件设计两对特异性引物，由生 工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列如下。第 泳，利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。然后用 １轮扩增上游引物Ｐｈ ５＂－ＧＣＡＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＴＡＧＣ ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段与 ＡＡ－３ 下游引物Ｐ２：５￣ＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡ－３ ； ＤＭＤ１ ８－Ｔ克隆载体于４℃过夜连接，转化感受态菌 第２轮扩增上游引物Ｐ３：５，＿ＡＴＴｃＧＴＣＡＣＴＧＧ，］盯ＣＧＡ 株ＤＨ５ｏｌ。挑取单个的转化菌落，加ＬＢ溶液培养１２ ｈ Ｃ－３ —１：游弓Ｉ物Ｐ４：５＂－ＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡ－３ 。 后用质粒提取试剂盒抽提质粒ＤＮＡ，利用ＥｃｏＲＩ／ 日 ｎｄⅢ双酶切鉴定，阳性的克隆送上海生工生物工 １．４病毒基因组ＲＮＡ的提取 将ＢＶＤＶ接种六孔板培养的ＭＤＢＫ单层细胞， 程技术服务有限公司进行测序鉴定，将测序结果与 设空白对照。待细胞出现典型的空泡病变后，收获 ＢＶＤＶ毒株序列进行同源性比较。 病毒，按Ｔｒｉｚｏｌ试剂说明提取病毒基因组和对照细 １．７ ＰＣＲ特异性试验 胞的ＲＮＡ。 分别提取牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）、猪瘟病毒 １．５ ＲＴ—ＰＣＲ反应 （ＣＳＦＶ）、猪蓝耳病病毒（ＰＲＲＳＶ）、ＭＤＢＫ正常细胞 ＩＢＲＶ）、猪伪狂犬 １．５．１ 反转录合成ｃＤＮＡ取提取的ＲＮＡ １０ Ｌ， 的ＲＮＡ、牛传染性鼻气管炎病毒（加入ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｄＨ２０ ０．５ ｔｘＬ，下游引物Ｐ２ ５ ＬＬＬ，５× 病病毒（ＰＲＶ）ＤＮＡ，用已建立的方法进行扩增。 Ｍ—ＭＬＶ Ｂｕｆｆｅｒ ４ ｂＬＬ，Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５ ＩｘＬ， Ｌ、１０ ＩＬＬ ｃＤＮＡ，加水至５０ ＩｘＬ。ＰＣＲ反应条件为： ９３℃３ ｍｉｎ：９４ ｃＣ ４５ ｓ，５７ ｃｃ ４５ ｓ，７２℃１ ｍｉｎ，３０个 循环；７２℃１０ ｍｉｎ。 （２）第２轮ＰＣＲ扩增反应。ＰＣＲ反应按５０ Ｌ体 系进行，模板为第１轮ＰＣＲ产物１ Ｌ，最适引物浓度 为０．５ Ｌ（２０ ｐｍ０１／ｔＬＬ），最适退火温度为５７ ｃＩ＝，确定 ＰＣＲ反应体系为：０．５ ＩｘＬ Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／ｔ￣Ｌ）、５ Ｌ ｌＯｘＥｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ．５ ｔｘＬ ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｉ）、上下游引物Ｐ３和 Ｐ４（２０ ｐｍｏＹ￣Ｄ各０．５ Ｌ，加水至５Ｏ Ｌ。ＰＣＲ反应条 件同前。 １．８ ＰＣＲ敏感性试验 ２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ １ Ｌ，Ｍ—ＭＬＶ反转录酶１ Ｌ，补 水至２５ ＬＬＬ，３７℃作用２０ ｍｉｎ后，９５℃灭活５ ｒａｉｎ。 １．５．２ ＰＣＲ反应条件的优化 （１）最适模板用量的确立。分别以反转录ｃＤＮＡ ２ Ｌ、４ Ｌ、６ ｔｔＬ、８ Ｌ、１０ Ｌ、１２ Ｌ为模板，保持 其它试剂浓度及反应条件不变，对扩增产物进行琼 脂糖凝胶电泳观察，确定最佳模板浓度。 （２）最适引物浓度的确立。在５０ Ｌ ＰＣＲ反应 体系中分别加入不同浓度引物，上下游引物（２０ ｐｍ０１／ｔｘＤ浓度分别为０．１ ｔｘＬ、０－３ Ｌ、０．５ ＩｘＬ、０．７ ＩｘＬ、 １ Ｌ、１．２ Ｌ，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观 察，确定最佳引物浓度。 （３）最适退火温度的确立。ＰＣＲ反应的退火温 将ＢＶＤＶ的细胞培养物提取ＲＮＡ后定量，然后 １０倍梯度稀释提取的病毒基因组ＲＮＡ，使其分别相 当于含有１ ｇ ＲＮＡ、０．１ Ｉｘｇ ＲＮＡ、１０ Ｐｇ ＲＮＡ、１ Ｐｇ ＲＮＡ、０．１ Ｐｇ ＲＮＡ、０．０１ Ｐｇ ＲＮＡ的含量，分别进行 ＲＴ～ＰＣＲ检测，确定其敏感性。在第２轮ＰＣＲ中，利 用上面不同的病毒ＲＮＡ浓度进行的ＲＴ—ＰＣＲ产物 １ ＬＬＬ为模板，进行套式ＰＣＲ检测，反应程序不变， 确定套式ＲＴ—ＰＣＲ的敏感性。 １．９ ＰＣＲ重复性试验 用建立的ＲＴ—ＰＣＲ检测方法，对牛病毒性腹 泻病毒、猪瘟病毒、ＭＤＢＫ正常细胞以及５份阳 性样品重复检测３次，以验证本方法的重复性和 稳定性。 １００ 养猪ＳＷＩＮＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ（６） ２０１１ 细胞培养物（５份阳性），４份犊牛睾丸细胞（０份阳 性），５份含牛血清的猪瘟细胞疫苗（４份阳性），１２ 份猪瘟兔脾淋苗（０份阳性），８份猪瘟疑似病料（３份 阳性），共计５１份样品，检出阳性样品２２份，对所有 阳性样品均进行测序鉴定都是ＢＶＤＶ Ｉ型（表１）。 表１应用ＢＶＤＶ套式ＲＴ—ＰＣＲ检测方法检测样品结果 样品名称 样本数／份阳性数佑｝阴性数 份阳性样品基因型 步研究。在猪瘟疑似病料中检测到ＢＶＤＶ是自然感 染还是猪瘟细胞疫苗污染？也有待进一步探讨。 该检测方法的初步应用显示出了很好的敏感性 与特异性，在５１份样品的检测过程中，利用第１轮 ＲＴ—ＰＣＲ检测出阳性样品ｌ１份，而利用套式ＲＴ— ＰＣＲ检测时可以检出阳性样品２２份，对所有阳性 样品均进行测序鉴定都是ＢＶＤＶ Ｉ型，说明建立的 ３讨论 近年来牛病毒性腹泻病毒的检测技术，特别是 大规模群体的检测及分子生物学诊断技术取得了显 著的成效。目前，用于ＢＶＤＶ的诊断方法有琼脂扩 散试验、病毒分离技术、病毒中和试验（ＶＮＴ）、免疫 荧光技术（ＩＦＡ）、免疫过氧化物酶（ＩＰ）技术、酶联免 疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、ＲＴ—ＰＣＲ、核酸探针等＿９ｌ１０］。其中 ＥＬＩＳＡ方法和ＲＴ—ＰＣＲ能检测大批样品，具有特异、 敏感、快速等特点，在控制和根除ＢＶＤＶ方面发挥 着越来越重要的作用。ＲＴ—ＰＣＲ技术具有敏感性高、 特异性强、快速高效等特点，且该方法不同于血清中 和试验、琼脂扩散试验、ＥＬＩＳＡ等方法，能够检测处 于免疫耐受状态机体中的ＢＶＤＶ，并且可以与猪瘟 病毒和绵羊边界病病毒区分，为ＢＶＤＶ的检测提供 了一种科学方法【ｌｌ，１２１。ＲＴ－ＰＣＲ的应用缩短了ＢＶＤ 的诊断时间，比标准的病毒分离技术所需时间明显 减少，可用于快速检测细胞培养物、生物制品和临床 样品中的各种ＢＶＤＶ毒株【・ 。本研究在常规ＲＴ—ＰＣＲ 的基础上，根据ＢＶＤＶ ５ 端非编码区设计两对引 物，建立了检测ＢＶＤＶ的套式ＲＴ—ＰＣＲ方法，可以 高度特异、快速、敏感地检测出器官、组织、培养细胞 中的ＢＶＤＶ，为ＢＶＤＶ的检疫、诊断、流行病学调查 及猪瘟疫苗制品中ＢＶＤＶ污染的检测提供了一种 更加特异、敏感的方法。 在本方法的临床应用中，将所有阳性样品的 ＲＴ—ＰＣＲ产物进行测序后，序列分析结果显示，检测 结果为ＢＶＤＶ核酸物质阳性的样品均使用了个别 厂商的牛血清，而对所使用的牛血清样品进行检测 也均为ＢＶＤＶ核酸物质阳性，两者的测序结果一 致，而未使用牛血清培养的１２份猪瘟兔脾淋组织为 ＢＶＤＶ核酸物质阴性，说明标准的猪瘟兔脾淋疫苗 中不含ＢＶＤＶ，细胞培养的生物制品中ＢＶＤＶ核酸 物质污染基本上都是由于使用了含有ＢＶＤＶ核酸 物质的牛血清引起的，至于所检测到的ＢＶＤＶ核酸 物质对猪瘟细胞疫苗生产中猪瘟病毒增殖有何影 响？对猪瘟疫苗的安全与效力有何影响？均有待进一 套式ＲＴ—ＰＣＲ检测方法更为敏感、特异，可以用于 ＢＶＤＶ的快速低含量检测。此法必将在猪瘟细胞疫 苗与其他细胞疫苗生产用原辅料筛选中得到广泛应 用。从测序结果中进一步说明了国内牛源的ＢＶＤＶ 主要为ＢＶＤＶ Ｉ型，因该病在牛群中的潜伏感染， 导致国产牛血清中普遍带毒，造成了许多细胞培养 的生物制品的ＢＶＤＶ污染问题，因此应该提高国产 牛血清的质量标准，国产牛血清中不得含有ＢＶＤＶ。 参考文献： ．［１】殷震，刘景华．动物病毒学［Ｍ】．第２版．北京：科学出版社，１９９７： ６４５－６５２． ［２］ Ｃｏｌｌｅｔｔ Ｍ Ｓ，Ｌａｒｓｏｎ Ｒ，Ｇｏｌｄ Ｃ，ｅｔ ａｉ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｎｕ— ｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ［Ｊ】．Ｖｉｒｏｌ，１９８８，１６５（１）：１９１—１９９． ［３］李庆超，苗利光．牛病毒性腹泻病毒研究进展ＩＪＪ．动物医学进 展，２００９，３０（５）：６８—７２． 【４】Ｚｈｕ Ｌ Ｑ，Ｒｅｎ Ｍ，Ｌｉｎ Ｙ Ｑ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒ－ ｒｈｅａ ｖｉｕｒｓ ２ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃａｔｔｌｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ．Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ， ２００９，５３ｆ２１：１３１－１３４． ［５］Ｚｈｕ Ｌ Ｑ，Ｌｉｎ Ｙ Ｑ，Ｄｉｎｇ Ｘ Ｙ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃ－ ｔｅｆｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｕｒｓ ２ ［ＪＪ＿Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ，２００９，５３（３）：１９７－２０２． 【６］ ＭｃＣｌｕｒｋｉｎ Ａ Ｗ，Ｌｉｔｔｌｅｌｉｋｅ Ｅ Ｔ，Ｃｕｔｌｉｐ Ｒ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｉｍｍｕｎｏｔｏｌｅｒａｎｔ ｔｏ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｌ ＪＩ．Ｃａｎ Ｊ Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ，１９８４，４８（２）：１５６－１６１． 『７］李佑民．牛病毒腹泻，粘膜病病毒株（长春１８４株）的分离与鉴 定 ．兽医大学学报，１９８３，３：１１３—１２０． ［８］钟发刚，程安春，王新华，等．牛病毒性腹泻病毒单克隆抗 体捕获ＥＬＩＳＡ方法的建立Ⅲ．中国兽医学报，２００８，２８（９）： １００４－１００７． ｆ９１张宁，秦建华，赵博伟，等．牛病毒性腹泻一黏膜病诊断方法研 究进展 动物医学进展，２００８，２９（２）：９３—９７． Ｉ１０１邓宇，王新华，郭燕，等．牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ＥＬＩＳＡ 检测方法的标准化研究『Ｊ１．中国预防兽医学报，２００７，２９（７）： ５４１－５４４． ［１ １】Ｋｏｚａｓａ Ｔ，Ｔａｊｉｍａ Ｍ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒｌａ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｎ ｄａｉｒｙ ｆａｒｍｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｕｌｋ ｔａｎｋ ｍｉｌｋ ｔｅｓｔ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ ｆＪ］．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００５．１０６：４１—４７． ［１２］Ｈｅｒｔｉｇ Ｃ．Ｄｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｕｒｓ（ＢＶＤＶ）ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９１，２６：６５—６７． ［１３］Ｕｒｕｎｏ Ｋ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｕｒｓ（ＢＶＤＶ）ｕｓｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ［ＪＪ．Ｊ Ｖ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，１９９８，６０（７）：８６０．８７０． （编辑：富春妮）
