动物医学进展。２０１０，３１（３）：２１—２５ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 伪狂犬病病毒实时荧光ＰＣＲ的建立和应用 吕建强 ，何云蔚 ，卢体康 ，花群义 ，秦智锋 ，陶 虹 ，杨俊兴 ，阮周曦 （１．深圳出入境检验检疫局深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室，广东深圳５１８０１０； ２．创世纪转基因技术有限公司，广东深圳５１８０４８） 摘 要：伪狂犬病是世界范围内严重影响养猪业发展的重要动物疫病，快速检测是有效防控该病的重要 措施之一。为了建立该病的快速分子生物学检测方法，根据ＧｅｎＢａｎｋ中登录的伪狂犬病病毒ｇＤ基因序列， 选择高度保守区域设计引物和ＴａｑＭａｎ荧光探针，通过对实时荧光ＰＣＲ反应条件进行优化，建立了用于检 测伪狂犬病病毒的实时荧光ＰＣＲ方法。特异性试验结果表明，该检测方法只能检测到目的病毒，表明其具 有良好的特异性。灵敏性试验发现，其最低检测限可达１．４２ Ｐｇ／ＦＬ的总ＤＮＡ，与ＰＣＲ方法的灵敏度对比 试验表明，其敏感度比ＰＣＲ至少高１０倍。对同一样品进行重复性检测，在组内及组间检测的荧光扩增曲线 基本重叠，证实其重复性好。对１８０份临床样品进行伪狂犬病病毒核酸检测，结果发现有５２份阳性样品。 结果表明，所建立的实时荧光ＰＣＲ方法可对伪狂犬病病毒进行准确、快速的检测，具有特异性好、灵敏度高、 重复性好的优点，是开展伪狂犬病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。 关键词：伪狂犬病病毒；实时荧光ＰＣＲ；检测 中图分类号：￥８５２．６５９．１；￥８５４．４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１０）０３—００２１—０５ 伪狂犬病病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）属于 本研究采用ＴａｑＭａｎ荧光探针技术，建立检测ＰＲＶ 的实时荧光ＰＣＲ方法，其特异性更强，敏感性至少 比普通ＰＣＲ高１Ｏ倍，检测周期更短、重复性好，可 以应用于临床检测。 疱疹病毒科ａ疱疹病毒亚科，可以感染多种家畜和 野生动物，除猪以外的动物发病通常具有发热、奇痒 及脑脊髓炎等典型症状，均为致死性感染。猪是 ＰＲＶ的天然宿主、贮存者和传播源，其感染后主要 表现为母猪发生繁殖障碍，仔猪大量死亡，公猪感染 后失去种用能力，成年猪感染则表现为增重缓 慢 ］。 １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 病毒和细胞 ２株伪狂犬病病毒ＧＤ０４０２、 ＧＤ０６０３均由广东某养殖场病猪中分离获得，由深 圳出入境检验检疫局深圳市外来有害生物检测技术 研究重点实验室分离、鉴定、保存；ＰＫ一１５细胞由深 圳出入境检验检疫局深圳市外来有害生物检测技术 研究重点实验室保存。 １．１．２ 主要仪器和试剂 ＡＢＩ ７５００实时荧光ＰＣＲ 仪；ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｅｘ Ｔａｑ酶、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＩ ２ ０００均为宝生物工程（大 连）有限公司产品。 目前，国内外对该病进行了广泛深入的研究，研 制了有效的疫苗用于防控及净化该病［３］，同时也建 立了多种诊断方法，包括区分疫苗免疫和野毒感染 动物的抗体鉴别诊断方法。在血清学检测方面，有 多种方法在实际工作中普遍应用，尤其是鉴别诊断 ＥＬＩＳＡ可以区分免疫和感染动物，是实施根除计划 的必备工具 ］。在病原检测方面有病毒分离鉴定、 免疫荧光抗体染色技术、双抗夹心ＥＬＩＳＡ、核酸探 针和ＰＣＲ等检测方法，其中ＰＣＲ检测方法准确、简 便、快速，在临床检测中得到广泛应用ｌ＿７。 。但是 ＰＣＲ检测中涉及扩增产物的电泳分析，容易形成气 １．１．３ 临床送检样品 来自于深圳注册猪场送检 的１８０份临床样品，样品包括猪鼻腔拭子、病猪脑组 织、淋巴结等，研磨制备组织悬液（体积比１：５）用 于ＰＲＶ荧光ＰＣＲ检测。 溶胶而污染检测环境，使随后的检测出现假阳性现 象。为了克服ＰＣＲ方法的不足、提高检测敏感性， 收稿日期：２００９—１Ｏ一２８ 基金项目：检验检疫行业标准项目（２００７Ｂ００８）；深圳出入境检验检疫局科研项目（ＳＺＫ３３—２００５） 作者简介：吕建强（１９７５一），男，内蒙古巴彦淖尔人，高级兽医师，博士研究生，主要从事动物检疫及动物病毒学研究。 ２２ 动物医学进展２０１０年第３１卷第３期（总第２００期） １．２ 方法 的１８０份样品进行检测。 １．２．１ 引物、探针的设计与合成 根据已报道的伪 狂犬病病毒核酸序列，经同源性分析比较后，选择 ２结果 ２．１ ＰＲＶ实时荧光ＰＣＲ反应条件的优化 选用终浓度为０．１、０．２、０．４、０．６、０．８／￣ｍｏｌ／Ｌ 的引物和０．１、０．２、０．４、０．６、０．８／￣ｍｏｌ／Ｌ的探针，采 ｇＤ基因中高度保守的特异区段来设计荧光ＰＣＲ的 引物和ＴａｑＭａｎ探针，并由上海基康生物技术有限 公司合成、标记，上游引物序列为：５，＿ＣＧＣＡＣＣＴ— ＧＣＴＧＴＡＣＴＴＴＡＴＣＧ一３ ，下游引物序列为：５，＿ ＡＧＣＧＣＣＣＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣ一３ ，荧光素标记 用方阵法检测筛选引物和探针的最佳反应浓度。试 验结果表明，采用０．６ ｇｍｏｌ／Ｌ的引物和０．２／２ｍｏｌ／Ｌ ＴａｑＭａｎ探针序列为：５ ｒ＿ＦＡＭ—ＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴ— ＧＣＧＡＣＣＣＣＡ一３ 。 普通ＰＣＲ采用国家标准ＧＢ／Ｔ １８６４１－２００２中 的检测引物，上游引物序列为５＇－ＣＡＧＧＡＧ— ＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴ一３ ，下游引物序列为５，＿ ＧＴＣＣＡＣＧＣＣＣＣＧＣＴＴＧＡＡＧＣＴ一３ ，由上海生工 生物工程技术服务有限公司合成，用于扩增ＰＲＶ的 核酸片段，扩增产物大小为２１７ ｂｐ。 １．２．２病毒滴度的测定按照文献［１１］中的方法， 测定、计算伪狂犬病病毒的ＴＣＩＤ １．２．３ 病毒核酸的提取 参照ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ的说明书进行操作。 １．２．４ ＰＲＶ普通ＰＣＲ检测 参照文献［１２］中的 ＰＣＲ方法进行。 １．２．５ ＰＲＶ实时荧光ＰＣＲ检测方法的建立和条 件优化ＰＲＶ荧光ＰＣＲ的反应体系参照Ｅｘ Ｔａｑ 酶的说明书配制，采用５Ｏ Ｌ反应体系，将上游引 物、下游引物和荧光探针同时加人到反应体系中，于 ＡＢＩ ７５００荧光ＰＣＲ仪上进行反应。对荧光ＰＣＲ反 应体系中引物和探针浓度进行系列梯度方阵测定法 筛选，以获得最低ｃｔ值、典型荧光扩增曲线和较高 荧光强度增加值（ＡＲｎ）的引物和探针最佳浓度。 １．２．６ ＰＲＶ实时荧光ＰＣＲ的特异性试验 选取 猪￣ＷｔＪ，病毒、猪腺病毒、猪圆环病毒及２株ＰＲＶ分 离株，分别提取核酸作为模板进行ＰＲＶ荧光ＰＣＲ 检测，观察结果确定该方法的特异性。 １．２．７ ＰＲＶ实时荧光ＰＣＲ与普通ＰＣＲ灵敏度比 较取ＴＣＩＤ 。为１０ 。的ＰＲＶ病毒液１００ Ｌ，按 １．２．２中的方法提取病毒ＤＮＡ，测定核酸浓度后，作 ７个１Ｏ倍系列稀释，以每个稀释度的核酸作为模板 同时进行ＰＲＶ的荧光ＰＣＲ与普通ＰＣＲ检测。 １．２．８ ＿ＰＲＶ实时荧光ＰＣＲ的重复性试验 对同 一阳性样品的４个不同稀释度进行４个重复的 ＰＲＶ荧光ＰＣＲ检测，通过组内重复和组间重复的 荧光扩增曲线及Ｃｔ值变化来评估该方法的重复性。 １．２．９ ＰＲＶ实时荧光ＰＣＲ的临床检测 利用本 研究建立的ＰＲＶ荧光ＰＣＲ检测方法，对Ｉ临床送检 的探针终浓度，检测获得的Ｃｔ值最小、荧光扩增曲 线最典型而＆Ｒｎ值较大，从而确定其为最佳引物和 探针浓度。 优化后的反应程序如下：９５℃５ ｍｉｎ；９５℃、 １５ Ｓ，４９℃、３２ Ｓ，７２℃、１５ Ｓ，重复４０个循环，设置 每个循环的退火阶段收集荧光信号。 ２．２ ＰＲＶ实时荧光ＰＣＲ方法的特异性 用建立的ＰＲＶ荧光ＰＣＲ方法对猪细小病毒、 猪腺病毒、猪圆环病毒３种广泛分布的猪ＤＮＡ病毒 及２株ＰＲＶ分离株进行检测，结果发现只有对２株 ＰＲＶ分离株的检测出现了阳性扩增曲线，而对其他 病毒的检测为阴性（图】），表明该ＰＲＶ实时荧光 ＰＣＲ检测方法的特异性很好。 盏 删 磬 ２ ４ ６ ｌＯ ｌ２ ｌ４ Ｉ６ Ｉ 刎２ｚｚ４２６ ３Ｏ ３６３ ４Ｕ 循环数Ｃｙｃｌｅｎｕｍｂｅｒ 图１ ＰＲＶ实时荧光ＰＣＲ的特异性检测 Ｆｉｇ．１ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＲＶ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ２．３ ＰＲＶ实时荧光ＰＣＲ与普通ＰＣＲ的灵敏度比 较试验 取ＴＣＩＤ５。为ｌＯ 。的ＰＲＶ病毒液１００ Ｌ提取 总ＤＮＡ，Ｇｅｎｅｑｕａｎｔ Ｐｒｏ型核酸计数仪测定其核酸 质量浓度为１４２ ｎｇ／￣Ｉ 。将ＤＮＡ进行１Ｏ倍系列稀 释（１０～～１０ ），分别同时进行荧光ＰＣＲ反应和普 通ＰＣＲ反应，结果荧光ＰＣＲ可以检测的最低稀释 度为１０ （图２），相当于浓度为１．４２ ｐｇ／ｇＬ的 ＤＮＡ（对应约３ ＴＣＩＤ。。的病毒量），稀释度为１０ 时 检测结果为可疑，而普通ＰＣＲ法在１Ｏ 稀释度时可 以观察到２１７ ｂｐ的目的条带，但是１Ｏ 稀释度时为 吕建强等：伪狂犬病病毒实时荧光ＰＣＲ的建立和应用 ２３ 阴性结果（图３），检测结果的对比情况见表１。表明ＰＣＲ至少高出约１Ｏ倍。 本研究建立的荧光ＰＣＲ检测ＰＲＶ的灵敏度比普通 嘲 ２ ０００ｂｐ—— 安 １０００ｂｖ———◆ ５００ｂｐ—— ２５０ｂｐ—— １００ｂｐ——— ２ ４ ６ ８ ｌ０ １２ １４ｌ６ １８２ｏ２２２４２６２８３ｏ３２３４３６３８４０ 循环数Ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ．ＤＮＡ标准Ｄｌ ２ ０００；１～７．１Ｏ ～１０ 稀释；８．阴性对照 ＾，Ｌ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＩ ２ ０００：１－７．１Ｏ 一１０ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ；８．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ 图２ ＰＲＶ实时荧光ＰＣＲ检测方法的灵敏度试验 图３ ＰＲＶ普通ＰＣＲ检测方法的灵敏度试验 Ｆｉｇ．２ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＲＶ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｆｉｇ．３ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＲＶ ｂｙ ｒｏｕｔｉｎｅ ＰＣＲ ２．４ ＰＲＶ实时荧光ＰＣＲ重复性试验 近基本重合（图４），各稀释度的４个重复检测结果 对同一阳性样品的４个不同稀释度分别进行４ Ｃｔ值变化范围分别为０．０３、０．５１、０．３６、０．３８，表明 个重复的检测，结果发现，阴性对照没有Ｃｔ值，而样 本研究所建立的ＰＲＶ荧光ＰＣＲ检测方法重复性 品同一稀释度内４个平行样的扩增曲线在阈值线附 好，完全可以进行稳定、可靠的检测。 表１实时荧光ＰＣＲ与普通ＰＣＲ检测灵敏度的比较 Ｔａｂｌｅ １ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｒｏｕｔｉｎｅ ＰＣＲ 注：“＋”阳性；“一”阴性。 Ｎｏｔｅ：“＋”Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；“一”Ｎｅｇａｔｉｖｅ ２．５ 实时荧光ＰＣＲ方法的临床检测 取临床送检的１８０份样品进行ＰＲＶ实时荧光 ＰＣＲ检测，检测到５２份样品出现阳性扩增曲线，Ｃｔ 值均在３ｏ以下，表明有ＰＲＶ的感染，其余样品均为 嘲 磐 阴性，该检测结果与普通ＰＣＲ检测结果完全一致， 与样品来源猪的血清抗体ｇＥ鉴别ＥＩ ＩＳＡ检测结果 也间接符合。 ３讨论 ２ ４ ６ ８ １０ １２ １４ １６ １８２１１２２２４２６２８３０３２３４３６３８４０ 经过国内外学者的广泛深入研究，对伪狂犬病 循环数Ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ 的防控已经取得巨大突破，研制的基因缺失标记疫 苗配合鉴别诊断Ｅｌ ＩＳＡ方法，可以进行该病的根除 图４ ＰＲＶ实时荧光ＰＣＲ的重复性试验 Ｆｉｇ．４ Ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ＰＲＶ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ 计划，并且在一些发达国家获得了成功。与此同时， ２４ 动物医学进展２０１０年第３１卷第３期（总第２００期） 在该病的核酸检测方法研制方面也取得了进展， 和致病机理。 １－１３李学伍。陈焕春，杨艳艳，等．新生仔猪伪狂犬病的诊断与防治 ［Ｊ］．中国兽医科技，１９９７．２７（４）：３４—３５． ＰＣＲ技术已逐渐应用到伪狂犬病的诊断中，这些诊 参考文献： 断技术简便、快速、准确、灵敏，是较病毒分离更加便 捷易行的诊断方法，其已广泛用于病毒病的早期诊 断。随着ＰＣＲ诊断方法的广泛应用，研究者发现该 方法存在一些不足，甚至影响其推广应用。 为了克服伪狂犬病病毒ＰＣＲ检测方法的不足， 本研究采用荧光ＴａｑＭａｎ探针技术来研制伪狂犬病 ［２］许雁峰，郭万柱，徐志文，等．伪狂犬病基因缺失疫苗ＳＡ２１５株 ｇＤ基因的序列分析及其功能［Ｊ］．中国兽医学报．２００７，２７（６）： ８５８—８６１． ［３］Ｈｏｎｇ Ｑ，Ｏｉａｎ Ｐ，Ｌｉ Ｘ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐ１—２Ａ ｏｆ ＦＭＤＶ 病毒实时荧光ＰＣＲ检测方法。该方法的检测结果 无需电泳检测、不使用溴化乙锭，保障了实验人员和 环境的安全；避免了电泳开盖时出现气溶胶污染的 现象，保证监测结果的可靠性；在检测周期上要比普 通ＰＣＲ缩短２ ｈ－－３ ｈ，从核酸的提取到荧光ＰＣＲ反 应完成只需要４ ｈ，且可以在线观察检测情况，大大 提高了检测效率，特别适合大规模样品的快速检测 以及紧急疫情的快速诊断 Ｊ。 本研究所用的引物和探针是根据ＧｅｎＢａｎｋ中 已报道的伪狂犬病病毒ｇＤ基因序列中保守区域设 计的。试验发现，所建立的实时荧光ＰｃＲ方法特异 性强，只能检测到目标毒株，对猪细小病毒、猪腺病 毒、猪圆环病毒３种广泛分布的猪ＤＮＡ病毒扩增反 应阴性，其灵敏度可达到１．４２ ｐｇ／ｇＬ的总核酸（对 应约３ ＴＣＩＤ 。的病毒量），比普通ＰＣＲ方法的灵敏 度至少高１０倍。重复性试验发现，对同一样品在组 内及组间的检测结果Ｃｔ值变化范围小于０．５１，表明 其具有良好的重复性及实用性。利用本方法及普通 ＰＣＲ检测１８０份临床样品，结果有５２份样品呈阳性 检测结果，两者检测结果完全一致，并且与对样品来 源动物进行全病毒ＥＬＩＳＡ抗体检测结果间接相符。 本研究建立的实时荧光ＰＣＲ检测方法将为伪狂犬 病的流行病学调查提供了有力的工具，非常适合于 基层防疫部门及口岸动植物检疫部门推广应用。此 外，由于该方法可以检测到组织中极微量的病毒 ＤＮＡ，且可以进行定量检测，这将为研究病毒的入侵 途径、研究其嗜好组织、在宿主细胞内的增殖过程、 在体内的动态分布以及潜伏和复发机制等提供有力 工具，从而有利于进一步阐明伪狂犬病病毒的传播 ａｎｄ ＶＰ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：ａ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎ— ｄｉｄａｔｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，２００７，２９（１１）：１６７７—１６８３． ［４］Ｂｉｔｓｃｈ Ｖ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ Ｊ．Ｏｎ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｕｊｅｓｚｋｙ ｓ ｄｉｓ— ｅａｓｅ ｉｎ Ｄｅｎｍａｒｋ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ，１９８２，１７：２２７—２３６． ［５］Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ Ｓ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ａｕｊｅｓｚｋｙ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎｌ－Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ａｎｉａｔ Ｓｃｉ，１９８２，１７：２３７— ２４４． ［６］ 白新盛，卢景良．畜禽重大疫病生物技术防制研究［Ｍ］．北京： 中国农业出版社，Ｉ９９８：１５Ｏ一３０３， ［７］赵俊龙，陈焕春，吕建强，等．猪细小病毒和猪伪狂犬病毒复合 ＰＣＲ检测方法的建立［Ｊ］．华中农业大学学报，２００２，２１（２）： １２３ １２５． Ｅ８］Ｌｅｅ Ｃ Ｓ，Ｍｏｏｎ Ｈ Ｊ，Ｙａｎｇ Ｊ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｙｔｏｍｅｇ— ａｌｏｖｉｒｕｓ，ａｎｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｉｇｓ［Ｊ３。Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００７，１３９（１）：３９－４３． ［９］ 刘志杰，任慧英，温建新。等．用地高辛标记的核酸探针检测猪 伪狂犬病毒野毒感染的研究［Ｊ］．畜牧兽医学报，２００８，３９（１１）： １６２卜１６２４． ［１０］韩新影，李潭清，杨润德，等．猪圆环病毒、猪细小病毒及猪伪 狂犬病毒多重ＰＣＲ诊断方法的建立［Ｊ３．黑龙江畜牧兽医， ２００９（１）：７３—７４． ［１１］殷 震，刘景华．动物病毒学［Ｍ］．２版．北京：科学出版社， １９９７：３２９ ３３１． ［１２］ＧＢ／Ｔ １８６４１—２００２．伪狂犬病诊断技术Ｉｓ］． ［１３］ＭｃＫｉｌｌｅｎ Ｊ，Ｈｊｅｒｔｎｅｒ Ｂ，Ｍｉｌｌａｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ｒｅ— ａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００７，１４０（１－２）：１５５－６５． ［１４］Ｗｉｅｄｒｏ Ｋ，Ｓｔａｃｈｏｗｓｋａ Ｅ，Ｃｈｌｕｂｅｋ Ｄ．Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—ＰＣＲ）［Ｊ］，Ａｎｎ Ａｃａｄ Ｍｅｄ Ｓｔｅｔｉｎ，２００７，５３ （３）：５－９． ［１５］ 葛忠源。熊东艳，张启勇．实时荧光定量ＰＣＲ技术及应用［Ｊ］． 中国牧业通讯，２００８（１３）：１２－１４． 动物医学进展，２Ｏ１０，３１（３）：２５—２９ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 鸭瘟病毒转移质粒的构建 张馨月 。，冉多良 ，叶伟成 ，袁秀芳 ，王一成 ，刘蔓雯 ，张 存 （１．浙江省农科院畜牧兽医研究所，浙江杭州３１００２１；２．农业大学动物医学学院，岛鲁木齐８３００５２） 摘要：为了建立重组鸭瘟病毒技术，构建了鸭瘟病毒转移质粒。在对鸭瘟强毒和弱毒株ＴＫ基因进行 测序分析后，将鸭瘟病毒ＴＫ—ＵＩ ２４ ＤＮＡ片段克隆于ＰＵＣ１８载体中，构建了质粒ｐＴＫ；将ＰＣＲ扩增的ＧＦＰ 真核表达盒插入ｐＴＫ质粒的ＴＫ基因内部，获得转移载体质粒ｐＴＫ—ＧＦＰ。鸭瘟病毒ＴＫ～ＵＩ ２４测序分析 表明鸭瘟强、弱毒株ＴＫ基因序列完全相同；转移栽体携带Ｐｃｍｖ—ＧＦＰ ＳＶ４０ｐＡ表达盒，测序验证其序列与 源序列一致。ｐＴＫ—ＧＦＰ在脂质体介导下，转染鸭胚成纤维细胞和鸭肾细胞，在荧光显微镜下观察绿色荧光 蛋白表达情况。质粒转染细胞后，绿色荧光蛋白得到了有效的表达，为进一步开展重组鸭瘟病毒的研究和构 建具有遗传标记的鸭瘟疫苗奠定了基础。 关键词：鸭瘟病毒；ＴＫ基因；转移栽体 中图分类号：￥８５２．６５９．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１０）０３—００２５—０５ 鸭瘟（Ｄｕｃｋ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）是由鸭瘟病毒（Ｄｕｃｋ ｅｎ ｔｅｎｕｓ ｖｉｒｕｓ，ＤＥＶ）引起的鸭、鹅、雁及其他雁形目禽 来，鸭瘟病毒基因研究取得了显著的进展，ＴＫ、 ＵＩ ２４、ｇＨ、ｇＤ、ＵＬ６等基因的序列陆续得到克隆和 测序 引。 类的急性、败血性、高度致死性传染病，其特点足流 行广泛，传播迅速，发病率和死亡率高一 ，给养鸭业 带来了巨大经济损失。鸭瘟病毒属于疱疹病毒科、 ａ一ｏｔ疱疹病毒可以作为活的病毒载体，病毒基因 组大，有， 泛的非必需区存在，其中ＴＫ基因就是一 个常用的非必需区，在ＴＫ基因内部插入外源基因 能够得到有效的表达。重组ａ一疱疹病毒已经成为 疱疹病毒亚科，衣壳为２ｏ面体对称，有囊膜。鸭 瘟病毒的ＤＮＡ具典型的疱疹病毒ＤＮＡ的特征，基 因组为线状双股ＤＮＡ，大小约为１ ５０ ｋｂ【 。近年 收稿日期：２００９—１０—１４ 基金项目：浙江省自然科学基金项目（Ｙ３ｏ６１７９） 作者简介：张馨月（１９７１一）．女，山东单县人．硕士研究生，主要从事预防兽医学研究。＊通讯作者 带 带眯讲话带 ｛＝∈ 豢鬻崇 常 拳 带 米并 谱 半话半岽 ， Ｉ；－幸帝 ｝ ，｝一 一 岽， 木带带－＝二岽 米错半晕一一 常 岽一 带帮带一 辛 母 一 幸强带 督帮 鬻睾弗豢帐崇 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＰＣＲ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ ＬＵ Ｊｉａｎ—ｑｉａｎｇ。，ＨＥ Ｙｕｎ ｗｅｉ ，Ｉ Ｕ Ｔｉ～ｋａｎｇ ，ＨＵＡ Ｑｕｎ ｙｉ ， ＱＩＮ Ｚｈｉ—ｆｅｎｇ ，ＴＡＯ Ｈｏｎｇ ，ＹＡＮＧ Ｊ ｕｎ—ｘｉｎｇ ，ＲＵＡＮ Ｚｈｏｕ—ｘｉ （１．Ｓｈｅｎ．ｚｈＰＨ Ｅｎｔｒｖ—Ｅｘｉｔ Ｉｎｓ Ｐ（ｔｉｏｎ“＂ Ｑ““ｒ“ｎｔｉｎｅ Ｂｌｄｔ－￣ａ“，Ｓｈｅｎｚｈ ¨，ＧｕａｎｇｄｏｎＲ，５１ ８０ｌ０，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｂｉｏｃｅｍ“ｒｙ ＴＹ（Ｊｌｌ＆ｇｅｒｌｅ（Ｃｈｉｎａ）Ｃｏ．，』 ｔｄ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ・Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ＇５１８０４８，（ ，ｌ“） ，Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ（ＰＲ）ｈａｓ ａｌｒｅａｄｙ ｂｅｃｏｍｅ ａＦｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｎｉｍａ】ｄｉｓｅａｓｅ ａｌｌ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ，ｗｈｉｃｈ ａｆ－ ｆｅｃｔｓ ｂａｄｌｙ ｏｎ ｐｉｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｒａｐｉｄ，ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｍａｉｎ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔＯ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｒａｐｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ＴａｑＭａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇＤ ｇｅｎｅ ｏｆ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉｎ Ｇｅｎ— Ｂａｎｋ．Ａｆｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＰＣＲ，ａ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔＯ ｄｅｔｅｃｔ ＰＲＶ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ．ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｍｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｈｉｇｈ．１８０ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＰＣＲ ａｓ— ｓａｙ ｆｏｒ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ．５ ２ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄ ｏｔｈｅｒｓ ｗｅｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ．Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏ１． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ；ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
