_荧光RT-PCR鉴别诊断O型与Asia Ⅰ型口蹄疫病毒方法的建立

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荧光RT-PCR鉴别诊断O型与AsiaⅠ型口蹄疫病毒方法的建立*

薄清如1,罗宝正**1,杨

素1,徐海聂1,沙才华1,罗吉新2

（1.珠海出入境检验检疫局国家外来病检测重点实验室，珠海519015；2.三统万福（青岛）食品有限公司，青岛266700）摘要：从GenBank中获取多个口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV）基因组序列，进行多序列比对之后，设计VP3和3C区域的引物和探针，分别建立了FMDV群特异性实时荧光RT-PCR、O型特异性实时荧光对应于口蹄疫病毒的3D、

RT-PCR和AsiaⅠ型特异性实时荧光RT-PCR检测方法。三种FMDV实时荧光RT-PCR在Lightcycler荧光PCR仪上扩增均并且具有良好的特异性，可以很好地将FMDV与传染性牛鼻气管炎病毒（Infectiousbovinerhinotracheitis出现标准的S型曲线，

virus）、猪传染性胃肠炎病毒（Swinetransmissiblegastroenteritisvirus）、赤羽病病毒（Akabanevirus）和猪呼吸系统冠状病毒（Porcinerespiratorycoronavirus）区分。FMDV群特异性实时荧光RT-PCR可以成功扩增O型（O1和O2毒株）和AsiaⅠ型（AsiaⅠ1和AsiaⅠ2毒株）FMDV；O型特异性实时荧光RT-PCR可成功扩增O型（O1和O2毒株）FMDV，AsiaⅠ型（AsiaⅠ1和AsiaⅠ2毒株）FMDV为阴性；AsiaⅠ型特异性实时荧光RT-PCR可成功扩增AsiaⅠ型（AsiaⅠ1和AsiaⅠ2毒株）FMDV，O型（O1和O2毒株）FMDV为阴性。FMDV群特异性实时荧光RT-PCR、O型特异性实时荧光RT-PCR和AsiaⅠ型特异性实时灵敏度接近检测方法的极限。检测时间短，从加样到反应结束只需要70min。该荧光RT-PCR都可以检测到10个拷贝的模板，方法有潜力用于FMDV的实验室筛查与鉴别诊断。

关键词：口蹄疫病毒；荧光RT-PCR；鉴别诊断中图分类号：S188文献标识码：A

文章编号：1006-1304(2009)01-0024-05

EstablishmentofReal-timeRT-PCRAssaytoDifferentiateOand

AsiaⅠTypeFoot-and-mouthdiseasevirusBOQing-ru1,LUOBao-zheng1**,YANGSu1,XUHai-nie1,SHACai-hua1,LUOJi-xin2

(1.ZhuhaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,StateKeyLaboratoryforForeignDiseaseDetection,Zhuhai519015,China;2.Santongwanfu(Qingdao)Food.,LTD,Qingdao266700,China)Abstract:SeveralgenomesequencesofFoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)wereobtainedfromGenBank.Aftermultiplexalignment,threesetsofprimersandprobesweredesignedaccordingto3D,VP3and3CregionofFMDVandusedtoestablishFMDVspecies-specificity,Otype-specificityandAsiaⅠtype-specificityReal-timeRT-PCR,respectively.StandardSshapecurvesoccurredafterthreekindsofReal-timeRT-PCRamplificationonLightcyclermachine.Allthethreenewlyestablishedmethodshadgoodspec-ificationfortheycoulddifferentiateFMDVfromInfectiousbovinerhinotracheitisvirus,Swinetransmissiblegastroenteritisvirus,Aka-banevirusandPorcinerespiratorycoronavirus.FMDVspecies-specificityReal-timeRT-PCRcouldsuccessfullyamplifyOtype(O1strainandO2strain)andAsiaⅠtype(AsiaⅠ1strainandAsiaⅠ2strain)FMDV.Otype-specificityReal-timeRT-PCRcouldsuccess-fullyamplifyOtype(O1strainandO2strain)FMDVbutfailedtoamplifyAsiaⅠ(AsiaⅠ1strainandAsiaⅠ2strain)FMDV.AsiaⅠtype-specificityReal-timeRT-PCRcouldsuccessfullyamplifyAsiaⅠ(AsiaⅠ1strainandAsiaⅠ2strain)FMDVbutfailedtoamplifyOtype(O1strainandO2strain)FMDV.Allmethodscoulddetect10copiesofDNAtemplate,closelyreachthedetectionlimit.ThewholeReal-timeRT-PCRreactioncouldbefinishedin70min.ThesemethodshavepotentialtoapplyinFMDVscreenanddifferen-tialdetectioninlaboratory.

Keywords:Foot-and-mouthdiseasevirus(FMDV);Real-timeRT-PCR;differentialdetection

*基金项目：国家质量监督检验检疫总局项目（No.2004IK133）资助。

**通讯作者。Authorforcorrespondence.博士，兽医师，主要从事动物传染病分子诊断方面的研究。E-mail:.收稿日期：2008-05-07接受日期：2008-06-05

第1期薄清如等:荧光RT-PCR鉴别诊断O型与AsiaⅠ型口蹄疫病毒方法的建立25

口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是由FMDV（Foot-and-mouthdiseasevirus）感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性和接触性传染病。患病动物的口、舌、唇、蹄和乳房等部位出现水泡，破溃并形成烂斑。人和非偶蹄动物也可感染该病，但症状较轻。FMD病情一般呈良性经过，死亡率只有2%~3%，但是该病一经检出，相应的家畜及畜产品就禁止运输和出口，造成巨大的经济和政治影响。我国于2005年对外公布了AsiaⅠ型FMD疫情，加上以前报道的O型FMD，已经有2个血清型的口蹄疫疫情在

FMD的爆发和流行除了对畜牧业生产国内出现过。

造成巨大的损失外，对人民生活所需要的奶品、肉品

供应也造成很大的影响，故各国对FMD的检验检疫非常严格。FMD检测可以通过病毒分离、补体结合试验（CFT）、病毒中和试验（VNT）和动物接种试验等方法。然而，这些方法费时费力，特异性和灵敏度也无法满足需要，急需一种快速、准确的检测技术。

自PCR技术问世以来，国内外的研究者开始用该方法来检测动物不同组织中的FMDV，使检测的过程大大缩短，准确性进一步提高（朱彩珠等，1998；Clavijoetal.,2003）。Taqman探针荧光PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，该技术在原理上较SYBRGREENⅠ更为严格，所得数据更为准确。国内外已经有使用荧光RT-PCR检测FMDV的报道（ZhangandSoren,2003;Rasmussenet１．２FMDV基因组RNA的提取

取200μL病毒组织培养液用于病毒RNA提

取，方法按照Mrcgene公司的Trizol试剂说明书进行。用20μLDEPCH2O溶解提取的RNA。取2μL用于RT-PCR反应。１．３引物、探针的设计与合成

从GenBank中获得部分O型FMDV全基因序

DQ248888、AF506822、AF026168、列（AF511039、

AY317098、AY333431、AY686687和AY333431）、AsiaⅠ型FMDV全基因组序列（AY390432）和部分

利用CLUSTALX进行序其它型FMDV的代表株。

列分析，找到理想片段用Oligo6.0进行种属特异性

引物、探针和型特异性引物、探针的设计。引物和探针由上海英骏生物技术有限公司合成。探针的5'端标记发光基团FAM，3'端标记泯灭基团TAMRA。FMDV群特异性引物、探针：

上游引物：5'-TGGGACCATACAGGAGAAGTT-3'；下游引物：5'-CCAACGCAGGTAAAGTGATCTG-3'；Taqman探针：FAM-GTCCACTCCGGACCTGAGAG-TAMRA。

O型特异性引物、探针：

5'-AACCCMCGGACGAACATGAC-3'；上游引物：

下游引物：5'-CGATGTTGGCATACACCTTGAT-3'；Taqman探针：FAM-TACGACCAGTACAAGGTWCACAA-TAMRA。

AsiaⅠ型特异性引物、探针：

5'-TGGAGGAGCCGTTCTTGCTA-3'；上游引物：

5'-GCCACCTGCGGAGTGAGT-3'；下游引物：

Taqman探针：FAM-ACGGAGCCGAGACTTTCATCGTCG-TAMRA。

al.,2003;花群义等，2005），但都无法对O型和Asi-aⅠ型FMDV进行鉴别诊断。本研究拟建立FMDV

种群特异性实时荧光RT-PCR以及O型、AsiaⅠ型特异性荧光RT-PCR检测方法，期望为大量样品筛查和鉴别检测FMDV提供一种快速、敏感并且高通量的方法。

１．４RT-PCR反应及其产物克隆、测序

使用TaKaRa公司的一步法RT-PCR试剂盒进行核酸扩增，每条引物的终浓度为0.2mmol/L，反应条件为50℃逆转录30min，94℃预变性2min;然后94℃10s，55℃30s，72℃30s，40个循环;最后72℃延伸7min。取RT-PCR产物5μL在2%的琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统观察并保存结果。将扩增到的特异性基因片段采用T-A克隆方案克隆至pMD18-T载体中。使用QIAGEN公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒抽提重组质粒，操作步骤按照说明书进行，重组质粒送广州英骏公司测序。１．５实时荧光RT-PCR方法的建立

使用3套引物、探针配制的反应体系分别检测4个FMDV毒株。并且对各自的特异性和灵敏性进行测试。

１材料和方法

１．１病毒

口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV）是在细胞上培养的适应毒。其中O1和O2为O型FMDV；AsiaⅠ1和AsiaⅠ2为AsiaⅠ型FMDV。

传染性牛鼻气管炎病毒（Infectiousbovinerhinotracheitisvirus）、猪传染性胃肠炎病毒（Swinetransmissiblegastroenteritisvirus）、赤羽病病毒（Aka-banevirus）和猪呼吸系统冠状病毒（Porcinerespira-torycoronavirus）均为细胞毒，珠海出入境检验检疫局自行保存。

26农业生物技术学报2009年

实时荧光RT-PCR在Lightcycler上进行，反应条件为42℃30min，92℃预变性2min;然后92℃10s，55℃30s，40个循环。

FMDVO型特异性荧光RT-PCR对O1、O2、A-siaⅠ1和AsiaⅠ2进行检测，O1和O2为阳性，而AsiaⅠ1和AsiaⅠ2为阴性，空白对照无荧光值增长

(图4)。

FMDVAsiaⅠ型特异性荧光RT-PCR对O1、O2、AsiaⅠ1和AsiaⅠ2进行检测，AsiaⅠ1和AsiaⅠ2

２结果

２．１RT-PCR反应的建立及产物克隆测序根据引物位置，FMDV群特异性型PCR

产物预期大小为136bp，O型特异性PCR产物166bp，AsiaⅠ型特异性PCR产物67bp。反应结束后，RT-PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，可见3条与预期片段大小基本一致的条带（图1）。测序结果在GenBank中进行比对，与目的片段序列基本一致。

图2.实时荧光RT-PCR群外特异性扩增荧光曲线Fig.2.SpecificityamplificationcurveofextraspeciesbyReal-time

RT-PCR

图1.RT-PCR产物凝胶电泳

Fig.1.AgarosegelelectrophoresisofRT-PCRproduct

M，DNA分子量标准；1，种属特异性RT-PCR产物；2，O型特3，AsiaⅠ型特异性RT-PCR产物。异性RT-PCR产物；

M，DNAladder;1，species-specificRT-PCRproduct;2，OAsiaⅠtypespecificRT-PCRtype-specificRT-PCRproduct;3，

product.

图3.FMDV群特异性实时荧光RT-PCR扩增

２．２实时荧光RT-PCR方法的建立

２．２．１方法的特异性对3种检测方法的群外特异性、群特异性、O型特异性和AsiaⅠ型特异性进行检测。

利用设计的3套引物、探针配制反应体系，细胞毒提取的FMDVRNA作为样品进行检测，经过40个循环之后，3个反应中荧光信号都呈S形增长，而猪传染性胃肠炎病毒、赤羽病病毒、猪呼吸系统冠状病毒和空白对照都无荧光值增长(图2)。新建立的反应体系具有良好的种群外特异性，能特异性的扩增FMDV。FMDV群特异性荧光RT-PCR对O1、O2、AsiaⅠ1和AsiaⅠ2进行检测，4个毒株都出现良好的扩增曲线，空白对照无荧光值增长（图3）。

Fig.3.Specificamplificationcurveofspecies-specificitybyReal-time

RT-PCR

图4.FMDVO型特异性实时荧光RT-PCR扩增

Fig.4.SpecificamplificationcurveofOtypespecificitybyReal-time

RT-PCR

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为阳性，而O1和O2为阴性，空白对照无荧光值增长（图5）。

２．２．２方法的灵敏度在紫外分光光度计上测定重组T载体的OD260，根据分子量大小和阿佛加德罗常数换算成拷贝数，然后10倍比稀释重组载体，在荧光PCR仪上检测到的重组载体的最少拷贝数即是实时荧光RT-PCR的灵敏度。从图中可以看到，3种引物探针都能检测到10个拷贝的模板(图6，A、B、C)。

图5.FMDVAsiaⅠ型特异性荧光RT-PCR扩增

Fig.5.SpecificityamplificationcurveofAsiaⅠtypespecificReal-time

RT-PCR

３讨论

由于国际间贸易的频繁和交通运输的便利，在口蹄疫疫情刚刚出现的时候，病毒随着活体动物进行转移进而向周边国家和地区传播的可能性极

）。2001年在英大（Knowlesetal.,2001

国暴发的O型口蹄疫很快在欧盟的多个国家出现。英国皇家协会(www.royalsoc.ac.uk)推荐的控制FMD暴发的最有利手段就是早期检测。如今使用的检测FMDV的方法是病毒分离培养和抗原ELISA相结合的方法。然而，培养细胞是一件费时费力的事情，而且病毒材料的致病力以及对于细胞的适应性有区别，细菌和霉形体也会对细胞造成污染，因此获得的实验结果往往出现差异。PCR技术的出现是检测领域的一大，它高度的灵敏性和使用的简易性给研究人员带来很大的便利。各国研究者很快将这一技术用于FMD的诊断，相关的报道也相继出现（Reidetal.,2006;Guetal.,2007）。荧光PCR是在传统PCR的基础上发展而来的新方法，只需要极少量的病原提取其核酸就可以得到阳性结果，而且闭管操作，最大可能的减少了污染。与病毒分离实验相比较，如果分离的病毒不适应细胞培养时，荧光RT-PCR的优越性就更明显；病毒分离培养需要0.2mL的病毒液接种，而实时荧光RT-PCR只需要几微升就可以完成整个检测反应，解决了组织样品太少无法检测的困难。

图6.FMDV种属特异性（A）、O型特异性AsiaⅠ型特异性（B）和AsiaⅠ

型特异性(C)实时荧光RT-PCR灵敏度

Fig.6.SensitivityamplificationcurveofFMDVspecies-specificity（A）、Otype-specificity（B）andAsiaⅠ-specificity（C）byReal-timeRT-PCR

28农业生物技术学报2009年

口蹄疫病毒的快速变异无法知道下一个突变发生在什么地方，如果新的毒株在检测区域发生突变，就可能出现造成漏检现象。本实验中使用过10多套引物、探针，并且在一些位点使用了兼并碱基，然而，没有一套可以兼顾到所有的毒株，也就是说，没有一套引物可以成功地扩增迄今为止出现的所有

FMDV，只能在尽可能保守的区域设计引物、探针，进而随着病毒变异不断尝试新的检测区域。本实验中使用的引物、探针序列针对于GenBank中公布的

多数序列，可以成功地扩增近期流行的毒株，特异性好，灵敏度高，因此有潜力用于兽医临床FMDV筛查和鉴别诊断。

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