・３４・ 《上海畜牧兽医通讯》２０１６年第６期 猪流行性腹泻病毒ＲＴ—ＰＣＲ方法的建立与应用 徐引弟 白献晓 李海利 张青娴 朱文豪 王克领 （河南省农业科学院畜牧兽医研究所河南郑州４５０００２） 【摘要】２０１０年１０月以来，仔猪腹泻在中国暴发，给中国的养猪业造成重大的损失。仔猪腹泻 的病原多样，其中猪流行性腹泻病毒ＰＥＤＶ是最主要的病原。本试验参考ＰＥＤ 的ｓ基因序列， 设计了一对引物，建立了扩增ＰＥＤＶ的ＲＴ—ＰＣＲ方法，用于临床上大量腹泻病料的鉴定。结果表 明该方法特异敏感，发生腹泻的猪场中ＰＥＤＶ阳性猪场占９２．９ ，ＰＥＤＶ阳性率占腹泻病料的 ３７．０ 。ＰＥＤＶ是引起仔猪腹泻大量死亡的主要原因之一。 关键词：猪流行性腹泻病毒；ＲＴ—ＰＣＲ；建立 ２０１０年１Ｏ月以来，我国大部分地区大部分猪 场暴发一种以哺乳仔猪水样腹泻、呕吐、高发病率 和高死亡率为主要特征的猪病。此次暴发一直延 续至今未平息，影响中国南方数十个省的生猪产 业，导致超过１００万头仔猪的死亡，１周龄以内的仔 猪发病率几乎１００ ，死亡率高达８Ｏ ～１００ 。暴 发中母猪和公猪很少出现临床症状。极少猪场幸 免，且病情反复，经常一段时间后又暴发一次，且一 次比一次严重，传统的控制策略对当前的腹泻效果 不明显，这次持续长时间的要求给中国养猪户及养 猪业造成了灾难性的打击及无法估量的损失。经 过国内外专家学者几年不懈的努力，对引起此腹泻 病暴发的病原有了较为清晰的了解。引起此次严 重腹泻的病原主要是变异的猪传染性腹泻病毒 （Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ，ＰＥＤ、，），其它的 病原还有伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮 状病毒等“ 。 本试验建立了一种快速、特异、简便的检测 ＰＥＤＶ的ＲＴ—ＰＣＲ方法，并应用于河南及周边地区 发生腹泻的猪场的检测，为腹泻病的研究和防制提 供依据。 灭菌烘干。取病猪的肠道、粪便等组织约０．５ ｇ，剪 碎，加１ ｍＬ无菌ＰＢＳ匀浆，倒入１．５ ｍＬ ＥＰ管， ７０℃反复冻融３次，８ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心５ ｒａｉｎ，取 １００ Ｌ上清液于１．５ ｍＬ ＥＰ管。 １．４ 病料组织总ＲＮＡ的提取 取上述上清液１００ Ｌ，按照ＲＮＡ提取试剂盒 操作说明提取总ＲＮＡ，最后病料ＲＮＡ融于３０肚Ｌ ＤＥＰＣ灭菌水。 １．５ 引物设计 参考文献 报道以及ＰＥＤＶＳ基因的序列，设 计一对引物，引物序列Ｐ ：５’一ＴＴＴＡＴＴＣＴＧＴ— ＣＡＣＧＣＣＡＴ一３’；Ｐ２：５’一ＡＧＡＴＴＴＡＣＡＡＡＣＡＣ— ＣＴＡＴＧＴＴＡ－３’；预期扩增产物长度为１９９ ｂｐ。 引物由上海生工合成。 １．６ 反转录ＲＴ １Ｏ Ｌ反转录体系：５×Ｍ—ＭＬＶ ｂｕｆｆｅｒ ２ Ｌ、 ｄＮＴＰ（１０ ｍＭ／Ｌ）０．５ Ｌ、Ｐ３（１０ ｕＭ／Ｌ）１ Ｌ、 ＲＮａｓｅ抑制剂（４Ｏ Ｕ／ｕＬ）０．２５ Ｌ、Ｍ—ＭＬＶ反转录 酶（５ Ｕ／￣Ｌ）０．２５ Ｌ、总ＲＮＡ ５ Ｌ，加ＤＥＰＣ灭菌 水至１０ Ｌ，３７℃水浴１ ｈ，即用或一７Ｏ℃备用。 １．７ ＰＣＲ １材料和方法 １．１ 病料 主要采自河南及周边地区发生腹泻的猪场的 ２５ Ｌ ＰＣＲ反应体系：１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２．５ ｌ上Ｌ、 ｄＮＴＰ（１０ ｒａＭ／Ｌ）０．５ Ｌ、Ｐ１、Ｐ２（１０ Ｍ／Ｌ）各 ０．５ Ｌ、ｒＴａｑ酶０．５ Ｌ、ｃＤＮＡ ２ Ｌ，加灭菌水至 ２５ Ｌ。ＰＣＲ循环体系：９５℃预变性５ ｒａｉｎ，进入循 环，９４℃３０ Ｓ，５３℃３０ Ｓ，７２℃３Ｏ ｓ，３５个循环后， 肠道、粪便，即用、一２Ｏ℃或一７０℃保存。 １．２ 工具酶及试剂 Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ提取试剂盒ＲＮＡｉｓｏ Ｒｅａｇｅｎｔ、反转 ７２℃延伸５ ｒａｉｎ，结束后取１０ Ｌ进行１．０％琼脂糖 凝胶电泳。 录酶Ｍ—ＭＬＶ、ＲＮＡ酶抑制剂、ｒＴａｑ酶、ｄＮＴＰｓ、 ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、ＤＥＰＣ等均购自宝生物工程 （大连）有限公司。 １．８ ＲＴ—ＰＣＲ的应用 将所建立的ＲＴ—ＰＣＲ用于临床发病猪病料的 检测。 １．３病料的处理 所有接触ＲＮＡ的耗材如剪刀、镊子、注射器、 ＥＰ管、吸头、匀浆器等均经０．１％ＤＥＰＣ水处理后 ２ 结果 ２．１ ＲＴ—ＰＣＲ方法的建立 以Ｐｚ反转录，以Ｐ 、Ｐ 进行ＰＣＲ，结果从疑似 病料中扩增出约１９９ ｂｐ片段（如图１）。 基金项目：河南省农业科学院自主创新基金项目（２０１６ＺＣ￥１） 河南省科技攻关计划项目（１６２１０２１１００４２） 《上海畜牧兽医通讯》２０１６年第６期 ・ ３５ ・ Ｍ １ ２ ３ ４ ｂｐ ２ ０００—— ｌ ｏ００—— ７５Ｏ—— ５００。。。。’’’。—— ２５０・—— —－———— １ＯＯ—— 图１ ＰＥＤ的ＲＴ－ＰＣＲ Ｍ：ＤＬ２０００ ＤＮＡ分子量标准；１～３：ＰＥＤ阳性；４：阴性对照 ２．２ ＲＴ—ＰＣＲ的应用 共采集来自１４个猪场的５４头猪的样品，结果 ＰＥＤ阳性猪场数１３个，占９２．９ ；ＰＥＤ阳性仔猪２０ 头，占３７．０ 。 ３ 讨论 自２０１０年１０月份以来，猪流行性腹泻ＰＥＤ在 我国呈现流行区域广、流行强度大、危害十分严重， 对很多地方的哺乳仔猪造成了毁灭性的打击，给我 国的生猪产业造成了极大的经济损失。传统的疫 苗防疫效果极差，传统的返饲效果极差，药物治疗 效果极差。２０１１年开始，一些报道存在变异毒株， 这些变异毒株很可能是造成本次我国流行ＰＥＤ的 罪魁祸首。２０１１年，刘孝珍等通过对我国东南沿海 的ＰＥＤ 毒株的部分Ｓ基因序列研究提出新的基 因的存在０ 。２０１１年陈建飞首次公布了变异毒株 的基因组序列，之后不断有新的变异毒株的全基因 组序列的报道。变异毒株与疫苗毒株存在较多差 异，特别是Ｓ基因的１～８ＯＯ ｂｐ处，研制新的针对变 异毒株的疫苗迫在眉睫 ”。 本文建立了ＰＥＤＶ的ＲＴ—ＰＣＲ检测方法，简 单特异，从样品检测的结果看，腹泻猪场ＰＥＤＶ的 阳性场率极高，说明ＰＥＤＶ的感染力极高，危害十 分严重。除ＰＥＤＶ外，在腹泻病料中，也检测出传 染性胃肠炎病毒和轮状病毒以及猪伪狂犬病毒的 感染，但比例稍低，并且有２种或２种以上病毒混合 感染的情况，特别是近年来伪狂犬病毒发病率呈上 升趋势，对１周内腹泻死亡的仔猪有重要影响，经常 与ＰＥＤ 混合感染，进一步加重死亡猪的比例。 参考文献 Ｃ１３杨汉春．我国新发猪病的流行现状与防控的科学问题．兽 医导刊，２０１２（２）：２２～２７． ［２３张志，李岚，王赛赛．猪流行性腹泻新毒株的分离鉴定和 致病性研究．中国兽医学报，２０１２，３２（１０）：１４２３￣１４２８． ［３３黄毓茂．当前猪病毒性腹泻流行特点与防控建议．中国猪 业，２０１２（１１）：２１～２２． （４３郭林，唐利，刘昱．２０１１年病毒性腹泻的新特点和防控措 施．猪业科学，２Ｏ１２（２）：５４～５５． （５３刘孝珍，陈建飞，时洪艳．２０１１年猪流行性腹泻病毒的遗 传变异分析．中国预防兽医学报，２０１２，３４（３）：１８Ｏ～１８３． ［６３ Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｃ，Ｓｈｉ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉ— ｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ．Ｊ Ｖｉｒｏ１，２０ｌ１，８５（２１）：ｌｌ５３８～ｌ１５３９． （７３ Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｓｈｉ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｖａｒｉａｎｔ．Ｊ Ｖｉｒｏ１， ２０１２，８６（６）：３４０８． （８３Ｓｕｎ Ｒ Ｑ，Ｃａｉ Ｒ Ｊ，Ｃｈｅｎ Ｙ Ｑ，ｅｔ ａ１．０ｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｉｎ ｓｕｃｋｌｉｎｇ ｐｉｇｌｅｔｓ．Ｃｈｉｎａ Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２Ｏ１２，１８（１）：１６１～１６３． ［９３ Ｐａｎ Ｙ，Ｔｉａｎ Ｘ，Ｌｉ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ— ｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖａｒｉａｎｔ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２０１２，１２（９）：１９５． ［１Ｏ］Ｙａｎｇ Ｘ，Ｈｕｏ Ｊ Ｙ，Ｃｈｅｎ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａ— ｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｅｍｅｒｇｉｎｇ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅ－ ｖａｉｌｉｎｇ ｉｎ ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｈｉｎａ ｆｒｏｍ ２０１０ ｔｏ ２０１ ｌ＿Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ． ２０１３，４６（２）：３３７～３４４． ［１１３Ｚｈａｏ Ｍ，Ｓｕｎ Ｚ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｖｅｔｏ ｃｅｌｌ－ａｄａｐｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｈｉｎａ．Ｊ Ｖｉｒｏ１，２０１２，８６（２４）： １３８５８～１３８５９． ［１２］Ｗｅｉ Ｚ Ｙ，Ｌｕ Ｗ Ｈ，Ｌｉ Ｚ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＧＤ一１ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２０１２，８６（２４）：１３８２４～１３８２５． （１３３ Ｇａｏ Ｙ，Ｋｏｕ Ｑ，Ｇｅ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｆｉｅｌｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ ｒｅ— ｃｅｎｔｌｙ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏ１，２０１３，１５８（３）：７１１～７１５． ［１４３Ｃｈｅｎ Ｆ，Ｐａｎ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｖａｒｉａｎｔ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｊ Ｖｉｒｏ１，２０１２，８６（２２）：１２４４８． （１５３Ｂｉ Ｊ，Ｚｅｎｇ Ｓ，Ｘｉａｏ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＡＪ１１０２ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｓｕｃｋｌｉｎｇ ｐｉｇｌｅｔ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｄｉａｒｒｈｅａ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｊ Ｖｉｒ— ｏｌ，２０１２，８６（１９）：１０９１０～１０９１１． ［１６３ Ｆａｎ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｙｅ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２０１２，８６（１８）：１０２４８～１０２４９． ［１７３Ｌｕｏ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｄｅｎｇ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｐｒｅｖａｌｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２０１２，８６ （１７）：９５５１． ［１ ８３ Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｙａｎｇ Ｊ，Ｙｕ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ— ｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒ— ｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ（ＰＥＤＶ）ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｆｉｅｌｄ ｃａｓｅｓ ｉｎ Ｆｕｊｉａｎ． Ｃｈｉｎａ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，２０１２，４５（３）：４９９～５０７． ［１９］Ｌｉ Ｗ，Ｌｉ Ｈ，Ｌｉｕ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｎｅｗ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉ— ｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ，Ｃｈｉｎａ，２０１１ Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２０１２，１８（８）：１３５０４１３５３． （２０３Ｆａｎ Ｊ Ｈ，Ｚｕｏ Ｙ Ｚ，Ｌｉ Ｊ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｍｅｍ— ｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｓｏ— ｌａｔｅｄ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，２０１２，４５（１）：１１３～ｌ１７． ［２１］Ｌｉ Ｚ Ｌ，Ｚｈｕ Ｌ，Ｍａ Ｊ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ— ｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒ— ｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ（ＰＥＤＶ）ｆｉｅｌｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ．Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，２０１２，４５（１）：１８１～１８５．
