动物医学进展，２０１７，３８（１２）：１－５ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 非洲马瘟病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法的建立 姜睿姣 ，邬旭龙 ，张鹏飞 ，王 印 ，杨泽晓 ，姚学萍 （１．四川农业大学动物医学院，四川成都６１１１３０；２．动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川ｉ成都６１１１３０） 摘 要：为了建立非洲马瘟病毒（ＡＨＳＶ）环介导等温扩增（１ｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ＬＡＭＰ）快速检测方法，基于ＡＨＳＶ ＶＰ７基因保守序列，设计２对特异性扩增引物。通过对反应体系中各组 分浓度，反应温度及时间的优化，建立了快速、灵敏的ＡＨＳＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法，并对该方法特异性、灵敏 度、重复性进行探索。结果表明，在６３℃恒温下反应４５ ｍｉｎ，便可进行高效率的特异性扩增。反应产物经琼 脂糖凝胶电泳和染料可视化鉴定，能够快速有效检测ＡＨＳＶ。用建立的方法检测马属动物易感的４种疫病 病原，结果均为阴性，证实具有较高的特异性。灵敏度是ＲＴ—ＰＣＲ的１ ０００倍。建立了ＡＨＳＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ 检测方法，具有快速、特异、灵敏、操作简单、设备要求低的特点，适合用于现场ＡＨｓＶ快速检测。 关键词：非洲马瘟病毒；环介导等温扩增；检测 中图分类号：￥８５２．６５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７－５０３８（２０１７）１２—０００１－０５ 非洲马瘟（Ａｆｒｉｃａｎ ｈｏｒｓｅ ｓｉｃｋｎｅｓｓ，ＡＨＳ）是由 非洲马瘟病毒（Ａｆｒｉｃａｎ ｈｏｒｓｅ ｓｉｃｋｎｅｓｓ ｖｉｒｕｓ， ＡＨＳＶ）引起马属动物的一种急性或亚急性的虫媒 内实现１０。倍～１Ｏ如倍的扩增，白色产物焦磷酸酶沉 淀可通过肉眼观察到，除此以外，还能用荧光染色剂 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染色观察。ＬＡＭＰ不需要复杂的仪 传染病［１ ］。其主要病理特征有发热、皮下组织水 肿、肺水肿、脏器出血等。所有马属动物中，马对此 病最易感，病死率可高达９Ｏ 。ＡＨＳ被世界动物卫 生组织（ＯＩＥ）列为法定报告的动物疫病，我国将其 列为一类动物疫病。ＡＨＳ主要流行于非洲撒哈拉 沙漠以南地区，在欧洲、中东的部分国家和地区偶有 发生 引。 器设备，仅依靠２对～３对特异引物和一种链置换 ＤＮＡ聚合酶（Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ），在恒温下短时 间内便能高效、快捷、特异扩增靶序列。目前， ＬＡＭＰ方法已经广泛应用于病原体的检测，如猪细 小病毒口 。本研究建立了一种检测非洲马瘟病毒 的ＲＴ—ＬＡＭＰ方法。 目前中国虽无非洲马瘟的发生，但随着各国贸 易往来变频繁、气候改变，加之此病通过蚊虫传播， ＡＨＳＶ属呼肠病毒科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）环状病毒属 （Ｏｒｂｉｖｉｒｕ），现已知有９种血清型，不同型病毒的毒 力强弱不相同，各型之间具有交互免疫关系，如５型 并不能完全保证ＡＨＳ不会传人进中国。因此，建立 一种快速、灵敏、特异的检测方法，有助于现场立即 与８型、６型与９型＿３ ］。该病毒无囊膜，直径约７５ ｎｍ，基因组由１Ｏ个大小不等的双链ＲＮＡ片段构 成，共编码７种结构蛋白（ＶＰ１—７）和４种非结构蛋白 （ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ３Ａ）。其中ＶＰ７在ＡＳＨＶ各 检测出本病或排除本病，尽可能减小损失。 １材料与方法 １．１ 材料 马传染性贫血病毒（Ｅｑｕｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ，ＥＩＡＶ）、日本脑炎病毒（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＪＥＶ）、链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、狂犬病病毒 （Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ＲＶ）由四川农业大学动物检疫实验 血清中高度保守，是该病毒的血清群特异性抗原＿５］。 日本学者Ｎｏｔｏｍｉ Ｔ等［６］发明了环介导等温扩 增法（１ｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ＬＡＭＰ）。目前，ＲＴ—ＬＡＭＰ技术也广泛用于ＲＮＡ 室提供。利用ＤＮＡ／ＲＮＡ提取试剂盒提取病毒 ＤＮＡ／ＲＮＡ，ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，置一８Ｏ℃保存 病毒的检测，如ＳＡＲＳ冠状病毒、口蹄疫病毒Ｄ－ｎ］。 与传统ＰＣＲ相比，该技术通常可在１５ｍｉｎ￣６０ｍｉｎ 备用。 收稿日期：２０１７—０３—２８ 基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（２Ｏ１３ＢＡＤｌ２８Ｏ４） 作者简介：姜睿姣（１９９６一），女，四川雅安人，本科生，主要从事动物传染病病原微生物及其分子生物学研究。＊通讯作者 ２ 动物医学进展２０１７年第３８卷第１２期（总第２９４期） １．２ 主要试剂 和６５ ｂｐ。２０ 反应体系中含 ０ＲＶ １０ Ｕ，Ｒ Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶、Ｍｇ。 购于Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ一 １ａｂｓ（ＮＥＢ）；ｄＮＴＰ、２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＲＮＡ ＬＡＭＰ产物５ Ｌ，１０×缓冲液２ Ｌ，３７℃反应４ ｈ，取 ８ Ｌ的酶切产物在２０ ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶中电泳鉴定。 １．３．５ ＲＴ—ＰＣＲ检测 利用外引物Ｆ３、Ｂ３进行 ＡＨＳＶ ＲＴ—ＰＣＲ扩增，反应体系为２５ Ｌ：２×Ｔａｑ 反转录试剂盒、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２ ０００购于宝生物 工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒、ＤＮＡ／ＲＮＡ 提取试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公 司；其他试剂均为国产分析纯产品。 １．３ 方法 １．３．１ ＤＮＡ的制备 在ＮＣＢＩ中获取ＡＨＳＶ ＶＰ７ 基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＴ０３０５６６．１），通过ＤＮＡＳｔａｒ 软件比对分析，人工合成ＡＨＳＶ ＶＰ７保守基因序 列。将载有目的基因质粒的菌株纯培养后，利用质 粒提取试剂盒提取目的基因质粒作为模板，送至华 大公司测序鉴定后，置一８０￣Ｃ保存备用。 １．３．２ 引物设计 根据ＧｅｎＢａｎｋ公布的ＡＨＳＶ ＶＰ７保守基因序列，利用在线软件Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５，设计并筛选出２对引物（包括２条外引物Ｆ３、 Ｂ３，２条内引物ＦＩＰ、ＢＩＰ）。引物序列见表１，由擎科 生物公司合成。 表１引物序列 Ｔａｂｌｅ １ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｏ１ｉｇ０ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｐｒｉｍｅｒｓ ＡＨＳＶ Ｆ３ ＧＴＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＧＧＧＡＧＣ １８ ＡＨＳＶ Ｂ３ ＴＣＣＡＴＧＣＡＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＴ ２Ｏ ＡＨＳＶ 会 ４２ ＡＨＳＶ 会 代Ｔ 。 ｌＩ３．３ ＡＨＳＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ反应优化 ＡＨＳＶ ＲＴ— ＬＡＭＰ的反应体系为２５ Ｌ，依次对ｄＮＴＰ浓度、 Ｍｇ抖浓度、甜菜碱浓度、引物浓度及温度进行优化。 具体梯度如下：ｄＮＴＰ终浓度为０．８、１、１．２、１．４、１．６、 １．８ ｍｍｏｌ／Ｌ；Ｍｇ 终浓度分别为２、４、６、８、１Ｏ ｍｍｏｌ／Ｌ；甜菜碱终浓度分别为０、０．５、１、１．５、２ ｔｏｏｌ／ Ｌ；内引物终浓度分别为０．８、１．２、１．６、２．０、２．４、２．８、 ３．２ ｔｌｍｏｌ／Ｌ；外引物终浓度分别为０．１、０．２、Ｏ．３、Ｏ．４、 ０．５、０．６、０．７ ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ，１０×Ｂｓｔ ｂｕｆｆｅｒ ２．５“Ｌ，Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶８ Ｕ，模板２ Ｌ，反应温度优化分别为 ６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃，反应时间优化分别为 ３０、４５、６０、７５、９０ ｒａｉｎ。所有体系恒温反应后，８Ｏ℃ 加热２ ｒａｉｎ终止反应。取５ Ｌ反应产物于２０ ｇ／ｉ 琼脂糖凝胶电泳鉴定，以确定最佳的反应体系。添 加ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染料，并在紫外灯下观察。 １．３．４ ＲＴ—ＬＡＭＰ产物酶切鉴定 用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５软件分析目的片段的酶切位点，并筛选出 具有单一位点的酶ＥｃｏＲＶ，预计酶切产物为１６３ ｂｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２．５ Ｌ，Ｆ３、Ｂ３各１ Ｌ，模板 ２ Ｌ，ｄｄＨ２０ ８．５ Ｌ。按如下程序进行：９４℃３ ａｒｉｎ；９４℃１５ Ｓ、５５℃３０ ｓ、７２℃３０ Ｓ共３４个循环； ７２℃５ ｒａｉｎ。取５肚Ｌ反应产物于２０ ｇ／Ｌ琼脂糖凝 胶电泳后，将产物送至华大基因测序鉴定。 １．３．６ ＲＴ—ＬＡＭＰ灵敏度检测 利用Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ ２ ０００核酸蛋白分析仪对ＡＨＳＶ重组质粒进行定量 测定，根据核酸浓度计算质粒拷贝数ｌ＿ｌ 。将ＡＨＳＶ 重组质粒进行１Ｏ倍梯度稀释，利用的ＡＨＳＶ ＲＴ— ＬＡＭＰ和ＲＴ—ＰＣＲ检测方法，分别对１×１０。ｃｏｐｉｅｓ／ Ｌ～１ ｃｏｐｉｅｓ／￣ｔＬ的ＤＮＡ进行试验，对比两者检测 灵敏度。 １．４ ＲＴ—ＬＡＭＰ特异性和重复性试验 根据建立的ＡＨｓＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法，分别 对ＡＨＳＶ、ＥＩＡＶ、ＪＥＶ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＲＶ进行特异 性试验。扩增产物经２Ｏ ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳鉴定。 以ＡＨＳＶ阳性质粒为模板，３次不同时间进行反 应，同时设立３次重复，对建立的ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方 法进行重复性探索及检测。 ２ 结果 ２．１ ＡＨＳＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ方法的建立 经过对ＡＨＳＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ反应体系和条件的 优化，最终反应体系为２５ Ｌ：外引物Ｆ３、Ｂ３各０．２ ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ；内引物ＦＩＰ、ＢＩＰ各１．６ ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ；Ｍｇ抖６ ｍｍｏｌ／Ｌ；甜菜碱１ ｍｏｌ／Ｌ；ｄＮＴＰ混合液１．２ ｍｍｏｌ／ Ｌ；１０×Ｂｓｔ ｂｕｆｆｅｒ ２．５ Ｌ；Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶８ Ｕ；模 板２ Ｌ；ｄｄＨ。０补足２５ Ｌ。反应在６３℃恒温反应 ４５ ｍｉｎ后，８Ｏ℃灭活２ ｍｉｎ。产物经２Ｏ ｇ／Ｌ琼脂糖 凝胶电泳分析，可见清晰的阶梯状条带。在体系反 应结束后添加ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ工荧光染料，在紫外灯 照下，阴性反应管呈橘红色，而阳性反应管散发绿色 荧光，介于两者之间的反应管有黄绿色荧光（图１）。 ２．２ ＲＴ—ＬＡＭＰ特异性试验 以ＡＨＳＶ质粒作为阳性对照，检测马传染性贫 血病病毒、Ｅｔ本脑炎病毒、链球菌、狂犬病病毒进行 特异性试验，验证所建立ＲＴ—ＬＡＭＰ方法的特异 性。结果表明，只有ＡＨＳＶ呈阳性，其他试验样品 呈阴性（图２）。 ２．３ ＲＴ—ＬＡＭＰ灵敏度检测 将ＡＨＳＶ重组质粒进行１０倍梯度稀释，分别 姜睿蛟等：非洲 ０瘟痫毒Ｒ。１’ １。 ＡＭＰ检测斤法的建立 时１×】０ ） ｆｉ Ｊ ～】ｃｏｐｉ￣、ｓ／ｆ Ｉ 的Ｉ）ＮＡ进行灵 反心产物｝ 样于２０ ｇ／Ｉ 琼脂糖凝胶电泳（ ４），町 敏瞍检测．对比 者榆测灵敏Ｊ监。结果表｝ＪＪｊ． 传统 Ｉ ＿ｒ Ｐ【、Ｒ的检 则卡＾乏限为ｌ×１ ０ ｃｏｐｉｅｓ，『』Ｉ ．ｆ 』Ｈ ＲＴ— Ｉ ＼ＭＰ柃测力 法检测量为１ １０。ｃｏｐｉｅｓ Ｉ ．ＲＴ 以行到一条ｌ ６３ ｌ ｐ和６５ ｈｐ的条带． ｊ 论值相符， 说｝』Ｉ】ＲＴ Ｉ ＡＭＩ 扩增的条０ 是ＡＨＳＶ的ＶＰ７基 ｋ 。以Ｆ３、Ｉ３３为外引物，Ｉ．ＡＭＩ 扩增产物为模板． ：ｎ ｋ Ｉ．ＡＭＰ的 敏俊为传统Ｉ Ｔ—Ｉ ＣＲ的１ ０（７）０倍，Ｒ＇Ｉ、。 进行ＰＣＲ反Ｊ、 ，产：物测序鉴定后。ｆｉ－ＮＣＢＩ ＢＩ ＡｓＴ ＿＿ ｈ “ ｍ Ｉ 【、Ｒ目的扩增条带为２２８ ｂｔ）（ ３）。 进行比对，证实扩增序列为人ＨＳＶ特 性 列。 ４ ５ ２ ０００ ｂｐ—＿．． ７５０ ｂｐ—＋ ５（１０ ｂｐ—＋ ２５０ ｂｐ—＋ ｉｌ）（ＩｈＤ—◆ ．。 白对照；２，未优化的反应体系； ．最优反应体系 ．Ｉ‰ｎｋ ｃｏｎｔ ｒ ｃ）Ｉ；：．Ｎｏｔ ｏｐｔｉｍｉｚｔ （１ ｒｃ￣ｔｆ’ｔｉ ｃ）１１ ｓｙｓｔｅｍ；：｛．Ｔ¨ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅ ＇Ｍ．Ｉ）ＮＡ标准Ｉ）１ ！（１（ＩＯ：１～５．依次为 ＩｌＳＶ、Ｅ１／＼ｔ 、Ｉ Ｖ、 ，， ｅｐｌｔ“ｏ ｃＩｌｏｎ ｓｖ５ｔ ｒｉ１ 、ＲＶ样本；６．ｆ５』＂｝－埘照 图１ ＳＹＢＲ【；ｒｃ Ｌ ＩＩ Ｉ染色结果 Ｍ．Ｉ） Ｉ、Ｍａ ｒｋｅ ｒ Ｉ）Ｉ ０００；】＿５．Ｓｉｍｐｈ Ｏｆ ＡＨＳ＼ ．１ ＩＡＶ．Ｊ｝ Ｖ，Ｓｔｒｅ ．Ｉ ｔ’（】ｌ（ｍｉｌｉｏｌ１ ＦＣＳｔｌ１ｔ （１ｆ Ｙ１｛Ｉ （；ｒｃ。ｔ １１ ＯＵ｛ＩＣ１ｉＳ．Ｉ：ｔＶ ｒｔ ｓ１） ｔｉ、ｒｔ”ｔ ｒ；６．｝｛１…１ｋ（’（１１ｌｌ Ｙ Ｃ）ｌ ２．１ Ｒ－ｒ Ｉ ＡＭＰ产物酶切鉴定 图２ Ｒ 。１ Ｉ’ ＡＭｆ 特异性检测 ＲＴ Ｉ ＡＭＩ 反应产物经Ｉ ）ＲＶ嗨切后．取５ ＩＬｌ ｌ ｉｇ．！Ｇｐｅｃｉｆｉｃｉｔ、ｒ １ｔ：ｓｌ ｆｏ ｒ ＲＴ Ｉ．．、ＭＩ Ｍ Ｉ ２ ３ ４ ５ ６ ７ Ｍ ８ ９ １０ １ １ ｌ ２ １ ３ ｌ４ ２ ０《｝（）ｂＰ Ｉ（…（】ｂｐ— ００ ｂｐ ２５（１ ｂｐ—— ＼１＿１）Ｎ．、标准Ｉ１）１ ！ ｊ ｉｑ－对照 Ｍ．Ｉ） Ａ Ｍ￡ｌｒｋ，、ｒ １） ＳＩ）ｅＣ１１ＶＬ＇ｌＶ；７．１ Ｉ． 图３灵敏度检测 Ｆｉｇ．｛ ｔ ｎｓｉｌｉ ｘ ｉｔ、 Ｉｅｓｔ ：｛ 讨论 ２ ００１）ｂＰ— ＡＨｓ作为・种高致病 的虫媒传染病．能引起 ｌ ｌ】（）¨ｂＤ—● 与属动物皮下组织水肿、肺水 、内脏ｆ 札等症状。 …Ｆ ＡＨＳ发痫迅速。病死牢儆商．我 将ｊ 列为一 （川ｂＤ 类动物疫病。符 贸易往米越发频繁、进…【¨ｊ马 越多．此病的传播就会越发迅速。闪此。 …｛ 现在虽 ．． １ ６３ ｂＰ 术发生木病． 建立・种离效、迅速检洲方法的储 ．．一６５ ｂｐ 备．有利于及时俭测此病病 ，将该痫 ｒ：罔门 Ｍ．Ｉ） Ａ怀准１）１，２（）ｆ）１）：１．Ｐ，Ｉ、Ｉ ＡＭＩ 脚切产物 之外。 Ｍ Ｉ） 、Ｍａ ｒｋ【 ｒ Ｉ）１ ！（）ｆ）（）：Ｉ．Ｉ｛１’Ｉ．１、，Ｍｒ ｐｒｏ ＲＴ Ｉ ＡＭＰ足一种新型的核酸等温扩增方法。 ｊ－Ｊ】Ｒ、 此方法相比较ｒ Ｒｒｒ Ｉ ＣＲ 多优点。 ‘允．ＲＴ 目 ＲＴ Ｉ一、ＭＰ产物酶切鉴定 Ｉ．ＡＭＰ的扩增效率极离． 的ｌ５ｌｌｌｉｎ～６０ ｎｌｉｎ （］ｆ ＲＴ Ｉ，．＼Ｍｌ’…（）ｔ｛ＵＣＩ ｄｉｒｔｔ ｆ（－（ｉ ｗｉＩｈ Ｆ（“Ｒ、 ４ 动物医学进展２０１７年第３８卷第１２期（总第２９４期） 内，就能将目的片段扩增１Ｏ。～１Ｏ¨倍，极大程度节 省了检测的时间，对于现场及时检测具有重大的意 义。其次，ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法的灵敏度高，特异性 强。就本研究而言，ＲＴ—ＬＡＭＰ的灵敏度是传统 ＲＴ—ＰＣＲ的１ ０００倍；１对外引物和１对内引物保证 了扩增时的高特异性。使得检测的结果更加清晰、 准确。再者，结果的检测简单，可通过肉眼观察是否 有白色的焦磷酸镁产生，亦或加入ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 染料观察是否有荧光绿，便判断是否有产物生成，且 全程无需复杂的设备。因而，此技术已用于人、动 物、植物的多种病原体检测检测，具有很高的实用价 值。由于ＲＴ—ＬＡＭＰ的灵敏度极高，一旦开盖容易 形成气溶胶污染，加之实验室并无严格分区，假阳性 的情况发生较频繁。所以在操作时应谨慎，切忌把 反应后的反应管打开。 本研究发现，针对本套引物，在整个反应体系内 Ｍｇ。 浓度为６ ｍｍｏｌ／Ｌ反应条带最佳，与大多文献 报道最佳Ｍｇ 浓度为８ ｍｍｏｌ／Ｌ不一致＿７ 。 内、外引物浓度比值比引物的绝对浓度更重要，本研 究浓度比值为８：１时，扩增的效率最高。这与以往 文献报道的一般选取４：１或８：１的内、外引物比 值有高扩增效率一致。一般情况下，ＲＴ—ＬＡＭＰ在 １５ ｍｉｎｔ６０ ｍｉｎ之内、６ｌ℃～６５℃之间能观察到明 显的条带。本研究在４５ ｍｉｎ之后才能观察到条带， 反应温度以６３℃最佳。由此可见，对于不同的引物 和模板，反应体系各组分的最佳浓度、反应最短时间 以及最适温度也会随之改变。因此，优化一个反应 体系，对于建立某种病毒最理想的检测方法是必不 可少的。 参考文献： Ｅｌｉ ＯＩＥ．Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ ａｎｉ— ｍａｌｓ［Ｍ］．２００８：８２３—８２８． ｒ２］ Ｍｅｉｓｗｉｎｋｅ１ Ｒ，Ｐａｗｅｓｋａ Ｔ Ｔ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｎｅｗ ｆｉｅｌｄ Ｃ ｌｉ一 ｃｏｉｄｅｓ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ Ａｆｒｉｃａｎ ｈｏｒｓｅ ｓｉｃｋｎｅｓｓ ｉｎ Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ［Ｊ］．Ｐｒｅｙ Ｖｅｔ Ｍｅｄ，２００３，６０（３）：２４３—２５３． ［３］ 张海明，段晓冬，相文华，等．非洲马瘟诊断技术研究概况［Ｊ］． 动物医学进展，２Ｏ１３，３４（６）：ｌ７５—１７８． ［４］ 曾昭文，花群义，段 纲．非洲马瘟病毒分子生物学研究进展 ［Ｊ］．动物医学进展，２００６，２７（１０）：卜６． ［５］ Ｍａｒｅｅ Ｓ，Ｐａｗｅｓｋａ Ｊ Ｔ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｆｒｉｃａｎ ｈｏｒｓｅ ｓｉｃｋｎｅｓｓ ｖｉｒｕｓ ＶＰ７ ａｎｔｉｇｅｎ ｖｉａ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｖａｌｉ— ｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＶＰ７—－ｂａｓｅｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｕｐ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒａ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ， ２００５，１２５（１）：５５－６５． ［６］ Ｎｏｔｏｍｉ Ｔ，Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉ ｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０００。 ２８（１２）：Ｅ６３． ［７］李健，陈沁，熊炜，等．口蹄疫病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法 的建立［Ｊ］．病毒学报，２００９，２５（２）：１３７—１４２． ［８］秦智锋，曾少灵，阮周曦，等．口蹄疫病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法 的建立［Ｊ］．中国预防兽医学报，２００８，３０（５）：３７５—３７８． ［９］吴绍强，孙晓智，林祥梅，等．亚洲Ｉ型口蹄疫病毒环介导等温 扩增（ＬＡＭＰ）检测方法的建立［Ｊ］．检验检疫科学，２００８，１８ （１）：９－１２． ［１Ｏ］Ｐａｒｉｄａ Ｍ，Ｈｏｒｉｏｋｅ Ｋ，Ｉｓｈｉｄａ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆ— ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ——ｌｏｏｐ－・ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ［Ｊ］－Ｊ Ｃｌｉｎｉ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，４３（６）：２８９５—２９０３． ［１１］Ｐａｒｉｄａ Ｍ Ｍ．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｅ— ｍｅｒｇｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２００８，３３（４）：６１７－６２８． ［１２］刘业兵，张磊，宁宜宝，等．猪细小病毒ＬＡＭＰ检测方法的 建立口］．中国农业科学，２０１０，４３（１４）：３０１２－３Ｏ１８． ［１３］Ｘｉｅ Ｚ，Ｌｎｏ Ｓ，Ｘｉｅ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｎｉｎｅ ａｖｉａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ＧｅＸＰ ａｎａｌｙｚｅｒ—ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｓｓａｙ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ，２０１４，２０７（１０）：１８８． ［１４］ 蔡树东，成大荣，朱善元，等．大肠埃希菌ＥＴＴ２毒力岛 ＥＣｓ３７０３基因和ＨＰＩ毒力岛ｉｒｐ２基因双重Ｉ ＡＭＰ检测方法 的建立［Ｊ］．动物医学进展，２０ｉ７，３８（１）：１—５． ［１５］Ｓｕａｒｅｚ Ｐ，Ｚａｒｄｏｙａ Ｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｍ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎ— ｓｈｉｐｓ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａ— ｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＲＳＶ）ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ＯＲＦ一５ ａｎｄ ＯＲＦ一７ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ，１９９６，４２ （１－２）：１５９－１６５． ［１６］ 江彦增，朱鸿飞．非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法 的建立．中国畜牧兽医，２００９，３６（２）：７２—７４． ［１７］马艳平，刘振兴，郝乐，等．环介导等温扩增技术的研究进展 ［Ｊ］．河北科技师范学院学报，２０１１，２５（１）：７７—８０． ［１８］黄火清，郁 昂．环介导等温扩增技术的研究进展［Ｊ］．生物技 术，２０１２，２２（３）：９０—９４． ［１９］史亚东，赵子方，朱丹，等．Ｉ ＡＭＰ（环介导等温扩增）的原理 及在寄生虫检测上的应用［Ｊ］．中国人兽共患病学报，２０１１，２７ （１０）：９３５－９３９． ［２０］ 田桢干，阎俊，陆哗，等．ＬＡＭＰ技术快速检测沙门氏菌方 法的建立及其应用［Ｊ］．中国国境卫生检疫杂志，２０１１，３４（５）： ２９６－２９９． ［２１］ 王韦华，刘桂梅．环介导等温扩增技术在畜牧兽医中的应用研 究［Ｊ］．甘肃畜牧兽医，２Ｏ１６，４６（１３）：１１一ｌ２． ［２２］卞璐，张旭．环介导等温扩增技术及其在食品检测中的应 用［Ｊ］．现代食品，２０１６，１０（６）；４３—４６． ［２３］贾雅菁，付博宇，王羽，等．实时荧光环介导等温扩增技术检 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基金项目：国家科技支撑计划项目（２Ｏ１５ＢＡ１０７ＢＯ２）子课题（２Ｏ１５ＢＡ１Ｏ７ＢＯ２—０７） 作者简介：徐娜（１９９２一），女，内蒙古鸟兰察布人，硕士研究生，主要从事动物传染病学研究。＊通讯作者 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ ＲＴ－ＬＡＭＰ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｆｒｉｃａｎ Ｈｏｒｓｅ Ｓｉｃｋｎｅｓｓ Ｖｉｒｕｓ ＪＩＡＮＧ Ｒｕｉ－ｊｉａｏ ，ＷＵ Ｘｕ—ｌｏｎｇ ，ＺＨＡＮＧ Ｐｅｎｇ—ｆｅｉ ，ＷＡＮＧ Ｙｉｎ ，ＹＡＮＧ Ｚｅ—ｘｉａｏ ，ＹＡＯ Ｘｕｅ—ｐｉｎｇ ， （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ，６１１１３Ｏ，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ，６１１１３０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｏｎｅ—ｓｔｅｐ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ— ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａ１ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ—ＬＡＭＰ）ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ａｆｒｉｃａｎ ｈｏｒｓｅ ｓｉｃｋｎｅｓｓ ｖｉｒｕｓ（ＡＨＳＶ）． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＡＨＳＶ ＶＰ７ ｇｅｎｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｏｐｔｉｍａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｉｍｅ ａｎｄ ａｌｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＨＳＶ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＬＡＭＰ ｍａｎｉｆｅｓｔｅｄ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉ— ｃｉｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＡＨＳＶ ｖｉｒａｌ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｐｌａｃｅｄ ｉｎ ６３℃ｆｏｒ ４５ｍｉｎ．Ｒｅ— ａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｑｕｉｃｋｌｙ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｙｅ ｖｉｓｕａｌ ｉｄｅｎ— ｔｉｆｉｅａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｏｔｈｅｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ．Ｉｔ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｗｈａｔ’Ｓ ｍｏｒｅ。ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｗａｓ １ ０ ｃｏｐｉｅｓ／ ｕＬ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ａ １０一ｆｏｌｄ ｇｒｅａｔｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｎ ＲＴ～ＰＣＲ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ＲＴ—ＬＡＭＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｆｒｉｃａｎ ｈｏｒｓｅ ｓｉｃｋｎｅｓｓ ｖｉｒｕｓ；ＲＴ—ＬＡＭＰ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
